生化制藥基本技術演示文稿

生化制藥基本技術演示文稿當前1頁，總共83頁。優(yōu)選生化制藥基本技術當前2頁，總共83頁。生物材料、發(fā)酵或培養(yǎng)液↓預處理（清洗、加熱、調(diào)pH、凝聚、絮凝）↓細胞分離（沉降、離心、過濾）↓細胞↓細胞破碎（高壓均質(zhì)處理、研磨、溶菌處理）↓收集上清液↓初步純化（沉淀、吸附、萃取、過濾）↓高度純化（離子交換色譜、親和色譜、疏水色譜、吸附色譜及電泳等）↓成品加工（無菌過濾、超濾、濃縮、冷凍干燥、噴霧干燥、結(jié)晶等）圖2-1生化藥物提取的一般工藝流程上清液（含胞外產(chǎn)品）當前3頁，總共83頁。一、原料的選取與保存

選擇原則：①有效成分含量高，原料新鮮；②原料來源豐富，易得，原料成本低；③原料中雜質(zhì)含量較少等。植物材料確定后，要選擇合適的季節(jié)、地點、時間后采集并就地去除不用的部分，將有用的部分保鮮處理。保存生物材料的方法主要方法有冷凍法，常用-40℃速凍；有機溶劑脫水法；防腐劑保鮮法。當前4頁，總共83頁。二、生化藥物提取1.物理性質(zhì)與提取提取是利用目的物的溶解特性，將其與細胞的固形成分或其它結(jié)合成分分離，使其由固相轉(zhuǎn)入液相或從細胞內(nèi)的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入特定溶液環(huán)境的過程。許多生化藥物具有生物活性，其穩(wěn)定性受pH、溫度、離子強度、金屬離子、提取過程中所使用的溶劑等環(huán)境因素的影響。

當前5頁，總共83頁。2.提取的溶劑系統(tǒng)（1）對水溶性、鹽溶性生物物質(zhì)的提取可用酸、堿、鹽水溶液為提取劑。（2）對水、鹽系統(tǒng)無法提取的蛋白質(zhì)或酶的提取可用表面活性劑或有機溶劑提取，用有機溶劑作為提取試劑時，根據(jù)產(chǎn)物存在的狀態(tài)可分為液-液提取和固-液提取。當前6頁，總共83頁。①液-液提取也即萃取，也是利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相中分配系數(shù)不同而進行的提取分離的方法。雜質(zhì)溶質(zhì)原溶液萃取劑LightphaseHeavyphase萃取相原溶液tC當前7頁，總共83頁。在一定溫度和壓力下，溶質(zhì)分配在兩個互不相溶的溶劑中達到平衡后，溶質(zhì)在這兩相的濃度比為一常數(shù)K，此常數(shù)稱為分配系數(shù)。在常溫下Ｋ為常數(shù)；Ｃ的單位通常用mol/L或質(zhì)量單位/mL。當前8頁，總共83頁。工業(yè)生產(chǎn)中常用的萃取溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯等。表2青霉素在不同萃取劑中的分配系數(shù)

溶劑pH2.5（溶劑/水）pH7.0（溶劑/水）乙酸戊酯45/11/235乙酸丁酯47/11/186乙酸乙酯39/11/260氯仿39/11/220三氯乙烯21/11/260乙醚12/11/190當前9頁，總共83頁。物理化學方面有足夠的容量與水溶液不互溶，不發(fā)生乳化對產(chǎn)物有高的分配系數(shù)低黏度在密度上同水有大的差別生物學方面在消毒過程中熱穩(wěn)定經(jīng)濟和毒理方面對生物催化劑、酶或活細胞無毒性低成本能大批供應對人員無毒不易燃表1在生物轉(zhuǎn)化中萃取溶劑的選擇準則當前10頁，總共83頁。②固-液提取也稱為浸取。為了高效、快速地從固體中將目的物浸取出來，同時盡可能將雜質(zhì)留在固體中，選擇合適的溶劑很重要，溶劑選擇的主要依據(jù)是“相似相溶”原理。浸取常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等極性溶劑和乙醚、氯仿、苯等非極性溶劑。無論采用哪種溶劑系統(tǒng)對目的物進行提取，在提取過程中都要盡量增加目的物的溶出度，并盡可能減少雜質(zhì)的溶出度，同時充分重視目的物在提取過程中的活性變化。當前11頁，總共83頁。三、細胞破碎技術植物細胞模式圖當前12頁，總共83頁。1.機械法：包括球磨法、高壓勻漿法、超聲破碎法、X-press等。JJ-2組織搗碎勻漿機

