現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)

現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)

主講教師：付保榮參考書：1.現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)王建龍文湘華編著清華大學(xué)出版社2.現(xiàn)代生物技術(shù)在環(huán)境工程中的應(yīng)用馮玉杰主編化學(xué)工業(yè)出版社第一章概述第一節(jié)生物技術(shù)概述一、生物技術(shù)（Biotechnology）“生物技術(shù)”一詞首先由匈牙利的KarlEreky于1917提出。他當時是指用甜菜作為飼料進行大規(guī)模養(yǎng)豬，即利用生物將原材料轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)品。

廣義：利用有機體的操作技術(shù)二、生物技術(shù)的發(fā)展可以劃分為三個不同的階段:

階段特征傳統(tǒng)生物技術(shù)釀造技術(shù)近代生物技術(shù)微生物發(fā)酵技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)以DNA重組技術(shù)的建立為標志的，

已成為一門多學(xué)科縱橫交叉的新興

和綜合性技術(shù)。1．現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展史1953年，美國生物學(xué)家沃森(Watson)和英國物理學(xué)家克里克(Crick)提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)分子模型。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)．標志著現(xiàn)代分子生物學(xué)的誕生，揭示了世界上千差萬別的生命物種個體在分子結(jié)構(gòu)和遺傳機制上的統(tǒng)一性，并為后來以DNA重組為主要手段的基因工程奠定了基礎(chǔ)。1973年，美國加利福尼亞大學(xué)舊金山分校的HerberBoyer教授和斯坦福大學(xué)的StanleyCohen教授合作進行了人類歷史上第一次有目的基因重組實驗。1975年，Kohler和Milstein創(chuàng)立了淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，獲得了單克隆抗體。2．現(xiàn)代生物技術(shù)涉及的學(xué)科基礎(chǔ)：生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、化學(xué)工程儀器分析：先進的儀器設(shè)備、檢測設(shè)備、分離純化設(shè)備、制造設(shè)備包括的相關(guān)領(lǐng)域：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、醫(yī)藥、家畜、海洋、食品、預(yù)防、診斷、環(huán)境圖1-1現(xiàn)代生物技術(shù)樹形圖二、現(xiàn)代生物技術(shù)義3．現(xiàn)代生物技術(shù)定義以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計改造或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達到某種目的。生命科學(xué)基礎(chǔ)：上述基礎(chǔ)學(xué)科先進的工程技術(shù)：基因工程、酶工程、細胞工程和發(fā)酵工程技術(shù)其他學(xué)科的科學(xué)原理：化工原理、工藝原理、微生物原理改造生物體：動物、植物、微生物加工生物原料；淀粉轉(zhuǎn)化餐盒、淀粉轉(zhuǎn)化乙醇生產(chǎn)所需產(chǎn)品：醫(yī)藥、食品、達到某種目的：預(yù)防、診斷、環(huán)境污染監(jiān)測圖1—2基因工程、酶工程、細胞工程與發(fā)酵工程之間的關(guān)系4．現(xiàn)代生物技術(shù)內(nèi)容基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程第二節(jié)環(huán)境生物技術(shù)一、環(huán)境生物技術(shù)的產(chǎn)生

是現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境污染防治的一門新興邊緣學(xué)科。它誕生于20世紀80年代末期，以高新技術(shù)為主體，并包括對傳統(tǒng)生物技術(shù)的強化與創(chuàng)新。環(huán)境生物技術(shù)涉從眾多的學(xué)科領(lǐng)域，主要由生物技術(shù)、工程學(xué)、環(huán)境學(xué)和生態(tài)學(xué)等組成。它是由生物技術(shù)與環(huán)境污染防治工程及其他工程技術(shù)緊密結(jié)合形成的，既只有較強的基礎(chǔ)理論，又具有鮮明的拄術(shù)應(yīng)用特點。

第二節(jié)環(huán)境生物技術(shù)二、環(huán)境生物技術(shù)的定義鑒于環(huán)境生物技術(shù)是一門新興學(xué)科，因此，對環(huán)境生物技術(shù)的定義也有多種。廣義上講，凡是自然界中涉及環(huán)境污染控制的一切與生物技術(shù)有關(guān)的技術(shù)，都可稱為環(huán)境生物技術(shù)。

