藥典無菌檢查(常州培訓(xùn))

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主要內(nèi)容無菌產(chǎn)品理念無菌和無菌檢查法概念無菌操作及無菌技術(shù)要求無菌檢查法的局限性醫(yī)療器具無菌檢驗(yàn)依據(jù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件及人員要求試驗(yàn)主要設(shè)備培養(yǎng)基種類用途及配制要求培養(yǎng)基適用性檢查方法適用性試驗(yàn)供試品的無菌檢查三月231當(dāng)前1頁，總共52頁。1、無菌產(chǎn)品理念滅菌產(chǎn)品的無菌保證不能依賴最終產(chǎn)品的無菌檢驗(yàn)，它是作為確定批無菌產(chǎn)品是否無菌的一個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目，而產(chǎn)品的無菌保證要取決于生產(chǎn)過程中采用合格的滅菌工藝、良好的無菌保證體系和嚴(yán)格的GMP管理。三月2322當(dāng)前2頁，總共52頁。3

無菌：是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。無菌檢查法：用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。2、無菌和無菌檢查法概念三月233當(dāng)前3頁，總共52頁。3、無菌操作及無菌技術(shù)要求無菌操作

是指在無菌環(huán)境條件下，在對(duì)無菌制品或無菌器械等進(jìn)行檢驗(yàn)的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。無菌技術(shù)是指在微生物試驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其他干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，無菌試驗(yàn)器材及無菌操作。三月2344當(dāng)前4頁，總共52頁。

4、無菌檢查法的局限性若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試

品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。三月2355當(dāng)前5頁，總共52頁。6

5、醫(yī)療器具無菌檢驗(yàn)依據(jù)本規(guī)范選用于《中國藥典》2015年版四部1101無菌檢查法。GB/T14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法，第二部分：生物試驗(yàn)方法中規(guī)定的無菌試驗(yàn)方法。三月236當(dāng)前6頁，總共52頁。7

6、實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件要求

2015藥典無菌檢查：應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，試驗(yàn)環(huán)境必須達(dá)到無菌檢查的要求，檢驗(yàn)全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止微生物污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。三月237當(dāng)前7頁，總共52頁。

6.1實(shí)驗(yàn)環(huán)境潔凈度要求（修改）三月2388當(dāng)前8頁，總共52頁。9

6.2實(shí)驗(yàn)環(huán)境人員要求：

菌檢人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無菌技術(shù)培訓(xùn)。三月239當(dāng)前9頁，總共52頁。107

、試驗(yàn)主要設(shè)備細(xì)菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱超凈工作臺(tái)可調(diào)溫的培養(yǎng)箱顯微鏡臺(tái)式高壓蒸汽滅菌器立式高壓蒸汽滅菌器電熱恒溫干燥箱集菌儀三月2310當(dāng)前10頁，總共52頁。11

試驗(yàn)儀器（1）-超凈工作臺(tái)三月2311當(dāng)前11頁，總共52頁。12

試驗(yàn)設(shè)備（2）--隔水式恒溫培養(yǎng)箱三月2312當(dāng)前12頁，總共52頁。13

試驗(yàn)設(shè)備（3）----霉菌培養(yǎng)箱三月2313當(dāng)前13頁，總共52頁。14試驗(yàn)設(shè)備（4）-立式高壓蒸汽滅菌器三月2314當(dāng)前14頁，總共52頁。15試驗(yàn)設(shè)備（5）--臺(tái)式蒸汽滅菌器三月2315當(dāng)前15頁，總共52頁。16試驗(yàn)設(shè)備（6）--顯微鏡三月2316當(dāng)前16頁，總共52頁。17試驗(yàn)設(shè)備（7）-生物安全柜三月2317當(dāng)前17頁，總共52頁。18試驗(yàn)設(shè)備（8）Equinox全自動(dòng)無菌檢驗(yàn)系統(tǒng)三月2318當(dāng)前18頁，總共52頁。198、培養(yǎng)基種類及用途

硫乙醇酸鹽流體基（主要用于厭氣菌培養(yǎng)、也可用于需氧菌培養(yǎng)）胰酪大豆胨液體基（用于真菌和需氧菌培養(yǎng)）三月2319當(dāng)前19頁，總共52頁。208.1培養(yǎng)基配制及要求培養(yǎng)基的滅菌：配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。保存時(shí)間：制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在：2～25℃、避光環(huán)境。非密閉容器中：一般在三周內(nèi)使用；密閉容器中：一般可在一年內(nèi)使用。三月2320當(dāng)前20頁，總共52頁。218.2培養(yǎng)基配制及要求硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：配制后調(diào)節(jié)PH值為弱堿性，使滅菌后在25℃的pH為7.1±0.2，分裝在適宜的容器中，其裝量與容器高度的比列應(yīng)符合培養(yǎng)后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基的氧化層（粉紅色）的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1／5，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：置30～35℃培養(yǎng)。三月2321當(dāng)前21頁，總共52頁。228.3培養(yǎng)基配制及要求

胰酪大豆胨液體基：取培養(yǎng)基成分混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)PH值約為7.3±0.2，加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。胰酪大豆胨液體基：置20～25℃培養(yǎng)。三月2322當(dāng)前22頁，總共52頁。238.4培養(yǎng)基配制及要求

培養(yǎng)基裝量：對(duì)于采用直接接種法檢查的供試品，應(yīng)根據(jù)供試品接種量確定培養(yǎng)基的裝量，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不大于培養(yǎng)基體積的10%。供試品檢查時(shí)，培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗(yàn)。三月2323當(dāng)前23頁，總共52頁。24