當前13頁，總共83頁。

珠磨法beadmill珠磨是常用的方法**細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機WSK臥式高效全能珠磨機當前14頁，總共83頁。超聲波破碎儀

當前15頁，總共83頁。技術原理效果成本破碎率舉例高壓勻漿法(孔型)須使細胞通過小孔，使細胞受到剪切力而破碎劇烈適中<50%細胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細胞被玻璃珠或鐵珠剪切碰撞劇烈便宜90%細胞懸浮液和植物細胞的大規(guī)模處理超聲波法用超聲波的空穴作用使細胞破碎適中昂貴<50%細胞懸浮液小規(guī)模處理***不同機械破碎方法的比較當前16頁，總共83頁。2.非機械法：酶溶法、化學滲透法、反復凍融法、干燥法等

酶溶法的缺點在于酶的價格昂貴限制了在大規(guī)模生產(chǎn)中的使用，雖然條件溫和、具有選擇性。細胞懸浮液中加入酶能迅速和細胞壁反應并破壞它們。酶選擇性的催化細胞壁反應，不破壞細胞內(nèi)的其它物質(zhì)。當前17頁，總共83頁。當前18頁，總共83頁。四、固液分離固液分離的方法很多，有重力沉降、離心分離和過濾等。離心：借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力的作用，促使不同大小，不同密度的粒子分離的技術。過濾：在一定的壓力差下，利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮液中的固體粒子，進行固液分離的方法稱為過濾。當前19頁，總共83頁。當前20頁，總共83頁。當前21頁，總共83頁。第二節(jié)沉淀技術沉淀：是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)的溶解度降低、生成固體凝聚物的現(xiàn)象。根據(jù)沉淀機理不同，可分為鹽析法、有機溶劑沉淀法和等電點沉淀法等。當前22頁，總共83頁。一、鹽析法

水溶液中蛋白質(zhì)的溶解度一般在生理離子強度范圍內(nèi)（0.15～0.2mol/L）最大，低于或高于此范圍時溶解度均降低。蛋白質(zhì)在高離子強度的溶液中溶解度降低，發(fā)生沉淀的現(xiàn)象稱為鹽析。不同蛋白質(zhì)鹽析時所需的鹽的濃度不同，因此調(diào)節(jié)鹽的濃度，可以使混合蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)分段析出，達到分離純化的目的。常用的鹽析用鹽包括硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉等。當前23頁，總共83頁。當前24頁，總共83頁。二、有機溶劑沉淀法

向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑、降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法稱為有機溶劑沉淀法。