是直接或間接利用生物或生物體的某些組成部分或某些機能，建立降低或消除污染物產(chǎn)生的生產(chǎn)工藝或者能夠高效凈化環(huán)境污染，同時又生產(chǎn)有用物質(zhì)的工程技術(shù)。環(huán)境生物技術(shù)

分為高、中、低三個層次

高層次：是指以基因工程為主導(dǎo)的現(xiàn)代污染防治生物技術(shù)，如基因工程菌的構(gòu)建，抗污染型轉(zhuǎn)基因植物的培育等。中層次：是指傳統(tǒng)的生物處理技術(shù)，如活性污泥法、生物膜法，及其在新的理論和技術(shù)背景下產(chǎn)生的強化處理技術(shù)和工藝，如生物流化床、生物強化工藝等。低層次：是指利用天然處理系統(tǒng)進行廢物處理的技術(shù)，如氧化塘、人工濕地系統(tǒng)等。

三、環(huán)境生物技術(shù)的研究范圍

現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)服務(wù)于環(huán)境保護，目前環(huán)境生物技術(shù)面臨的任務(wù)有：(1)解決基因工程菌從實驗室進入模擬系統(tǒng)和現(xiàn)場應(yīng)用過程中，其遺傳穩(wěn)定性、功能高效性和生態(tài)安全性等方面的問題；(2)開發(fā)廢物資源化和能源化技術(shù)，利用廢物生產(chǎn)單細胞蛋白、生物塑料、生物肥料以及利用廢物生產(chǎn)生物能源，如甲烷、氫氣、乙醇等；(3)建立無害化生物技術(shù)清潔生產(chǎn)新工藝，如生物制漿、生物絮凝劑、煤的生物脫硫，生物冶金等；(4)發(fā)展對環(huán)境污染物的生理毒性及其對生態(tài)影響的檢測技術(shù)。

第二章基因工程第一節(jié)基因?qū)W說的創(chuàng)立一、基因的提出

(1)創(chuàng)世說(2)進化論(3)細胞學(xué)說（4）經(jīng)典的生物化學(xué)和遺傳學(xué)孟德爾(GregorMendel)二、DNA的發(fā)現(xiàn)肺炎球菌的轉(zhuǎn)化實驗噬菌體侵染細菌的實驗三、DNA的結(jié)構(gòu)核苷酸(nucleotide)：堿基(base)、脫氧核糖、磷酸基三部分組成

三、DNA的結(jié)構(gòu)堿基：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、A=T、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)G=C

三、DNA的結(jié)構(gòu)

DNA分子的骨架

三、DNA的結(jié)構(gòu)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)示意圖

DNA的半保留復(fù)制

四、基因的結(jié)構(gòu)第二節(jié)基因工程的誕生和研究內(nèi)容一、理論上的三大發(fā)現(xiàn)

1．20世紀40年代，確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。2．20世紀50年代，揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機制，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞問題。3．20世紀60年代，提出了中心法則，成功破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流向和表達題。圖1-6中心法則示意圖中心法則(centraldogma)

轉(zhuǎn)錄:以DNA的雙鏈中的一條為模板，按互補方式合成RNA，這種遺傳信息由DNA到RNA的傳遞過程稱為轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄通翻譯:轉(zhuǎn)錄后的mRNA作為合成蛋白質(zhì)的模板，并且由mRNA的堿基排列順序決定多肽鏈中氨基酸的排列順序，遺傳密碼(geneticcode)系統(tǒng)密碼子：組成蛋白質(zhì)的氨基酸共有20種，mRNA上每三個堿基決定一個氨基酸，這種對應(yīng)于氨基酸的堿基三聯(lián)體稱為密碼子。1966年，人們已將全部三個堿基組合后的密碼子全部破譯出來。遺傳密碼是通用的二、技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn)1.DNA分子的體外切割和連接技術(shù)（標志著DNA重組時代的開始）（1）限制性內(nèi)切酶（2）DNA連接酶1967年2.DNA分子的核苷酸序列分析技術(shù)3.載體的使用三、基因工程的誕生1973年，Cohen等獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落TcrNer，標志著基因工程的誕生。Tetracycline

pSC101EcoRIDNALigaseKanamycin

R6-5Kanr

andTetr四、基因工程的發(fā)展史1973年被認為是基因工程誕生的元年1972年，美國斯坦福大學(xué)的P．Beng領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，在世界上第一次成功地實現(xiàn)了DNA的體外重組。