9、培養(yǎng)基適用性檢查無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌檢查及靈敏度檢查的要求。無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶），置培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。靈敏度檢查：用于培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代不得超過5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為0代），采用適宜的方法保存；并以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。三月2324當(dāng)前24頁，總共52頁。259.1培養(yǎng)基適用性檢查菌種：試驗(yàn)用菌株及菌液制備：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003銅綠色假單胞菌[CMCC(B)10104]枯草桿菌[CMCC(B)63501]生孢梭菌[CMCC(B)64941]白色念珠菌[CMCC(F)98001]黑曲霉[CMCC(F)98003]

三月2325當(dāng)前25頁，總共52頁。26三月23注：10倍梯度稀釋；選擇適宜的3個(gè)稀釋級(jí)別；要求＜100cfu/ml。26當(dāng)前26頁，總共52頁。279.2

培養(yǎng)基適用性檢查

菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)24～48h，上述培養(yǎng)物用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌量小于100cfu菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管中，用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu孢子懸液；（如表9.3）注：菌懸液在室溫下2h使用,若保存在2～8℃可在24小時(shí)內(nèi)使用。三月2327當(dāng)前27頁，總共52頁。28

9.3培養(yǎng)基靈敏度檢查三月23培養(yǎng)基靈敏度檢查使用6株菌見下表28當(dāng)前28頁，總共52頁。299.4培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基接種

金黃色葡萄球菌2支

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基銅綠假單胞菌2支

12ml（7支）生孢梭菌2支

空白對(duì)照1支分別接種小于100cfu金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌菌懸液各2支,另1支不接種作為空白對(duì)照,培養(yǎng)3天，逐日觀察結(jié)果。三月2329當(dāng)前29頁，總共52頁。309.5培養(yǎng)基適用性檢查

培養(yǎng)基接種枯草芽孢桿菌2支

胰酪大豆胨液體基白色念株菌2支9ml（7支）

黑曲霉2支

空白對(duì)照1支每分別接種小于100cfu枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接種作為空白對(duì)照,培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果。

三月2330當(dāng)前30頁，總共52頁。319.6

培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果判斷

空白對(duì)照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。三月2331當(dāng)前31頁，總共52頁。3210.

方法適用性試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)康?1)進(jìn)行無菌檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查；2)若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)；3)方法適用性試驗(yàn)按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行方法確認(rèn)。三月2332當(dāng)前32頁，總共52頁。3310.1

方法適用性試驗(yàn)

菌種及菌液制備：除大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102〕外，金黃色葡萄球菌

、

枯草芽孢桿菌

、

生孢梭菌、

白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。

注：大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。

三月2333當(dāng)前33頁，總共52頁。10.2

方法適用性試驗(yàn)三月2334當(dāng)前34頁，總共52頁。3510.3方法適用性試驗(yàn)結(jié)果判斷

與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查法和檢驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用?？刹捎茫?)增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量；2)使用中和劑，或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。注：方法適用性試驗(yàn)也可與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。三月2335當(dāng)前35頁，總共52頁。

11、供試品的無菌檢查

無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。供試品無菌檢查所采用的檢查和檢驗(yàn)條件應(yīng)與方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法相同。無菌試驗(yàn)過程中，若需試驗(yàn)表面活性劑、中和劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物無毒性。36三月2336當(dāng)前36頁，總共52頁。11.1

供試品無菌檢查三月2337當(dāng)前37頁，總共52頁。11.2

供試品的無菌檢查

陽性對(duì)照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對(duì)照菌：三月2338當(dāng)前38頁，總共52頁。11.3

供試品的無菌檢查

陰性對(duì)照：供試品無菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對(duì)照；陰性對(duì)照不得有菌生長。

三月233939當(dāng)前39頁，總共52頁。4011.4

供試品的無菌檢查

薄膜過濾法：薄膜過濾法應(yīng)采用封閉式薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥，為發(fā)揮濾膜最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試品經(jīng)薄膜過濾后，若需要沖洗液沖洗濾膜。每張濾膜每次沖洗量為100ml.,且總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。三月2340當(dāng)前40頁，總共52頁。11.5

供試品的無菌檢查水溶性供試品：取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含不少于100ml適宜稀釋的無菌容器中，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用，須用沖洗液沖洗濾膜。沖洗次數(shù)不少于三次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法適用性試驗(yàn)。除生物制品外，一般樣品沖洗后，1份濾器加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。例如：三月2341當(dāng)前41頁，總共52頁。11.6供試品的無菌檢查水溶性固體供試品：取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標(biāo)簽說明復(fù)溶，然后按水溶液供試品項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作。具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品：取規(guī)定量，每個(gè)小包裝用50-100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無菌容器中，然后照水溶液供試品項(xiàng)下方法操作。同時(shí)應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。三月2342當(dāng)前42頁，總共52頁。11.7

供試品的無菌檢查具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品：取規(guī)定量，每個(gè)小包裝用50-100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無菌容器中，然后照水溶液供試品項(xiàng)下方法操作。同時(shí)應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。三月2343當(dāng)前43頁，總共52頁。4411.8

供試品無菌檢查

直接接種法：

適用于無法用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查的供試品，即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除生物制品外，一般樣品無菌檢查時(shí)兩種培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)相等；生物制品無菌檢查時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)為2：1。除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試品檢查時(shí)，培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗(yàn)。

三月2344當(dāng)前44頁，總共52頁。11.9供試品的無菌檢查例如：三月2345當(dāng)前45頁，總共52頁。11.10

供試品的無菌檢查培養(yǎng)及觀察：將接種的供試品后培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天；接種生物制品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應(yīng)分成兩等份，一份置30～35℃，一份置20～25℃培養(yǎng)。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。若加入供試品后或培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，觀察接種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液