溶血空斑實(shí)驗(yàn)

關(guān)于溶血空斑實(shí)驗(yàn)第一頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆杖苎瞻咴囼?yàn)檢測(cè)原理掌握溶血空斑的操作方法第二頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理●溶血空斑實(shí)驗(yàn)（plaqueformingcellassay,PFC）體外檢測(cè)單個(gè)抗體形成細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）的一種方法?！衿湓硎菍⒕d羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴結(jié)或小鼠脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，與一定量的SRBC結(jié)合，在37℃條件下免疫活性淋巴細(xì)胞釋放出溶血素，在補(bǔ)體的參與下，可溶解周圍的綿羊紅細(xì)胞，從而在每個(gè)抗體形成細(xì)胞周圍形成一個(gè)可見的溶血空斑。第三頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二●一個(gè)空斑代表一個(gè)抗體形成細(xì)胞（即B細(xì)胞），空斑的數(shù)量反映機(jī)體的體液免疫功能?！窨瞻叽笮”硎究贵w生成細(xì)胞產(chǎn)生抗體的多少。由于溶血空斑試驗(yàn)具有特異性高，篩選力強(qiáng)，可直接觀察等優(yōu)點(diǎn)，故可用做判定免疫功能的指標(biāo)，觀察免疫應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)變化，并可進(jìn)行抗體種類及亞類的研究。

第四頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二第五頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)材料與試劑器材：平皿、37℃水浴箱、離心機(jī)、顯微鏡試劑：①SRBC懸液：取無菌脫纖維羊血，用NS或PBS離心洗滌3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）懸成細(xì)胞濃度為2.00×109個(gè)/mL第六頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二②Hanks液（含Ca2+、Mg2+

）③底層基（1.4%）和表層基（0.7%）：將瓊脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%兩種濃度。將表層基分裝于小試管中，每管2ml④補(bǔ)體：新鮮豚鼠血清⑤小牛血清：56℃滅活30min第七頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)步驟㈠免疫脾細(xì)胞懸液的制備①小鼠免疫：每只小鼠經(jīng)尾靜脈注入上述SRBC懸液2.00×104個(gè)/0.2ml或者腹腔注射4.00×108

個(gè)/1ml。②單個(gè)脾細(xì)胞懸液的制備：將免疫后第四天的小鼠拉頸處死，解剖取出脾臟，放入PH7.2的PBS中漂洗，去掉結(jié)締組織，加入適量的PBS，用鑷子擠壓脾臟，稍靜置，吸上清液至離心管中，2500r/min離心5min，棄上清后，定量加入PBS液1ml，混勻，再用PBS液稀釋10倍（濃度約為5×106個(gè)/ml）第八頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二（二）傾注底層瓊脂將1.4%瓊脂凝膠加熱融化后，傾注于水平位置的平皿內(nèi)，每皿6ml，凝固后，用前置55℃水浴鍋中預(yù)溫。第九頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二（三）表層瓊脂的制備將0.7%的瓊脂融化后，置于55℃恒溫水浴箱中，依次加入以下試劑：⑴20%SRBC懸液0.1ml。⑵小牛血清0.1ml。⑶5.00×106/ml脾細(xì)胞懸液0.1ml。迅速混勻后，傾注于已鋪好底層瓊脂的平皿內(nèi)，使之均勻鋪平凝固后，靜置約15min，放37℃溫育2h。第十頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二（四）加補(bǔ)體從溫箱中取出平皿，每皿加入1:5稀釋的新鮮豚鼠血清1ml，繼續(xù)放37℃溫箱中溫育30min后取出，觀察溶血空斑。也可在室溫下放置1h，4℃冰箱過夜，次日觀察結(jié)果。第十一頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二結(jié)果判定

觀察時(shí)，將平皿對(duì)著光亮處，用肉眼或放大鏡觀察每個(gè)溶血空斑的溶血狀況，并記錄整個(gè)平皿中的空斑數(shù)，同時(shí)求出每百萬個(gè)脾細(xì)胞內(nèi)含空斑形成細(xì)胞的平均數(shù)。

第十二頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二注意事項(xiàng)⒈

對(duì)SRBC的要求：因?yàn)镾RBC既是免疫原，也是靶細(xì)胞和指示細(xì)胞，故要求SRBC應(yīng)新鮮，洗滌不超過3次，每次2

000r/min離心5min，細(xì)胞變形或脆性增大者均不能使用。2．免疫所用SRBC的數(shù)量：尾靜脈注射以2.00×104

個(gè)/0.2ml為宜。腹腔注射為4.00×108

個(gè)

/ml，用量小，如低于1.00×107個(gè)/ml注射0.5ml，空斑形成極少；用量過大，超過2.50×109個(gè)/ml，不能形成空斑。第十三頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二3．采取免疫脾的時(shí)間：無論是經(jīng)尾靜脈還是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾為宜，過早或過晚空斑都形成極少。4．脾細(xì)胞的活力：

為了保證脾細(xì)胞的活力，制備脾細(xì)胞過程中所用PBS（或Hank’s液），最好臨用時(shí)方從4℃冰箱中取出，或整個(gè)操作過程應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。5．傾注平板的要求：底層要平，表層要把握好溫度。不要有氣泡，表層基要求混合均勻。第十四頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二6．補(bǔ)體的活力：補(bǔ)體活力的大小，對(duì)溶血空斑的形成關(guān)系很大。如出現(xiàn)抗體或補(bǔ)體的活力低下，將不能形成空斑。所以補(bǔ)體要新鮮，并宜將3只以上豚鼠血清混合。試驗(yàn)中加入Ca2+、Mg2+是為了活化補(bǔ)體。7．空斑計(jì)數(shù)：要求判讀準(zhǔn)確，避免辨認(rèn)造成的誤差。遇可疑空斑時(shí)，應(yīng)鏡檢，對(duì)肉眼結(jié)果進(jìn)行核對(duì)。第十五頁，共十七頁，編輯于2023年，星期二所以器皿和各種試劑在加入表層基前均需預(yù)溫。SRBC可大致計(jì)數(shù)，但脾細(xì)胞