1973年，斯坦福大學(xué)的S．Cohen等人進行了另一重組DNA分子的實驗。1980年，P．Beng和S．Cohen獲得了諾貝爾生物學(xué)獎。美國生物化學(xué)家、現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人——P·伯格四、

基因工程的發(fā)展史1977年，E.coli中合成了人生長激素基因。1978-1979胰島素基因在大腸桿菌中表達。1982年，培育出了超級鼠。1985年Horsch發(fā)明了植物基因工程的基本方法：葉圓盤法，并獲得轉(zhuǎn)基因植株。四、基因工程的發(fā)展史

1990年，患有遺傳免疫疾病的4歲女孩接受了基因療法。1990年，Perlak將B.T.基因?qū)朊藁ǐ@得抗蟲棉。1991年，美國開始人類基因組計劃。1997年，“多利”綿羊誕生。轉(zhuǎn)移大鼠生長素基因的小鼠五、基因工程的概念1概念 按照預(yù)先設(shè)計好的藍圖，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，特別是酶學(xué)技術(shù)，對遺傳物質(zhì)DNA直接進行體外重組操作與改造，將一種生物（供體）的基因轉(zhuǎn)移到另外一種生物（受體）中去，從而實現(xiàn)受體生物的定向改造與改良。

基因工程的概念--廣義基因工程：DNA重組技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用。上游技術(shù)：外源基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（狹義基因工程）下游技術(shù)：含有外源基因的生物細胞（基因工程菌或細胞）的大規(guī)模培養(yǎng)以及外源基因的表達、分離、純化過程。genemanipulation,

genecloning,

binantDNAtechnology,geneticmodification,

newgenetics,

molecularagriculture2基本步驟：(切、接、轉(zhuǎn)、增、檢）施工材料的準備：目的基因、載體、工具酶和受體細胞（宿主）的準備。用限制性內(nèi)切酶分別將外源DNA和載體分子切開。目的基因與載體DNA的體外重組，形成重組DNA分子。把重組的DNA分子引入受體細胞，并建立起無性繁殖系。篩選出所需要的無性繁殖系，并保證外源基因在受體細胞中穩(wěn)定遺傳、正確表達?；蚬こ痰幕静襟E3.基因工程的基本原理分子遺傳、分子生物學(xué)以及生化工程學(xué)是基因工程原理的三大基石。一個完整的基因由三部分組成：啟動子、編碼序列與終止子。利用載體DNA在受體細胞中獨立于染色體DNA而自主復(fù)制的特性與載體分子重組，通過載體分子的擴增提高外源基因在受體細胞中的劑量，借此提高宏觀表達水平。這是涉及到DNA分子高拷貝復(fù)制以及穩(wěn)定遺傳的分子遺傳學(xué)原理。

基因工程的基本原理篩選、修飾和重組啟動子、增強子、終止子等基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。選擇、修飾和重組核糖體結(jié)合位點及密碼子等mRNA的翻譯調(diào)控元件，強化受體細胞中蛋白質(zhì)的生物合成過程?；蚬こ叹毎?/p>

