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胰島素(E.Coli)生產(chǎn)流程
當(dāng)前1頁,總共17頁。
當(dāng)前2頁,總共17頁。人胰島素—碳水化合物代謝和體細(xì)胞供能一級(jí)結(jié)構(gòu):51個(gè)氨基酸雙鏈(A:21,B:30)分子量:5734g/mol等電點(diǎn):5.4胰島素產(chǎn)生受損導(dǎo)致糖尿病當(dāng)前3頁,總共17頁。人胰島素的制備方法人胰腺提取---原料來源有限通過單個(gè)氨基酸化學(xué)合成---生產(chǎn)成本太高豬胰島素轉(zhuǎn)化或“半合成”--成本高,來源少基因工程菌發(fā)酵--雙鏈—Genentech,開發(fā),EliLilly放大--胰島素原(82個(gè)氨基酸,胰島素的前體)--分泌法(Yeast),NovoNordisk產(chǎn)業(yè)化
--細(xì)胞內(nèi)法(E.coli),表達(dá)121+82個(gè)氨基酸的Trp-LE’-Met-proinsulin包涵體,EliLilly產(chǎn)業(yè)化當(dāng)前4頁,總共17頁。E.Coli胰島素原法
轉(zhuǎn)化流程當(dāng)前5頁,總共17頁。市場(chǎng)分析和設(shè)計(jì)基礎(chǔ)(2005)
糖尿病人數(shù):美國(guó)1800萬,全世界億,年增長(zhǎng)率3-4%胰島素年銷售額35-40億美元,由NovoNordisc、EliLilly和SanofiAventis三家壟斷每個(gè)患者每年購(gòu)買胰島素的花費(fèi):$250-750每個(gè)病人每年平均用量:0.5克純胰島素對(duì)億患者,年需求75-100噸純胰島素目前年產(chǎn)量20-30噸純胰島素設(shè)計(jì)年產(chǎn)量:1800kg純胰島素,滿足350萬人年工作330天,每48小時(shí)生產(chǎn)一批次,每年160批次每批次發(fā)酵液體積:37.5立方米,發(fā)酵罐空罐體積:50立方米當(dāng)前6頁,總共17頁。人重組胰島素(E.coli)生產(chǎn)流程發(fā)酵工段初回收工段反應(yīng)工段終純化工段當(dāng)前7頁,總共17頁。當(dāng)前8頁,總共17頁。通氣量:0.5VVM空罐體積:50立方米前接2級(jí)種子罐發(fā)酵周期:18小時(shí)發(fā)酵溫度:37度終菌密度:30克(干重)/升包涵體含量:干重的20%終保溫:10度發(fā)酵工段當(dāng)前9頁,總共17頁。初回收工段—物料溫度保持10度--三個(gè)平行的碟片式離心機(jī)收獲菌體--菌液從37000L濃縮到9165L菌泥--菌體收率98%加與菌泥等體積的緩沖液(96.4%w/wWFI注射用水,0.7%EDTA,和2.9%TRIS-base)稀釋,有利于菌體碎片與包涵體分離三次高壓勻漿機(jī)破菌釋放包涵體壓降800bar終物料體積:1400L用前面的碟片式離心機(jī)回收包涵體收率98%加2倍體積的清洗劑(0.66%Triton-X100),洗滌包涵體當(dāng)前10頁,總共17頁。反應(yīng)工段—溶解包涵體玻璃反應(yīng)釜內(nèi)加終濃度為300g/L(5M)的尿素(溶解變性蛋白)和40g/L的2-巰基乙醇(減少二硫鍵的結(jié)合)反應(yīng)時(shí)間:8小時(shí)溶解收率:95%包涵體內(nèi)Trp-LE’-Met-proinsulin含量
:80%w/wWFI透析6小時(shí),收率98%,去除尿素和2-巰基乙醇過濾去除細(xì)小顆粒,保護(hù)后續(xù)層析柱。終體積5200L再次離心,去除菌體碎片和可溶性蛋白共用前面回收工段的碟片離心機(jī)當(dāng)前11頁,總共17頁。反應(yīng)工段—嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解為121個(gè)氨基酸的Trp-LE’-Met和82個(gè)氨基酸的Proinsulin70%甲酸溶液30倍過量加入CNBr(理論摩爾比1:1)收率95%反應(yīng)時(shí)間:12小時(shí)反應(yīng)溫度:20度利用前面溶解反應(yīng)釜在CNBr沸點(diǎn)35度旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)1小時(shí)會(huì)產(chǎn)生少量有毒氰化物氣體,現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)準(zhǔn)備次氯酸鹽亞硫酸分解的目的是打開胰島素原和二硫鍵,給半胱氨酸加上SO3部分pH9-11,50%w/w(6M)鹽酸胍,0.35%碳酸氫銨,3%硫酸鈉,1.5%過硫酸鈉,反應(yīng)時(shí)間12小時(shí),收率95%WFI透析至鹽酸胍濃度為20%w/w共用前面包涵體溶解過程的透析器當(dāng)前12頁,總共17頁。反應(yīng)工段—再折疊三個(gè)平行陽離子交換層析床純化proinsulin床直徑:140cm床高度:25cm填料:SPSepharoseFF,GE洗脫液:29%w/w尿素,1.5%NaCl,69.5%WFIpH4收率90%再折疊的目的是去除SO3,然后使二硫鍵形成,并再折疊成
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