細胞培養(yǎng)的設(shè)施與基本條件

關(guān)于細胞培養(yǎng)的設(shè)施與基本條件第一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

預(yù)防培養(yǎng)細胞受到污染是細胞培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵為什么？生物體內(nèi)的細胞可以通過機體的代謝、調(diào)節(jié)和保護等機制而使其營養(yǎng)、環(huán)境、生長條件、抵抗有害因子能力等方面處于最佳狀況。而體外培養(yǎng)的細胞由于失去了對整體的依賴性，對實驗室細胞培養(yǎng)的設(shè)施條件和人員素質(zhì)提出了較高的要求。為了最大限度的創(chuàng)造既適合于細胞生長又可防治污染的環(huán)境，在培養(yǎng)過程中對細胞培養(yǎng)的設(shè)施、操作規(guī)程和檢測方法等制定了嚴(yán)格的規(guī)范要求。第二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三細胞工程實驗室與其他一般實驗室的主要區(qū)別在于，要求保持嚴(yán)格無菌環(huán)境，避免微生物及其他有害因子的影響。一般來講，它應(yīng)能進行六方面的工作：無菌操作、培養(yǎng)、制備、清洗、消毒滅菌處理和儲藏。

第三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

一般來講，它應(yīng)能進行六方面的工作：無菌操作、培養(yǎng)、制備、清洗、消毒滅菌處理和儲藏。各區(qū)最好分別設(shè)置于相連的各個房間，特別是無菌操作室最好能單獨設(shè)置。如安排在一大實驗室內(nèi)，則無菌操作區(qū)與清洗、消毒滅菌區(qū)應(yīng)分別位于兩端，而培養(yǎng)、制備和儲藏區(qū)位于此兩區(qū)之間。動物細胞工程實驗室的設(shè)置1.1細胞工程實驗室的設(shè)置第四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三有其特殊的設(shè)置，如具有光照條件的培養(yǎng)室，試管苗培育所需的溫室和移植馴化室等。植物細胞工程實驗室的設(shè)置第五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三基本實驗室1.1清洗間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在30~50m2。在實驗室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌水槽，用來清洗玻璃器皿、用具和培養(yǎng)材料等。中央實驗臺還應(yīng)配置2個水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購置一臺洗瓶機。準(zhǔn)備1~2個洗液缸，專門用于洗滌對潔凈度要求很高的玻璃器皿。還應(yīng)配置落水架、干燥箱、超聲波清洗器、純水制備等。

地面應(yīng)耐濕并排水良好。第六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三超聲波清洗機電熱干燥箱純水儀洗瓶機第七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

主要用于有關(guān)培養(yǎng)用液體、培養(yǎng)基母液和培養(yǎng)基的配制等。

面積60m2左右，配備的主要儀器設(shè)備有：冰箱、實驗臺、藥品柜、器械柜、天平、微波爐、pH計、玻璃棒、燒杯、磁力攪拌器、培養(yǎng)基分裝器、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管（器）、燒杯、量筒、容量瓶、儲藏瓶等。冰箱以體積180~200L為宜，用于儲存培養(yǎng)基母液、激素、維生素等貴重藥品、彩色膠卷及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。1.2

制備室第八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三pH計天平移液器第九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

用于培養(yǎng)細胞所用器械、培養(yǎng)基的消毒與滅菌。

配備實驗臺、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細菌過濾設(shè)備、干燥箱、消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號的滅菌鍋。一般實驗室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實驗室可選用立式自動控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實驗室可選用大型的臥式滅菌鍋。

如果沒有條件的話，可以將上述工作間合并成一個準(zhǔn)備間，要求設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。1.3消毒間第十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

無菌操作室主要用于實驗材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與接種室的門錯開，兩個門也不要同時開啟，以保證無菌室不因開門和人的進出帶進雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實驗臺、鞋帽架、柜子、紫外燈。無菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。

室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺、紫外燈、酒精燈、解剖鏡、各種接種器械等。

1.4無菌操作室第十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三超凈工作臺離心機第十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照，培養(yǎng)室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個通氣窗，并安上排氣扇。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照時間及其強度由日光燈和自動定時開關(guān)控制。

培養(yǎng)室應(yīng)配有若干培養(yǎng)架，上面固定日光燈、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動控時器等。1.5培養(yǎng)室第十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2、輔助實驗室