是現(xiàn)代生物工程中的微型生物反應(yīng)器，在強化并維持其最佳生物效能的基礎(chǔ)上，從工程菌大規(guī)模培養(yǎng)的工程和工藝角度切入，合理控制微型生物反應(yīng)器的增值速度和最終數(shù)量，也是提高外源基因表達產(chǎn)物的主要環(huán)節(jié)。4.基因克隆需要特殊的工具和技術(shù)運輸工具：細菌質(zhì)粒病毒染色體DNA操作技術(shù)純化DNA 剪切DNA分子分析DNA片段大小連接DNA分子將DNA轉(zhuǎn)入受體細胞重組子的鑒定4基因工程的意義基因工程可以繞過遠緣有性雜交的困難，使基因在微生物、植物、動物之間交流，迅速并定向的獲得人類需要的新的生物類型。概括地講，其意義體現(xiàn)在以下三個方面：大規(guī)模的生產(chǎn)生物分子設(shè)計構(gòu)建新物種搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內(nèi)的遺傳信息。表1-1主要基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時間產(chǎn)品時間國家用途上市時間國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日巨人癥人胰島素1978美糖尿病1982歐人生長激素（HGH）1979美侏儒癥1985美人α-干擾素（IFN）1980美病毒1985歐乙肝疫苗（HBsAgV）1983美乙肝1986歐人白細胞介素1984美腫瘤1989歐人促紅細胞生成素（EPO）日貧血1988歐人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美5.基因工程的意義工業(yè)輕工業(yè)能源工業(yè)醫(yī)藥重組藥物基因治療檢測遺傳疾病、病原5.基因工程的意義農(nóng)業(yè)抗病蟲提高品質(zhì)提高花卉的觀賞價值抗逆性家畜 瘦肉比飼料利用率加快生長第三節(jié)基因工程的工具酶一、限制性內(nèi)切酶（Endonucleosase）1.限制性內(nèi)切酶（Endonucleosase）的發(fā)現(xiàn)

50年代初發(fā)現(xiàn)細菌能將外來DNA片段在某些專一位點上切斷，從而保證其不為外來噬菌體所感染，而其自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護，這種現(xiàn)象叫做限制－修飾，它們由三個基因位點所控制：hsdR,hsdM,hsdS,十年后，人們搞清了細菌的限制與修飾分子機理：

hsdR---限制性內(nèi)切酶

hsdM---限制性甲基化酶

hsdS---控制兩個系統(tǒng)的表達

1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株(HaemophilusInfluenzue)中分離出兩個類內(nèi)切酶，HindII和HindIII，為基因工程技術(shù)的誕生奠定了基礎(chǔ)。

截止到目前為止，已經(jīng)分離出400余種II類酶，搞清識別位點的有300種，商品化的約有一百種，而實驗室常用的有二十種。限制性內(nèi)切酶（Endonucleosase）2.限制性核酸內(nèi)切酶的分類：

可分為三大類

I類能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近切割雙鏈，但切割序列沒有專一性。

II類識別位點（回文序列）嚴格專一，并在識別位點內(nèi)將雙鏈切斷

III類識別位點嚴格專一（不是回文序列），但切點不專一，往往不在識別位點內(nèi)部。

因此在基因工程中具有實用價值的是II類限制性內(nèi)切酶。3.II類限制性內(nèi)切酶的命名及特性命名原則：取屬名的第一個字母大寫，取種名的前兩個字母小寫，構(gòu)成基本名稱。該種中發(fā)現(xiàn)的不同的酶按照順序編號I,II,III等。如存在變種和品系，取變種或品系的一個字母。若酶存在于質(zhì)粒上，則需大寫字母表示非染色體遺傳因子。

如，HindIII從HaemophilusInfluenzue(流感嗜血桿菌)d株中分離的第三個酶。EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗藥性R質(zhì)粒上。3.II類限制性內(nèi)切酶的底物識別順序及切割位點

絕大多數(shù)的II類限制性內(nèi)切酶在底物DNA上的識別順序長度為4，5，6堿基對，這些堿基對的順序呈回文結(jié)構(gòu)（Palindromic），而且切點就在其內(nèi)部，如EcoRI5‘-GAATTC-3’。

DNA被限制性內(nèi)切酶切開之后，呈現(xiàn)兩種口：

鈍端（平端）如PvuII,AluI,EcoRV等

粘端（粘性末端）如：EcoRI等圖2-1限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端4.識別位點在DNA分子中的頻率