許多能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)。當前25頁，總共83頁。三、等電點沉淀法

兩性電解質(zhì)在溶液pH處于等電點時，分子表面電荷為零，導致賴以穩(wěn)定的電荷層及水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。調(diào)節(jié)溶液pH值，使兩性溶質(zhì)溶解度下降，析出沉淀的操作稱為等電點沉淀法。當前26頁，總共83頁。第三節(jié)色譜技術色譜：也稱層析，是根據(jù)混合物中溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起遷移速度不同而進行分離的方法。固定相：固定相是色譜的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在色譜過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱色譜中一般稱為洗脫劑，薄層色譜時稱為展層劑。當前27頁，總共83頁。一、色譜技術的分類色譜技術根據(jù)流動相的物態(tài)不同可以分為氣相色譜法、液相色譜法和超臨界流體色譜法。根據(jù)固定相的形狀不同，色譜法可分為柱色譜法、紙色譜法和薄層色譜法。根據(jù)分離的機理，可分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法和親和色譜法。當前28頁，總共83頁。二、柱色譜裝置和操作柱色譜一般由進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀及部分收集器等部分組成。柱的分離效率與柱高成正比，與直徑成反比。當前29頁，總共83頁。柱色譜操作（1）裝柱。根據(jù)欲分離的物質(zhì)性質(zhì)選擇適宜的色譜介質(zhì)，裝柱時，將洗脫劑與一部分緩沖液調(diào)成漿料后邊攪拌邊慢慢加入，一次用完。然后用幾倍柱床體積的緩沖液平衡色譜柱。（2）加樣。將平衡后的色譜柱從柱頂部或底部進樣。（3）洗滌。用與前組成相同的緩沖液流經(jīng)色譜柱，將未與固定相結(jié)合的雜質(zhì)洗滌下來。（4）洗脫。根據(jù)目的物的性質(zhì)，選用一定組成的洗脫液將目的物洗脫下來。（5）再生。目的物洗脫下來后，洗脫液成分及雜質(zhì)被吸附在色譜柱中，要進行再生后才能繼續(xù)使用。當前30頁，總共83頁。慢中等快柱分離淋洗液當前31頁，總共83頁。三、吸附色譜固定相：固體為吸附劑，如硅藻土、硅膠、氧化鈣、淀粉、活性炭等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑?；驹恚豪梦絼Σ煌镔|(zhì)的吸附能力不同而使混合溶液中各組分相互分離的方法。當前32頁，總共83頁。

混合物中含A、B兩個組分，溶解后加至色譜柱中。開始A和B都被吸附在柱的上端，形成原始譜帶。當加入洗脫劑沖洗時，A和B將隨著向下流動而從吸附劑上洗脫，接著又遇到吸附劑又被吸附，又隨著向下流動的洗脫劑沖洗而被洗脫，如此連續(xù)不斷地被再吸附、再洗脫，經(jīng)過一段時間的沖洗后，由于A、B的極性不同，在該吸附劑和洗脫劑上被吸附和被洗脫的性能也不同，最終出現(xiàn)A、B兩個色譜帶。由于A的吸附力小于B，故A移行較快，在色譜柱下段，而B移行較慢，在柱的上段。繼續(xù)用溶劑沖洗，A、B將先后被洗脫出來。分別定量收集洗脫液，用TLC跟蹤檢驗，斑點相同的流分A、B兩個純品化合物。當前33頁，總共83頁。在吸附色譜中，溶質(zhì)在色譜柱中的移動情況常以阻滯因數(shù)Rf來表示，是在層析系統(tǒng)中溶質(zhì)的移動速度和流動相的移動速度之比。Rf=溶質(zhì)的移動速度/流動相的移動速度之比

=溶質(zhì)的移動距離/流動相的移動距離之比當前34頁，總共83頁。四、凝膠過濾色譜原理：按分子大小分離。凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可對大小流動產(chǎn)生不同的阻滯作用。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。