2.1鑒定室細胞學(xué)鑒定室其功能是對培養(yǎng)材料進行細胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。應(yīng)配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等生化分析室在以培養(yǎng)細胞產(chǎn)物為主要目的實驗室中，應(yīng)建立相應(yīng)的生化分析實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進行取樣檢查。離心機、酶聯(lián)免疫檢測儀、天平、PCR儀等第十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三PCR酶標(biāo)儀顯微鏡第十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件。2.2溫室第十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三1.2常用儀器與設(shè)備基本設(shè)備：水純化裝置、冰箱、天平、酸度計、電爐、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器、離心機及離心管、移液器（管）、吸管等。滅菌設(shè)備：蒸汽壓力滅菌鍋、電熱干燥箱、過濾除菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。無菌操作設(shè)備：超凈工作臺光溫控制設(shè)備：時間程序控制器、空調(diào)及溫度感應(yīng)器。第十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三細胞培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)設(shè)備根據(jù)需要而定，包括培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器等。細胞學(xué)鑒定設(shè)備：光學(xué)顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡等。除上述基本設(shè)備外，如果有條件和需要還可配制攝影設(shè)備、生化分析設(shè)備等。培養(yǎng)器皿及實驗用具：玻璃器皿、新型材料器皿及金屬材質(zhì)用具第二十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三超凈工作臺基本原理：將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾，由離心風(fēng)機壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的、均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū)，形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。側(cè)流式（或垂直式）超凈工作臺：凈化后的空氣氣流由左側(cè)（或右側(cè)）通過工作臺面流向?qū)?cè)，也有從上向下（或從下向上）流向?qū)?cè)，形成氣流屏障以保持工作區(qū)無菌；在凈化氣流和外邊氣體交界處可因氣流的流動出現(xiàn)負壓，使少許未凈化氣體混入，有發(fā)生污染的可能性外流式（或水平層流式）超凈工作臺：使凈化后的空氣面向操作者流動，外方氣流不致混入操作區(qū)；不能進行有害物質(zhì)實驗操作；因多為開放式，沒有防護擋板，操作和拿取物品方便，但可能受外界氣流流動的影響而引起不潔空氣混入。第二十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三用于細胞培養(yǎng)中的有些器械、器皿烘干使用、玻璃器皿干燥消毒溫度范圍：50~300℃實驗室常用：鼓風(fēng)式電熱干燥箱優(yōu)點：溫度均勻、效果較好；缺點：升溫過程較慢注意事項：1、升溫時不能先升溫后鼓風(fēng)，應(yīng)鼓風(fēng)與升溫同時開始，至100℃時停止鼓風(fēng)2、消毒后，不能立即打開箱門以免驟冷而致玻璃器皿損壞，應(yīng)等溫度自然下降至100℃以下時方可開門3、溫度過高可致包裹玻璃器皿的紙或棉花燒焦，燒焦碎屑影響細胞的生長電熱干燥箱第二十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三水純化裝置所有與培養(yǎng)細胞接觸的液體均需用純水配制；三次蒸餾水冰箱儲存各種溶液和短期保存組織標(biāo)本等；-20℃儲存需冷凍保持生物活性及較長時期存放的制劑，酶、血清、抗生素、谷氨酰胺等專屬專用，不存放揮發(fā)、易燃等對細胞有害的物質(zhì)保持清潔第二十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三壓力蒸汽消毒器直接或間接與細胞接觸的物品均須消毒滅菌處理內(nèi)熱源侵入式電加熱壓力蒸汽消毒器注意事項：嚴(yán)格按照操作說明執(zhí)行細胞計數(shù)板也稱血細胞計數(shù)板，進行培養(yǎng)細胞計數(shù)和活性細胞的觀察電子細胞計數(shù)儀自動計數(shù)細胞懸液中的細胞數(shù)，尤其適用于進行細胞生長曲線實驗第二十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三過濾除菌裝置適用對象：含維生素、蛋白質(zhì)、多肽、生長因子等物質(zhì)的人工合成培養(yǎng)液、血清、胰蛋白酶等，高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失活Zeiss濾器金屬，直徑142mm和293mm抽濾式（負壓）：進液口與一盛液瓶相連，緩慢使氣體回流，在抽濾瓶與真空抽氣泵之間連一個負壓瓶加壓式（正壓）：連一正壓泵或蠕動泵的密閉濾器，通N2氣體以造成容器內(nèi)壓力，使濾液濾過，調(diào)整N2壓力不超過19.6kPa；壓力比較恒定，濾過效果好，蛋白質(zhì)不易變性第二十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三玻璃漏斗式濾器濾板與玻璃漏斗為一體，根據(jù)濾板的孔徑可分為G1~G6幾種規(guī)格，僅G5和G6能達到濾過除菌的要求適用于各種培養(yǎng)液的過濾除菌，不宜過濾血清等粘稠液體；僅抽濾式，用后清洗麻煩微孔濾膜濾器換膜式濾器和一次性濾器微孔濾膜，孔徑0.1μm（可去除支原體）、0.22μm（除菌效果較保險）、0.45μm和0.8μm第二十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三離心機分離細胞、調(diào)整細胞濃度、洗滌、收集細胞等低速；高速（DNA、RNA提取）、大容量、控溫離心機（神經(jīng)細胞）移液管：玻璃、塑料材質(zhì)；1、2、5、10、20ml吸管移液器：微量移液器、多通道可調(diào)式微量移液器、電動移液器離心管：塑料和玻璃材質(zhì)天平第二十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