對于特定的限制性酶在DNA分子中的識別位點數(shù)目是可以計算的，四堿基的酶平均大約每256個核苷酸（44）有一個識別位點，而六堿基的酶大約4096（46）個核苷酸有一個識別序列，計算是在假定核苷酸隨機排列的情況下進行的。實踐中這種方法不完全正確，如λDNA長49kb，對于六堿基的酶應(yīng)該有12個切割位點，實際上要少一些，如BglII只有6個，BamHI只有5個，而SalI只有2個。二、甲基化酶

在專一位點上甲基化，與限制性內(nèi)切酶相對應(yīng)。

1.大腸桿菌中的甲基化酶

dam甲基化酶:可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，這樣可使一些識別順序中含有5'GATC3'的限制性內(nèi)切酶不能切割來自大腸桿菌的DNA如BclI（TGATCA），但BamHI（GGATAA）則不會因為N6A的甲基化而失去活性，因為這兩種酶對底物的特異性不同。

dcm甲基化酶此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影響的限制性內(nèi)切酶是EcoRII。

2.甲基化酶在基因工程中用途

許多II類限制性內(nèi)切酶，都存在著相對的甲基化酶，它們可修飾限制酶識別順序中的第三位腺嘌呤上，封閉酶切位點，從而使其免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基轉(zhuǎn)移到EcoRI識別順序中的第三位腺嘌呤上，從而使DNA免受EcoRI的切割。三、T4-DNA連接酶（T4-DNALigase）

來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，連接修復(fù)3'端羥基和5'端磷酸基因，脫水形成3'-5'磷酸二酯鍵

連接雙鏈DNA上的單鏈缺口（Nick），因此亦可連接限制內(nèi)切酶所產(chǎn)生的粘性末端

連接RNA模板上的DNA鏈缺口

連接平頭雙鏈DNA速度很慢，在高濃度的底物和酶的作用下方可進行，這屬于分子之間的連接.圖2-2連接酶的作用方式四、核酸酶

作用:降解磷酸二酯鍵

分為：外切酶內(nèi)切酶

1.Bal31(來自于細菌Alteromonasespejiana)

單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性，雙鏈特異的內(nèi)切酶活性。依賴于Ca2+

用途：

構(gòu)建限制酶圖譜

產(chǎn)生末端缺失突變

DNA超螺旋線性化

2.E.coli外切酶III

只降解DNA分子的一條鏈，產(chǎn)生單鏈的DNA分子。四、核酸酶3.S1核酸酶（來源于米曲霉菌）

特性：

(1).降解單鏈DNA或RNA，降解DNA的速度大于降解的速度

(2).降解發(fā)生的方式為內(nèi)切和外切

(3).酶切活性需4.0-4.5pH環(huán)境，Zn2+激活

(4).酶量過大時會降解雙鏈核酸，因為雙鏈降解活性比單鏈低75000倍4.DNaseI:來自于牛胰腺,

既可以降解單鏈也可以降解雙鏈，沒有特異性，產(chǎn)生單核苷酸或短鏈五、聚合酶1.DNA聚合酶I

5’-3’聚合酶活性

3’-5’外切酶活性

5’-3’外切酶活性

核酸內(nèi)切酶活性

可以被枯草桿菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。

圖2-3DNA聚合酶I

五、聚合酶2.Klenow酶

該酶無5'-3'外切活性，保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性，基因工程中利用該酶：

修復(fù)限制性內(nèi)切酶造成的5'突出的粘性末端

標記DNA探針

催化cDNA第二條鏈的合成

末端終止法測序

圖2-4Klenow酶的作用方式五、聚合酶3.T4DNA聚合酶

與Klenow酶相似，外切酶活性更高。體外誘變反應(yīng)中效率很高。4.T7DNA聚合酶

測序酶5.TaqDNA聚合酶

耐高溫，主要用于PCR反應(yīng)。

五、聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶：將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA

(1)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（鳥類成髓細胞性白血病病毒）

DNA聚合酶活性

RNaseH活性

DNA內(nèi)切酶活性

核酸結(jié)合活性

(2)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Moloney鼠白血病病毒）兩種逆轉(zhuǎn)錄酶的區(qū)別

