新：干旱迫處理后各生理生化指標的測定方法

干旱迫處理后各生理生化指標的測定方法鹽脅迫處理后葉片細胞膜透性（即電導率）的測定（已完成）植物細胞膜起調(diào)控細胞內(nèi)外物質(zhì)交換的作用，它的選擇透性是最重要的功能之一。當植物組織受到逆境傷害時，細胞膜受到不同程度的破壞，膜的透性增加，選擇透性喪失。細胞內(nèi)的各種水溶性物質(zhì)包括電解質(zhì)將有不同程度的外滲，其中包括鹽類和有機酸等。這些物質(zhì)進入環(huán)境介質(zhì)中，如果環(huán)境介質(zhì)是無機離子水，水的電導率值將因電解質(zhì)的外滲而加大。膜受到傷害愈重，水溶性物質(zhì)外滲愈多，電導度的增加也愈大。故可用電導儀測定外滲液的電導度增加值而得知傷害程度。試驗器械及試劑：電導率儀、超純水儀、真空儀、50mL小燒杯、電子天平、水浴鍋試驗操作步驟：儀器的清洗：用自來水清洗50mL燒杯，再用蒸餾水洗3遍，超純水洗3遍，隨后用超純水平衡24小時以上，在烘箱內(nèi)烘干備用。電導率測定：將供試材料葉片用自來水洗去表面灰塵，再用雙蒸水和超純水沖洗3次，用干凈紗布輕輕吸十葉片表面水分，然后保存在濕紗布中，以防止葉片失水。每樣品設3次重復，每個重復取質(zhì)量近似相等的避開大葉脈的葉片，放入50mL燒杯中，用小玻璃棒輕輕壓住材料，準確加入20mL超純水，浸沒樣品，在室溫下真空處理20min，取出后靜止放置10min，用DDS-18A數(shù)字型電導儀測定浸出液電導率為“K」。再放在100°C沸水浴中加熱10分鐘，以完全破壞質(zhì)膜，冷卻后測定各溶液的電導率為“k2”。結果計算方法：外滲液相對電導率二K]/K2X100%光合速率的測定（已完成）試驗器械及試劑儀器：光合測定儀實驗儀器為PP-system公司生產(chǎn)的CIRAS-2便攜式全自動光合測定系統(tǒng)，這是國內(nèi)目前最先進的測定光合作用的儀器，所得指標多、全、相關度大。試驗方法每株植物選擇近同等部位1?2片向陽功能葉片，水平角度進行不離體測定。葉綠素含量測定（未做）一、 原理根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯一比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即A=aCL式中：a比例常數(shù)。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。二、 材料、儀器設備及試劑（一） 材料：新鮮（或烘干）的植物葉片。（二） 儀器設備：1.分光光度計；2.電子頂載天平（感量0.01g）；3.研缽；4.棕色容量瓶；5.小漏斗；6.定量濾紙；7.吸水紙；8.擦境紙；9.滴管。（三） 試劑：96%乙醇（或80%丙酮）；石英砂；碳酸鈣粉。三、 實驗步驟取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或十材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2?3ml96%乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3?5min。3.取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。4.用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。5.把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95%乙醇為空白，在波長665nm、649nm及470nm下測定吸光度。四、實驗結果計算：將測定得到的吸光值代入下面的式子： Ca=13.95A665-6.88A649；Cb=24.96A649—7.32A665（類胡蘿卜素參見另一本書）。據(jù)此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca、Cb：mg/L），二者之和為總葉綠素的濃度。最后根據(jù)下式可進一步求出植物組織中葉綠素的含量：葉綠素的含量（mg/g）=［葉綠素的濃度x提取液體積x稀釋倍數(shù)］/樣品鮮重（或干重）?？