動物細胞工程實驗室的常用儀器設(shè)備有：培養(yǎng)箱：恒溫培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱（適合開放式或半開放式細胞培養(yǎng)，恒定提供定量CO2，通常使用條件為37℃、5%CO2）顯微操作儀：細胞核移植、染色體操作、顯微注射、胚胎切割等細胞融合儀：細胞融合細胞冷凍儲存器：程序化冷凍儀、液氮容器（液氮溫度低達-196℃，防止凍傷；液氮揮發(fā)，定期觀察，補充）培養(yǎng)用器皿手術(shù)器械：解剖、取材、剪切組織及操作時持取物件第二十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三培養(yǎng)用器皿透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃：多數(shù)細胞可生長，易于清洗、消毒，可反復(fù)使用，透明便于觀察；易碎、清洗時費人力無毒、透明光滑的特制塑料：一次性使用，方便；費用較高1）培養(yǎng)皿：玻璃或塑料制成，盛取、分離、處理組織或作細胞毒性、集落形成、單細胞分離、同位素摻入、細胞繁殖等實驗，常用規(guī)格3.5cm、6cm、9cm、10cm等2）培養(yǎng)瓶：培養(yǎng)細胞種類要求不同，形態(tài)各異；細胞傳代：瓶壁厚薄均勻，瓶口大小一致，口徑一般不小于1cm；規(guī)格有10ml、25ml、50ml、100ml、200ml等；外周血培養(yǎng)常用10ml普通原瓶第二十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三3）培養(yǎng)板：細胞培養(yǎng)、細胞克隆及各種檢測；常用規(guī)格有4孔、6孔、12孔、24孔、96孔等4）旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器：用于某些特殊細胞或需要收獲大量細胞的培養(yǎng)手術(shù)器械：解剖、取材、剪切組織及操作時持取物件；手術(shù)刀柄、手術(shù)剪、鑷子、止血鉗、持針器；各種器械至少配備兩套，使用后及時清洗，做防銹處理；高壓蒸汽消毒或75%酒精浸泡消毒第三十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三植物細胞工程實驗室的常用儀器設(shè)備有：光照培養(yǎng)箱：植物材料少量培養(yǎng)；光照、暗箱；調(diào)濕與不可調(diào)濕；人工氣候箱（全自動調(diào)溫、調(diào)濕、控光）人工氣候室：模擬自然界的各種氣象條件，精確控制室內(nèi)的溫度、光照、濕度、CO2等，在種子發(fā)芽、植物培養(yǎng)、組培、植保等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛搖床：細胞懸浮培養(yǎng)，常用振蕩速度100r/min培養(yǎng)瓶：玻璃三角瓶、試管、光口玻璃瓶；硼硅酸鹽玻璃器皿第三十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2.1動物細胞工程實驗室的常用儀器設(shè)備有：

培養(yǎng)箱（恒溫培養(yǎng)箱和CO2培養(yǎng)箱）、顯微操作儀、細胞融合儀、細胞冷凍儲存器（程序化冷凍儀和液氮容器）、培養(yǎng)用器皿、手術(shù)器械2.2

