細(xì)胞工程和胚胎工程課件

第二章細(xì)胞工程----細(xì)胞克隆一、克隆的概念

即無性繁殖系。指不經(jīng)過兩個(gè)分子、兩個(gè)細(xì)胞或兩個(gè)個(gè)體的結(jié)合，只由一個(gè)模板分子、母細(xì)胞或母體直接形成新的分子、細(xì)胞或個(gè)體的過程。

在分子水平：基因的克?。◤?fù)制）在細(xì)胞水平：雜交瘤的制備和單克隆抗體技術(shù)在個(gè)體水平：無性生殖。如：植物的營(yíng)養(yǎng)繁殖，動(dòng)物“克隆羊---多莉”的培育等無性生殖與有性生殖的區(qū)別

無性生殖：不經(jīng)過生殖細(xì)胞的結(jié)合，直接由母體產(chǎn)生下一代新個(gè)體的繁殖過程。特點(diǎn)是子代保留了親代的遺傳物質(zhì)，性狀基本相同。

有性生殖：經(jīng)過生殖細(xì)胞的兩兩結(jié)合，形成合子，再由合子發(fā)育成新個(gè)體的繁殖過程。特點(diǎn)是后代繼承了雙親的遺傳物質(zhì)，具有更強(qiáng)的生活能力和變異性，對(duì)生物的生存和進(jìn)化具有重要意義離體器官、組織或細(xì)胞脫分化愈傷組織芽、根再分化植物體實(shí)例（組織培養(yǎng)非洲紫羅蘭）

外植體：離體的組織、細(xì)胞或器官。愈傷組織：一群高度液態(tài)化的原始的薄壁細(xì)胞。脫分化：分化的細(xì)胞（組織或器官）經(jīng)過處理形成愈傷組織的過程。再分化：由愈傷組織經(jīng)過處理再重新分化出不同的組織（細(xì)胞或器官）。概念：細(xì)胞的全能性是指生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個(gè)體的潛能。原因：是生物體的每一個(gè)細(xì)胞都含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)及發(fā)育為完整個(gè)體所必需的全部基因。幾乎所有的植物細(xì)胞都具有全能性人工誘導(dǎo)與兩種激素的關(guān)系——在植物組織培養(yǎng)過程中，細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的比例對(duì)愈傷組織的形成，以及叢芽和根的分化影響極大——人工誘導(dǎo)過程的激素應(yīng)用如下：應(yīng)用：（1）快速繁殖（2）培養(yǎng)無病毒感染植株（3）獲取細(xì)胞代謝產(chǎn)物（愈傷組織階段）（4）生產(chǎn)人工種子（胚狀體階段）（5）可用于培育優(yōu)良植物品種（轉(zhuǎn)基因植物、單倍體育種和雜種植物）

2.植物組織培養(yǎng)形成的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，又可以分化形成根、芽等器官，這一過程稱為：()

A、脫分化B、去分化C、再分化D、脫分化或去分化3.下列不能作為植物組織培養(yǎng)的材料是：()A、秋海棠的葉B、馬鈴薯的塊莖C、成熟的花粉D、木質(zhì)部中的導(dǎo)管細(xì)胞CD2.植物體細(xì)胞雜交過程：去細(xì)胞壁酶解法（纖維素酶、果膠酶）原生質(zhì)體物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)（振蕩、離心和電刺激，聚乙二醇）融合的原生質(zhì)體雜種細(xì)胞產(chǎn)生新的細(xì)胞壁雜種植物植物的組織培養(yǎng)理論基礎(chǔ)：

細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞的全能性成功實(shí)例：

白菜和甘藍(lán)、煙草和海島煙草、胡蘿卜和羊角芹等研究意義：克服遠(yuǎn)源雜交不親和的障礙，增大了親本組合范圍，培育了作物的新品種。白菜---甘藍(lán)（二）動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞融合核移植單克隆抗體技術(shù)胚胎工程動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程

幼齡動(dòng)物取動(dòng)物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)原代培養(yǎng)：

從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。細(xì)胞株：原代細(xì)胞一般傳至10代左右細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，少數(shù)細(xì)胞存活到40~50代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞株。細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。

細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別：

細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)已改變動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用：1.利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可生產(chǎn)疫苗、干擾素、單克隆抗體。2.用于檢測(cè)有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性。3.臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用：皮膚的移植、器官移植等動(dòng)物組織培養(yǎng)胚胎或幼齡動(dòng)物的臟器單個(gè)細(xì)胞機(jī)械消化、胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)培養(yǎng)液葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、動(dòng)物血清等傳代培養(yǎng)藥物研究治療癌癥的藥物及其療效某物質(zhì)檢測(cè)有毒物質(zhì)、致癌物質(zhì)等細(xì)胞株或細(xì)胞系②制備檢測(cè)細(xì)胞ⅰ配置細(xì)胞懸浮液:

ⅱ將細(xì)胞懸浮液分裝到兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間.③

配置培養(yǎng)液:取兩個(gè)培養(yǎng)瓶,分別編號(hào)1、2，

將上述組織用剪刀剪碎，再用胰蛋白酶使其分散成單個(gè)細(xì)胞，然后利用培養(yǎng)液配置成一定濃度的細(xì)胞懸浮液分別往其中加入等量的配置好的培養(yǎng)液，再往1號(hào)瓶中滴加幾滴0.09%的“三氯生”試劑，搖勻④將上述某一個(gè)培養(yǎng)狀況較好的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液分成兩份，分別加入1、2號(hào)培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)一段時(shí)間。⑤檢測(cè)過程：分別從1、2號(hào)培養(yǎng)瓶中取樣做多次鏡檢，計(jì)算出變異細(xì)胞占觀察培養(yǎng)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。⑥預(yù)期結(jié)果和結(jié)論：a:若1號(hào)和2號(hào)培養(yǎng)瓶中變異細(xì)胞的百分比相當(dāng)，則說明“三氯生”對(duì)人體無害。b:若1號(hào)培養(yǎng)瓶中變異細(xì)胞百分?jǐn)?shù)大于2號(hào)，則說明“三氯生”對(duì)人體有害。獲得細(xì)胞細(xì)胞的全能性細(xì)胞株、細(xì)胞系植物體培養(yǎng)結(jié)果或細(xì)胞分泌蛋白快速繁殖、培育無病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動(dòng)物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細(xì)胞增殖原理動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較2.動(dòng)物的細(xì)胞融合細(xì)胞融合是將不同種類的兩種細(xì)胞經(jīng)過特殊處理后放在一起，在某些促融因子作用下發(fā)生融合，形成雜種細(xì)胞。細(xì)胞融合與細(xì)胞雜交——細(xì)胞融合是指由兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象——基因型不同的細(xì)胞融合稱為細(xì)胞雜交——細(xì)胞融合是研究細(xì)胞之間遺傳信息轉(zhuǎn)移、染色體基因定位，以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。誘導(dǎo)細(xì)胞融合的技術(shù)手段——滅活的仙臺(tái)病毒、聚乙二醇等介導(dǎo)——低壓交流電場(chǎng)中擊穿細(xì)胞膜脂雙層

病毒顆粒黏附細(xì)胞表面病毒顆粒穿通細(xì)胞膜細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合的原理：利用:細(xì)胞膜的流動(dòng)性植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞融合的方法去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法電刺激化學(xué)（聚乙二醇）電融合、PEG、滅活的仙臺(tái)病毒用途獲得雜種植株制備單克隆抗體3.單克隆抗體技術(shù)：

抗體：來源、化學(xué)性質(zhì)、作用傳統(tǒng)獲取抗體的方法：傳統(tǒng)方法獲取抗體，產(chǎn)量低，而且抗體的特異性差，純度低，反應(yīng)不夠靈敏。某種抗原注射到動(dòng)物體內(nèi)（需要反復(fù)注射）動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體從動(dòng)物的血清中分離出所需要的抗體科學(xué)家分析、探索過程：1.體內(nèi)B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生多達(dá)百萬種以上的特異性抗體；2.每一個(gè)淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體3.臨床醫(yī)學(xué)目的：獲得大量的單一抗體理論方法：

用單個(gè)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，也就是通過克隆，形成細(xì)胞群，由該細(xì)胞群就能產(chǎn)生出單克隆抗體（化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體）

遇到的難題：體外培養(yǎng)時(shí)，一個(gè)B淋巴細(xì)胞不可能無限繁殖，無法得到大細(xì)胞群解決的辦法：雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體單克隆抗體——是指通過克隆，形成遺傳物質(zhì)完全相同的細(xì)胞群，由該細(xì)胞群產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性、靈敏度高的抗體。設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案：——將某抗原注入小鼠體內(nèi)，從其脾臟獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞；——用仙臺(tái)病毒或聚乙二醇誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合；——在選擇性培養(yǎng)基中對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，從雜交瘤細(xì)胞中挑選產(chǎn)生某種抗體的細(xì)胞；——將選擇細(xì)胞進(jìn)行規(guī)模培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖；——從細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中提取大量的單克隆抗體。