1.凝膠過濾色譜的分離機理固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；當前35頁，總共83頁。2.凝膠的種類和性質(zhì)（1）葡聚糖凝膠商品名為Sephadex，由葡聚糖和環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下交聯(lián)而成。主要型號是G-10～G-200。數(shù)字是凝膠的吸水量（每克干膠膨脹時吸水的毫升數(shù)）的10倍。（2）聚丙烯酰胺凝膠商品名為Bio-gel-P。主要型號有Bio-gel-P-2～Bio-gel-P-300等10種。后面的數(shù)字基本代表它們的排阻極限（不能擴散到凝膠網(wǎng)絡內(nèi)部的最小分子的分子量）的10-3，所以數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大。（3）瓊脂糖凝膠（4）其他多孔玻璃珠和多孔硅膠等。當前36頁，總共83頁。3.凝膠色譜的應用（1）脫鹽及除去小分熱源物質(zhì)子雜質(zhì)和溶液的濃縮。（2）濃縮。利用凝膠顆粒的吸水性可對大分子樣品溶液進行濃縮。（3）生物大分子的純化及生化藥物中熱源物質(zhì)的去除。（4）分子量測定。在一定范圍內(nèi)，各個組分的洗脫體積Ve與其分子量的對數(shù)成線性關系。當前37頁，總共83頁。五、離子交換色譜固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復離子交換反應；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關。親和力大，保留時間長；應用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。當前38頁，總共83頁。當前39頁，總共83頁。當前40頁，總共83頁。六、親和色譜原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。先在載體表面鍵合上一種具有一般反應性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。當前41頁，總共83頁。薄層色譜原理2當前42頁，總共83頁。紙層析原理當前43頁，總共83頁。第四節(jié)結(jié)晶一、結(jié)晶的原理1.飽和溶液：當溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時，該溶液稱為飽和溶液；2.過飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度時，該溶液稱之為過飽和溶液；

3.晶核：在過飽和溶液中，最先析出的微小顆粒就是以后結(jié)晶的中心，稱為晶核。當前44頁，總共83頁。結(jié)晶的過程1.形成過飽和溶液。2.晶核的形成。3.晶體的生長。

其中，溶液達到過飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提，過飽和度是結(jié)晶的推動力。當前45頁，總共83頁。二、結(jié)晶的過程過飽和溶液的形成（1）熱飽和溶液冷卻適合溶解度隨著溫度降低而顯著減小的情況。（2）部分溶劑蒸發(fā)法蒸發(fā)法是使溶液加壓、常壓或減壓下加熱，蒸發(fā)除去部分溶劑達到過飽和的結(jié)晶方法。（3）化學反應結(jié)晶法通過加入反應劑或調(diào)節(jié)pH生成一個新的溶解度更低的物質(zhì)，當其濃度超過它的溶解度時，就結(jié)晶析出。（4）鹽析法當前46頁，總共83頁。2.晶核的形成在工業(yè)結(jié)晶中，有3種不同的起晶方法：一種是自然起晶法，即在一定溫度下使溶液進入不穩(wěn)定區(qū)，形成符合要求的晶核后加入稀溶液使溶液進入亞穩(wěn)定區(qū)，溶質(zhì)在晶核表面長大。第二種是刺激起晶法，即將溶液蒸發(fā)進入亞穩(wěn)定區(qū)后加以冷卻，使之進入不穩(wěn)定區(qū)后產(chǎn)生一定的晶核，晶核析出后會使溶液濃度降低在進入亞穩(wěn)定區(qū)，在亞穩(wěn)定區(qū)內(nèi)使晶體生長。第三種是晶種起晶法，即將溶液蒸發(fā)或冷卻至亞穩(wěn)定區(qū)后投入一定數(shù)量和大小的晶種，使溶質(zhì)在所加晶種表面長大。當前47頁，總共83頁。3.晶體的生長晶體生長：在過飽和溶液中已有晶核或加入晶種后，以過飽和度為推動力，晶種或晶核將長大，這種現(xiàn)象稱為晶體生長。影響晶體生長的主要因素有：①雜質(zhì)②攪拌③溫度④過飽和度當前48頁，總共83頁。三、晶體質(zhì)量控制晶體的質(zhì)量主要指晶體的大小、形狀和純度三個方面。重結(jié)晶是利用雜質(zhì)和結(jié)晶物質(zhì)在不同溶劑和不同溫度的溶解度不同，將晶體用合適的溶劑溶解，再次結(jié)晶，使其純度提高的操作。當前49頁，總共83頁。四、結(jié)晶的應用工業(yè)結(jié)晶技術廣泛應用于紅霉素、四環(huán)素、制霉菌素等抗生素及谷氨酸、賴氨酸等氨基酸的純化精制。當前50頁，總共83頁。第五節(jié)電泳一、電泳原理與分類