植物細胞工程實驗室的常用儀器設(shè)備有：

光照培養(yǎng)箱、人工氣候箱、搖床和培養(yǎng)瓶第三十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第2章清洗與消毒

離體培養(yǎng)的細胞對任何有害物質(zhì)都十分敏感，微生物、細胞碎片以及非營養(yǎng)性化學(xué)成分都可能影響細胞的生長，對培養(yǎng)器皿清洗與消毒的要求極為苛刻。因此，清洗和消毒是否徹底直接關(guān)系到細胞培養(yǎng)的成敗。掌握清洗、消毒知識，學(xué)會清洗、消毒方法是細胞培養(yǎng)工作的基本功。

第三十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三洗滌液的配制一、清洗第三十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三玻璃器皿：浸泡、刷洗、浸酸和沖洗

清洗后的玻璃器皿要求干凈、透明、無油跡，且無任何殘留物質(zhì)新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過夜（不可少于4h），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。使用過玻璃器皿：先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用（計量儀器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時后（或用去污粉擦洗），重新清洗。第三十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三膠塞清洗

新購置的瓶塞帶有滑石粉及雜質(zhì)。方法：先用自來水沖洗；每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH（洗衣粉）煮沸10~20min；自來水沖洗后，1%稀鹽酸浸泡30min，或蒸餾水沖洗后再煮沸10~20min，晾干備用。第三十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，無毒、特殊包裝優(yōu)點在生物學(xué)實驗中應(yīng)用越來越廣泛。第一次使用塑料器皿時，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH=1）清洗，接著依次用無離子水、1mol/LKOH和無離子水清洗，然后用10-3mol/LEDTA除去金屬離子的污染，最后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時，可只用0.5％的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。

使用過程中，注意：防止劃痕；用后及時浸泡塑料器皿的清洗第三十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。

金屬用品洗滌除菌過濾器洗滌

用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。包裝便于消毒、儲存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染第三十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

滅菌工作是極其重要的。對于初學(xué)者來說，首先應(yīng)建立有菌和無菌的概念

有菌的范疇：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超凈工作臺臺面，未處理的工具和手等。

無菌的范疇：高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等）

物理或化學(xué)處理；火烤后的物體；

健康的動植物不與外部表面接觸的組織內(nèi)部可能是無菌的（有時也有內(nèi)生菌，但不會影響培養(yǎng)，也不會污染）二、消毒第三十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三消毒方法物理滅菌法：紫外線、電離輻射、濕熱、干熱、過濾等化學(xué)消毒法：使用滅菌劑或抗生素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等1、紫外線消毒

適用于實驗室空氣、操作臺面和一些不能用于濕熱、干熱滅菌的培養(yǎng)器皿的消毒，如塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板破壞微生物的核酸和蛋白質(zhì)使其失活；臭氧殺死微生物主要是利用紫外燈進行照射，培養(yǎng)室燈距地面不超過2.5m，離工作臺面不超過1.5m，物品不互相遮擋。滅菌時間20~30min。

注意：關(guān)燈5min后再進入。超凈工作臺關(guān)燈后要打開風(fēng)機。第四十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2、電離輻射消毒使用放射性核素產(chǎn)生的X線和加速器等發(fā)出的輻射進行滅菌消毒適用于消毒量大和不適于做高壓或濾過等培養(yǎng)用品，如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、注射器、移液器槍頭、離心管等優(yōu)點：滅菌時物品不會升溫，可直接對密封包裝物品進行滅菌缺點：誘變作用很強，不適合消毒活的生物材料第四十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三3、濕熱消毒即高壓蒸汽消毒，使用最廣泛、效果最好的消毒方法常用物品消毒壓力及時間：培養(yǎng)液和橡膠制品115℃、10min；布類、玻璃制品及金屬器械為121.3℃、20min。4、干熱消毒法電熱烤箱溫度至160℃以上，保持90~120min，殺死細菌和芽孢適用于玻璃器皿消毒消毒完畢后不可馬上將烤箱門打開優(yōu)點：消毒后的器皿干燥、易儲存缺點：熱傳導(dǎo)慢；橡膠、塑料制品不能使用此法灼燒：酒精燈火焰對金屬器具及瓶口灼燒，如接種環(huán)、涂布棒第四十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三5、過濾除菌將液