單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體單克隆抗體的特點(diǎn)特異性高、靈敏度高、可以大量制備等優(yōu)越性。單克隆抗體的應(yīng)用——用同位素標(biāo)記的單克隆抗體，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病——實(shí)驗(yàn)在單克隆抗體上連接抗癌藥物，制成“生物導(dǎo)彈”，定向地將藥物帶到癌細(xì)胞，消除癌細(xì)胞但不傷害健康細(xì)胞。練習(xí)：

下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計(jì)的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌的實(shí)驗(yàn)方案2、該方案能達(dá)到預(yù)期效果嗎？為什么？4、圖中B為________過程，常用_________作為誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞繼承___________的遺傳特性，既能__________,又能___________。1、該實(shí)驗(yàn)方案的目的是__________3、A是從小鼠的脾臟中取得_______,該細(xì)胞能夠產(chǎn)生______制備單克隆抗體效應(yīng)B細(xì)胞抗體細(xì)胞融合滅活病毒雙親細(xì)胞分泌抗體無限增殖B體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞足夠數(shù)量的細(xì)胞群注射到小鼠腹腔AC1.動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)是：（）

A．動(dòng)物細(xì)胞融合

B．胚胎移植

C．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

D．核移植Ｃ２．在動(dòng)物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交的比較中，正確的是（）A．結(jié)果是相同的

B．雜種細(xì)胞的形成過程基本相同C．操作過程中酶的作用相同D．誘導(dǎo)融合的手段相同Ｂ３.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是（）①淋巴細(xì)胞②小鼠骨髓瘤細(xì)胞③B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞④小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞⑤雜交瘤細(xì)胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③C4.核移植技術(shù)和動(dòng)物的克隆繁殖卵細(xì)胞去核加供體細(xì)胞核核移植技術(shù)：重組細(xì)胞克隆動(dòng)物

體核移植技術(shù)實(shí)例——童第周教授用極細(xì)的玻璃管從鯽魚未受精卵中吸出細(xì)胞核，再把鯉魚囊胚細(xì)胞的核移植到去核卵中，組裝成的新細(xì)胞經(jīng)過培育長(zhǎng)成鯉鯽。

——小鼠的核移植——黑斑蛙的核移植——英國(guó)愛丁堡大學(xué)羅斯林研究所的伊恩·威爾莫特和基恩·坎貝爾于1997年2月27日首次用體細(xì)胞克隆培育出“多莉”（Dolly）?！岸嗬颉迸嘤^程是：從一只綿羊體內(nèi)取出未受精卵，用顯微操作技術(shù)去核；取另一只成年綿羊的單個(gè)乳腺細(xì)胞，將其細(xì)胞核注入去核卵細(xì)胞中；待融合細(xì)胞發(fā)育成胚胎后，將其植入第三只綿羊子宮內(nèi)，由它產(chǎn)下的羔羊就是“多莉”。核移植應(yīng)用前景加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群的繁殖增家瀕危物種的存活數(shù)量器官移植轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物反應(yīng)器，產(chǎn)生醫(yī)用蛋白（疾病治療）克隆技術(shù)的社會(huì)倫理問題

禁止生殖性克隆人

不反對(duì)治療性克隆

胚胎工程體外受精（試管嬰兒）和胚胎體外發(fā)育胚胎移植胚胎工程體外受精和胚胎體外發(fā)育-----試管嬰兒的培育過程藥物誘發(fā)排卵取精體外受精著床→取卵胚胎移植↓↓胚胎體外培養(yǎng)（3～5天）監(jiān)測(cè)卵泡↓妊娠胎兒發(fā)育↓“試管內(nèi)”發(fā)育試管嬰兒的研究現(xiàn)狀——第一、二代試管嬰兒的研究，分別針對(duì)女性或男性因素導(dǎo)致的不孕問題——第三代試管嬰兒的研究主要是解決優(yōu)生優(yōu)育，即從多個(gè)受精卵中選擇基因型最佳的進(jìn)行胚胎移植。例如，通過PGD技術(shù)選擇核型46，XX受精卵進(jìn)行胚胎移植，可避免新生男嬰患Y連鎖遺傳病?！壳芭咛ヒ浦渤晒β手挥?0%-40%，通常移植多枚受精卵。這種做法能夠獲得較高成功率，也造成了多胎懷孕、嬰兒早產(chǎn)、出生時(shí)體重過重或過輕等問題，并可能導(dǎo)致新生兒腦癱胚胎移植1.牛胚胎移植的基本程序——用激素促使供體母牛超級(jí)排卵——選擇良種公牛配種或人工授精——將供體母牛子宮內(nèi)的胚胎沖洗