反義的原理及其應用

反義的原理及其應用第一頁，共十六頁，2022年，8月28日反義RNA反義RNAA(antisenseRNA）：一種本身缺乏編碼能力，但能與特異靶RNA(主要是mRNA)互補的RNA分子，它可通過配對堿基間氫鍵作用與靶RNA的特定互補區(qū)域結合形成雙鏈復合物，抑制靶RNA的功能，從而調控基因的正常表達。第二頁，共十六頁，2022年，8月28日基本原理反義RNA技術的基本原理：利用自然存在的或人工合成的反義RNA，通過基因重組技術反向插入到合適的表達載體形成重組DNA，然后轉染受體細胞，則這一反插入的序列就會隨細胞周期產生大量反義RNA，對基因的表達進行調控，從而抑制、封閉或破壞靶基因的表達。第三頁，共十六頁，2022年，8月28日一、復制水平DNA復制中的作用反義RNA作為DNA復制的抑制因子，與引物RNA結合或作用于引物前體而抑制DNA復制，從而降低DNA的復制效率。E．coli的cole1質粒復制的前提是合成適當的RNA(RNAⅡ)，它自動折疊后與DNA模板結合形成DNA復制的引物，從復制起始點上游一445bp處開始，以另一DNA為模板反向轉錄的RNAI正好與RNA1I的結合，阻止了正常引物的產生，從而干擾復制的進行。第四頁，共十六頁，2022年，8月28日作用機制反義RNA的作用機制主要表現在DNA復制、轉錄和翻譯3個水平上。第五頁，共十六頁，2022年，8月28日二、轉錄水平轉錄及轉錄后水平的作用反義RNA與mRNA5末端互補結合，阻斷帽子結構形成；作用于外顯子和內含子的連接區(qū)，阻礙前mRNA剪接；作用于polyA形成位點，阻礙mRNA的成熟及其向胞漿轉運。在crp基因的ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)負向自我調控中，ticRNA與erpmRNA的5端結合，形成類似于RNA聚合酶識別的轉錄終止信號的二級結構，以反式作用對轉錄過程本身進行調控J第六頁，共十六頁，2022年，8月28日三、翻譯水平翻譯水平的作用反義RNA可直接與mRNA的SD序列(含RBS)或編碼區(qū)(主要是AUG)結合，從空間上直接阻止核糖體的正常結合或可直接降解靶mRNA。反義RNA與mRNA在SD序列配對形成吻觸復合體或在互補區(qū)段結合形成RNA—RNA雙鏈結構，從而調控翻譯的進行。在真核生物細胞中有許多RNA在翻譯水平上表現反義RNA的功能。如雞胚胎肌漿中存在的富含U的小分子RNA稱為tcRNA，它們可以與肌球蛋白重鏈的RNA的polyA尾雜交而抑制正常的翻譯過程。Audrey等J的研究表明FGF—ASRNA在翻譯過程能有效地抑制FGF一2在哺乳動物細胞中的表達。

第七頁，共十六頁，2022年，8月28日反義RNA的重組DNA中只有啟動子及終止子，當轉染細胞后，重組DNA能自動表達反義RNA，并且重組DNA自身可以整合到宿主的基因組DNA中，或作為“附加體”長期存在。在原核細胞中，反義RNA以針對SD序列效果最好，而在真核細胞中以5端非編碼區(qū)為標靶最有效。第八頁，共十六頁，2022年，8月28日反義RNA的應用隨著基因組草圖的完成,人們研究的重點已轉向對基因功能的研究,反義核酸技術無疑為這項宏偉的工程提供了一種有力的工具。第九頁，共十六頁，2022年，8月28日抗病毒作用病毒是對人和動植物危害極大的病原體,然而對病毒引起的疾病的治療,目前尚無特效藥物與方法。反義RNA卻能特異性阻斷病毒基因表達和抑制病毒的復制,從而激起許多科學工作者去探索反義RNA治療病毒性疾病的有效方法?？共《痉戳xRNA技術是將特定的病毒基因反向插人到表達險載體中,以構建反義RNA表達載體,再將重組體導人真核細胞(病毒宿主細胞)中表達特異性反義RNA,從而抑制特異有害基因的表達或抑制病毒復制。文獻報道,運用反義RNA技術己經成功地抑制疤病毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)等對培養(yǎng)的組織細胞的侵襲。用針對植物病毒的反義RNA已培育出具有抗病毒能力的植物。第十頁，共十六頁，2022年，8月28日姚志強等針對不同靶位設計了10段互補反義核酸(DNA片段)，經模型篩選發(fā)現針對S基因起始區(qū)、SP2增強子帽區(qū)和polyA信號編碼區(qū)的asONs作用最強，揭示反調節(jié)基因轉錄/翻譯起始區(qū)的反義核酸具有明顯的抗病毒作用。Gabor等(1998)使用內源性表達抗HIV一1po1．vif和enr基因，以及3LTR序列的反義RNA方案，構建了MuLVLTR啟動子逆轉錄病毒重組質粒，轉錄CD4淋巴細胞系，結果表明反義RNA能高效地穩(wěn)定表達，反義envRNA能夠最有效地抑制HIV一1的復制，并且反義polRNA使P24抗原減少了100—1000倍。另外，國內外在應用反義RNA技術培育抗病(如豬瘟、抗雞馬立克氏病等)動物品系方面也取得比較明顯的進展。第十一頁，共十六頁，2022年，8月28日反義RNA的抗腫瘤作用腫瘤的發(fā)生是多因素引起的,其中細胞癌基因或/和某些病毒癌基因的異常激活和過度表達是導致細胞惡變的原因之一。如何控制細胞有害基因的表達而在基因水平上治療惡性腫瘤呢?在目前基因治療的眾多方案中,反義RNA技術是最具吸引力的手段之一?？梢栽O計出針對腫瘤細胞的癌基因、突變基因、非正常表達基因及某些腫瘤相關病毒的癌基因反義RNA,以阻斷這些有害基因的表達,達到治療腫瘤的目的。許多證據表明,反義RNA可使腫瘤細胞的表型逆轉,形態(tài)變化,增殖速度減慢,生存期縮短,軟瓊脂中克隆能力下降及體內成瘤能力減弱等,而不影響細胞生存所必需的其它基因的表達。第十二頁，共十六頁，2022年，8月28日Trojan等利用EB病毒游離體表達載體克隆胰島素樣生長因子(IGF)反義基因,將此重組體轉染大鼠C6細胞系,在大鼠模型上實現了膠質母細胞瘤的基因治療和預防。我國學者趙曉航等報道互補于Grnyc基因第二外顯子及其兩側序列的反義RNA能特異性誘發(fā)人食管癌細胞程序性死亡。黃賢明等[利用Gets一2、Gmyc和N一ras三個癌基因聯合反義RNA能使人肝癌細胞株SMMC7721生長速率下降約70%,軟瓊脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力顯著下降,提示針對多個癌基因的聯合反義RNA可能給腫瘤基因治療提供新的途徑。第十三頁，共十六頁，2022年，8月28日反義RNA技術還可用于腸道疾病(Rotbarteta1．，1988)、心血管疾病、B一地中海貧血、調節(jié)衰弱心臟中肌細胞的Ca2泵體內平衡u、G蛋白防止高血壓、肝纖維化等多種疾病的研究。第十四頁，共十六頁，2022年，8月28日參考文獻[1]張西鋒，沈偉,潘慶杰,白丁平，耿社民．反義RNA技術原理及其在疾病治療中的應用[J].萊陽農學院學報,2004,21(1)：20,21,22[2].孟博綜述