扇苄钥偺菧y定（蒽酮比色法）（未做）（1） 原理：糖+硫酸一糠醛，其與蒽酮形成綠色絡合物，620nm下顯色。本實驗采用濃硫酸，倒入水中產(chǎn)生大量熱，促進反應發(fā)生。（2）標準曲線繪制：取略大于0.01g的葡萄糖，105度烘干至恒重，取0.01g定容至100ml，配成100ug/ml的溶液。取200mg蒽酮，溶于100ml濃硫酸，冷卻，保存于棕色瓶。（注意：不需定容，量取100ml硫酸倒入燒杯即可，定容混勻時產(chǎn)氣熱濺出。注意硫酸中是否存在雜質(zhì)。蒽酮非常敏感，不能用勺等挖取，只能直接倒，否則就會污染。溶液配后呈亮黃色，放置頃刻不變色。）標糖溶液ml00.20.40.60.81.0蒸餾水ml2.52.32.11.91.71.5蒽酮溶液ml6.56.56.56.56.56.5糖含量ug020406080100總體積9ml，快搖2-3s，室溫冷卻10-15min，顯色，620nm.實驗結果：實際上并不理想，因abs均偏低，可試將標糖濃度適當升高。葡萄糖含量ug20 40 60 80 100abs 0.090.1690.2590.3320.427

20070830可溶性糖標準曲線葡萄糖濃度?系列120070830可溶性糖標準曲線葡萄糖濃度?系列1—線性（系列1）植物酶液提?。ㄓ糜跍ySOD,POD,CAT）:（未做）1） pvpp（固體,pvp單體與金屬元素結合）酚類吸附劑，酚的羥基與蛋白質(zhì)的羰基形成氫鍵，醌導致蛋白質(zhì)聚合?；騪olyclarAT（Polyclar-ATisinsolublePVP,alsocalledasPVPP（PolyVinylPolyPyrrolidine）.ItbindsphenolsetcmoreefficientlythanPVPandiseasilyremovablebyfiltrationoralowspeedspin）去除酚的毒害防止醌顏色干擾。PVP的肽鍵中的氧與酚羥基上的質(zhì)子牢固結合，防止酚與酶中肽鍵結合，保護了酶。2） 母液制備：0.1mol/L二硫蘇糖醇DTT:100mg至微量離心管，+650ul水0.5mo/LEDTA:93gEDTANa,10gNaOH定容到500ml10mg/mlBSA：100mgBSA于9.5ml水中注意:⑥⑦⑧項都用第⑤項提取的酶進行測定。SOD活性的測定（未做）試驗器械和試劑儀器：離心機；光照培養(yǎng)箱；電子天平；U2800紫外分光光度計；研缽；塑料離心管（5mL）試劑：SOD反應液：0.013mol-L-1甲硫酸銨，63x10-6mol-L-1氮藍四唑，6.5x10-6mol-L-1核黃素，1x10-4mol?L-1EDTA及pH7.8的0.05mol-L-1磷酸緩沖液1/15mol?L-1磷酸緩沖液（pH7.8）試驗方法光照情況下核黃素在水溶液中產(chǎn)生過氧活性自由基，此活性自由基將氮藍四唑還原生成紫藍色物質(zhì)，SOD能清除溶液中產(chǎn)生的過氧活性自由基團，從而抑制氮藍四唑的還原反應［76］。通過測定560nm處被抑制的吸光值百分比計算酶活性。公式如下：A…= 50%-W-T-vA…= 50%-W-T-v其中：asod:酶活性AA560%：560nm處被抑制的吸光值百分數(shù)V：提取的酶液總體積▼:反應的酶液體積「反應時間（min）W：植物材料粉末的凈重稱取0.15g液氮速凍后研磨成粉末狀的植物材料，放入5mL塑料離心管內(nèi)加2.5mL1/15mol?L-1磷酸緩沖液（pH7.8）超聲處理1min，冰浴5min,12000rpm離心6.5min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一5mL塑料離心管內(nèi)放入4°C冰箱儲存待測。取上清液50pL,加950pL1/15mol-L-1磷酸緩沖液（pH7.8）（即：將酶液稀釋20倍），再加3mL反應液（0.013mol?L-1Met,63x10-6氮藍四唑，1.3x10-6mol?L-1核黃素，1x10-4mol?L-1EDTA和0.05mol?L-1磷酸緩沖液，pH7.8）定溶至4mL，30C、6級光照培養(yǎng)箱內(nèi)反應10min后立即測定吸光值，用不加酶液的反應液（1mL1/15mol?L-1磷酸緩沖液，3mL反應液）作對照調(diào)零。將測得吸光值代入上式，求得酶活性。