將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當?shù)碾姌O移動。某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。當前51頁，總共83頁。電泳的類型電泳主要有區(qū)帶電泳、等電點電泳和等速電泳等。當前52頁，總共83頁。二、瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，它的分子結(jié)構(gòu)大部分是由1,3聯(lián)接的β-吡喃半乳糖，1，4聯(lián)接的3，6脫水α-D吡喃半乳糖交替而成的，其結(jié)構(gòu)為：

當前53頁，總共83頁。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）--ethidiumbromide染色，此時，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。染色：當前54頁，總共83頁。電泳儀電泳槽當前55頁，總共83頁。瓊脂糖凝膠電泳裝置

當前56頁，總共83頁。操作流程大致為：凝膠的制備→膠板的制備→加樣→電泳→觀察和拍照。當前57頁，總共83頁。操作步驟瓊脂糖凝膠的制備：溶化，冷卻，EB凝膠板的制備：加梳子，倒膠樣品的制備：樣品+1/5體積溴酚藍加樣：加樣端為負極（黑）電泳：5V/cm觀察：紫外燈下觀察，照相當前58頁，總共83頁。稱量、加入緩沖液當前59頁，總共83頁。溶膠當前60頁，總共83頁。準備膠槽當前61頁，總共83頁。凝膠冷卻至50°C，加EB至終濃度0.5μg/ml當前62頁，總共83頁。鋪膠當前63頁，總共83頁。凝膠凝固后取出梳子當前64頁，總共83頁。加緩沖液當前65頁，總共83頁。準備樣品當前66頁，總共83頁。點樣當前67頁，總共83頁。電泳當前68頁，總共83頁。注意觀察溴酚藍染液的遷移當前69頁，總共83頁。當前70頁，總共83頁。紫外燈下觀察電泳結(jié)果當前71頁，總共83頁。照相當前72頁，總共83頁。三、聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和N，N′-甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，這兩種成分在有引發(fā)劑和增速劑存在的情況下，丙烯酰胺的單體形成長鏈，由N，N′-甲叉雙丙烯酰胺的雙功能基團和鏈末端的自由功能基團反應而發(fā)生交聯(lián)。

丙烯酰胺為白色結(jié)晶粉末，無味，分子量為71.08，為中樞神經(jīng)毒物。N，N’-甲叉雙丙烯酰胺也為白色結(jié)晶粉末，無味，分子量為154.17，亦為中樞神經(jīng)毒物。1%的稀溶液與皮膚接觸也會引起皮膚發(fā)炎，小鼠的確切致死量（LD50）為170mg/㎏，所以在實驗室操作時應盡量避免與之直接接觸和吸入粉塵。

聚丙烯酰胺凝膠中常用的引發(fā)劑過硫酸銨和核黃素在堿性條件下可產(chǎn)生自由基，而增速劑N，N，N′，N′-四甲基乙二銨（TEMED）可催化由過硫酸銨產(chǎn)生的自由基的形成，從而加速聚合。

當前73頁，總共83頁。當前74頁，總共83頁。當前75頁，總共83頁。SDS當前76頁，總共83頁。聚丙烯酰胺凝膠制膠裝置當前77頁，總共83頁。當前78頁，總共83頁。實驗步驟一、制膠

1.配膠配膠應根據(jù)所測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量范圍選擇適宜的分離膠濃度。由于SDS

有連續(xù)體系和不連續(xù)體系兩種，兩者各有不同緩沖體系，因而有不同的配制方法。（以不連續(xù)體系為例）蛋白質(zhì)的相對分子量的范圍分離膠的濃度＜10420%～30%1×104～4×10415%～20%4×104～1×10510%～