POD活性測定（未做）試驗器械及試劑儀器：離心機；水浴鍋；電子天平；U2800紫外分光光度計；塑料離心管（5mL）；研缽試劑：0.1mol?L-1愈創(chuàng)木酚；0.8%H2O2溶液；0.01mol?L-1磷酸緩沖液（pH7.2）；0.1mol?L-1磷酸緩沖液（pH7.2）試驗方法POD活性是通過測定H2O2存在情況下單位時間內(nèi)過氧化物酶（POD）催化底物愈創(chuàng)木酚為茶褐色產(chǎn)物的量來定義酶的活性單位。用分光光度計測定470nm處反應溶液的吸光度，以每分鐘每克鮮重材料的吸光度變化0.01所需的酶量為一個酶活性單位。具體過程參照朱廣廉編撰的《植物生理學實驗》中的方法［77］。酶活性計算公式為：匕尸00'%，*^."其中：氣牘：酶的活性△A；。：470nm處反應溶液的吸光度變化值V：提取酶液的總體積▼：反應酶液的體積W：樣品粉末的凈重「反應總時間稱取0.5g左右液氮速凍后研磨成粉末狀的植物材料，放入5mL塑料離心管內(nèi)加2.5mL0.01mol?L-1磷酸緩沖液（pH7.2）超聲處理1min，冰浴5min，12000rpm離心6.5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一5mL塑料離心管內(nèi)放入4C冰箱儲存待測。取上述提取的酶液100mL加0.01mol?L-1磷酸緩沖液（pH7.2）900mL（即將酶液稀釋10倍），再加1mL0.8%H2O2溶液、1mL0.1mol?L-1磷酸緩沖液（pH7.2）和1mL0.1mol?L-1愈創(chuàng)木酚溶液，充分混勻，30C水浴反應10min，迅速在470nm處測吸光值，用超純水替代H2O2溶液的反應體系作為對照。過氧化氫酶CAT（未做）德］B.施特爾馬赫著.錢嘉淵譯.酶的測定方法 ［M］.第1版.中國輕工業(yè)出版社，1992. p186-1881） 原理：CAT催化H2O2分解，240nm處檢測H2O2減少量。CAT以PH7.0，37度時活性最高，冷凍，陽光，氧氣降低酶活。2） 藥品：0.18%H2O2:600ul30%H2O2用PH7.0PBS稀釋至100ml.現(xiàn)配。（一般情況下，配置的雙氧水冬天兩周用完，夏天一周，避光）25度預熱的蒸餾水3） 步驟：a） 為檢查在不加酶的情況下吸光度是否也降低，以蒸餾水為參比，用移液管將1.0ml底物溶液和1.9ml蒸餾水滴入一只1厘米比色皿，并調(diào)水溫至25°C。在連續(xù)5分鐘內(nèi)240nm處測定吸光度，若吸光度的降低幅度超過0.01，則在計算主值時須減去此值。b） 以蒸餾水為對照，實驗組：1ml0.18%H2O2+1.9ml蒸餾水+100ul酶液，在連續(xù)5分鐘內(nèi)240nm處測定吸光度。（每隔1分鐘讀取一次結果，直至每分鐘吸光度的降低值達到穩(wěn)定為止）c） 計算：在上述條件下，每分鐘酶促分解1umol過氧化氫的酶量定為1個酶活力單位。U/mg=E24X3/0.0436XEw式中：E240—240nm處每分鐘內(nèi)吸光度的降低值Ew—每0.10ml所用酶液中含酶的重量（mg）0.0436—240nm處1umol過氧化氫的吸光度3一反應混合液的總體積。4） 注意：酶液濃度應為5-20u/ml鹽脅迫處理后脯氨酸含量的測定（不做）試驗器械及試劑儀器：U2800紫外分光光度計；水浴鍋；離心機；電子天平；石英比色皿；5ml塑料離心管；研缽試劑：脯氨酸標準液：40四gmL-1，加蒸餾水溶解即可。脯氨酸提取液（20mL）：99.5%甲醇12mL+99.5%三氯甲烷5mL+蒸餾水3mL1%茚三酮溶液：精確稱取1g茚三酮用乙醇溶解后，加入10mL99.8%冰醋酸，用乙醇定容至100mL即可。試驗方法植物體內(nèi)脯氨酸含量測定采取徐曉峰等［74］人的方法并作如下修改［75］。分別向5mL塑料離心管內(nèi)加入0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL和0.9mL40^gmL-1脯氨酸標準溶液，用超純水補充體積至2mL后加入1mL冰醋酸和1mL1%的茚三酮溶液，總體積為4mL。80C水浴40min后冷卻全室溫，用加0mL標準液的反應溶液調(diào)零，在520nm處測吸光值（A）。用吸光值與標準脯氨酸含量作標準曲線：Ypr=17.691*Apr+3.087r=