肽鏈的組成

禽酶2條肽鏈，具聚合酶和很強的RNaseH活性

鼠酶1條，較弱的RNaseH活性

反應(yīng)的最適溫度

禽酶42°C，二級結(jié)構(gòu)豐富RNA，禽酶效率高

反應(yīng)的最適pH值

禽酶pH8.3

鼠酶pH7.6

六、DNA修飾酶

有大量的修飾酶，主要的有以下幾種：堿性磷酸酯酶（來自于大腸桿菌或小牛腸道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基團。

polynucleotidekinase:來自于T4侵染的大腸桿菌，在5’端增加磷酸基團。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）來自于小牛胸腺組織，在DNA分子的3‘端增加一個或多個脫氧核苷酸。

Topoisomerase改變共價閉合雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)第四節(jié)DNA的切割反應(yīng)

一、緩沖系統(tǒng)的組成

II類酶的酶活條件：Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)-HClPH7.5,25-50mM；10mMMgCl2；NaCl0-150mM；DTT(二巰基蘇糖醇)1mM

根據(jù)不同酶對鹽離子要求不同，可將緩沖液分為以下三種情況：

高鹽：100-150mM

中鹽：50-100mM

低鹽：0-50mM

二、酶切操作DNA量的確定;加入酶量的確定，反應(yīng)體積的確定（20μl），反應(yīng)時間的確定，1-1.5hr，一般為37℃，但也有例外，如TaqI(耐熱性DNA聚合酶，)在65°C時活性最高。單位限制性內(nèi)切酶定義為：在最佳緩沖系統(tǒng)和20μl體積中反應(yīng)1小時，完全水解1μgDNA所需的酶量例子：分子量94KD，催化5'→3'DNA合成，DNA聚合時的延伸速度是所有嗜熱DNA聚合酶中最快的，理想狀態(tài)下為2~4kb/min，可以很好地擴增10kb以下的片段。其最佳反應(yīng)溫度70~75℃，dNTPs的工作濃度為100~300μM，最佳Mg2+濃度為2~3mM，最佳pH為8.1~9.1，其PCR產(chǎn)物含3'端單個dA，能進行T-A克隆。DNA擴增（PCR）時，20μl反應(yīng)體系需1~1.5unit，50μl反應(yīng)體系需2~3units。

。三、酶切結(jié)果分析

1.

酶切片段的檢測

1）通過凝膠電泳分離，根據(jù)分子量分離。根據(jù)凝膠的濃度可以分離不同分子量的片段，聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分離1-300bp的分子。

2）DNA分子的檢測a.染色EB（Ethidiumbromide，溴化乙錠），DNA分子小于25ng，很難檢測到

GoldViewTM核酸染料

b.放射性自顯影,可以監(jiān)測少到2ngDNA分子。

2.估計DNA分子的大小

根據(jù)DNA分子的遷移率，可以用公式計算出分子量D=a-b(logM)

D是移動的距離，M是分子量，a,b是恒量但隨著電泳條件的改變而改變。

也可以根據(jù)已知大小的片段進行比較，誤差約在5%左右。

四、多酶聯(lián)合酶解

對于對濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶解；

對于對濃度要求不同的酶，可以：

1.低鹽濃度的酶先切，后補加NaCl

2.一種酶切后，換緩沖液，加5mMNaAc0.1體積，2體積乙醇，冰浴5min，4℃離心10min，干燥

五、定位酶切位點

建立酶切圖譜需要一系列的酶。

首先確定每一種酶切后產(chǎn)生的分子量和片段的數(shù)目；

然后進行雙酶切；

比較酶切和雙酶切的結(jié)果，繪制酶切圖譜；

含糊的位點可以通過部分酶切解決，可以短時間的酶切或者在4°C條件下進行。六、限制性內(nèi)切酶的star活性

在PH不合適，或甘油濃度過高≥10%時，限制性內(nèi)切酶的切割位點會出現(xiàn)非專一性，因此應(yīng)確保酶的體積為總體積的十分之一以下。

第五節(jié)DNA片段的連接一、連接方式

1.相同粘性末端的連接

來源:

相同的酶

同尾酶

問題:

極性有兩種可能

同尾酶連接后，不能用任何一種酶酶切。稱為“焊死”。

連接方式2.平頭末端的連接

粘性末端--分子內(nèi)部連接，平頭末端--分子間的連接。

提高連接效率的方法：

加大酶用量（10倍）

加大平頭末端底物的濃度

加入10%PEG（8000），促進分子間的有效作用

加入單價陽離子，150-200mMNaCl

提高反應(yīng)溫度

平頭連接同樣存在兩種極性

連接方式3.不同粘性末端的連接

突出5'末端

Klenow補平，或S1核酸酶切平，然后平頭連接

突出3'末端

T4-DNApol切平，然后平頭連接

突出末端不同

Klenow補平，或S1核酸酶切平

連接后，可能恢復(fù)限制性位點，甚至還可能產(chǎn)生新的位點。XbaI與HindIII（XbaI恢復(fù)），XbaI與EcoRI（均保留），BamHI與BglII（產(chǎn)生ClaI位點）

連接方式4.人工粘性末端的連接

5'突出的末端

外源片段先用Klenow補平；然后用TdT補加polyC；載體片段也用Klenow補平，加polyG，退火不經(jīng)連接即可轉(zhuǎn)化。目的是：不使酶切位點遭受破壞。

3'突出的末端

外源片段先用TdT加polyG；載體片段加polyC；然后退火；再用Klenow補齊；連接

平頭末端

可直接用TdT補加末端，但以加polyA/T為佳。這樣稍微加熱，AT區(qū)就會出現(xiàn)單鏈區(qū)域，然后用S1核酸酶水解即可回收片段連接方式5.粘端與平端的連接

linker:人工合成的、含有限制性內(nèi)切酶識別序列的、短的雙鏈DNA片段。

–連接的效率較高

–酶切時可能破壞DNA分子的完整。

adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。圖2-5linker的連接方式

連接方式6.粘性末端的更換

在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口

–BamHI酶切片段用Klenow補平，或用S1酶切平；連接一段linker或Adaptor，使之產(chǎn)生EcoRI粘性末端。這樣BamHI切口就換成了EcoRI切口。

–由AluI更換EcoRI：AluI切開，T4-DNApol切平，另一段DNAEcoRI切開，Klenow補平，連接，原來含有AluI的片段變成含有EcoRI二、重組率1.重組率連接反應(yīng)結(jié)束后，含有外源DNA片段的重組分子數(shù)與加入的載體分子數(shù)之比。較為理想的重組率為25-75%2.提高重組率的方法

連接反應(yīng)條件外源片段：載體＝2:1-10:1（分子數(shù)），增加碰撞機會，減少自身環(huán)化。

載體除磷（磷酸酯酶5’除磷）。

TdT在3’端增加人工粘性末端，防止載體自我環(huán)化。第六節(jié)載體的功能及其特征載體：攜帶外源DNA進入宿主細胞的工具。一、載體的功能1.運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞

2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力

3.為外源基因的擴增或表達提供條件二、載體應(yīng)具備的條件

1.具有對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性

2.具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點

3.長度盡可能小，以提高其載裝能力

4.具有多種單一的酶切位點

5.具有合適的選擇性標記

圖2-6自主復(fù)制型載體和附加載體的擴增方式

三、質(zhì)粒質(zhì)粒是存在于細菌細胞質(zhì)中獨立于染色體而自主復(fù)制的共價、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA），并不是細菌生長所必需的，但可以賦予細菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力。分子量在1-200kb之間。1.質(zhì)粒的基本特性

（1）自主復(fù)制性

質(zhì)粒DNA攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori）以及一個控制質(zhì)粒拷貝數(shù)的基因，因此它能獨立于宿主細胞的染色體DNA而自主復(fù)制。不同的質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)的拷貝數(shù)也不同，少則幾個多則幾百個不等，當然由于質(zhì)粒上并沒有復(fù)制酶的基因，所以其復(fù)制需要使用宿主細胞復(fù)制染色體DNA的多種酶群。

（2）不相容性

利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（RNAIRNAIIRop因子）如果被導(dǎo)入同一細胞中，它們在復(fù)制及隨后分配到子細胞的過程中，就會彼此競爭，它們在單細胞中的拷貝數(shù)也會有差異，拷貝多的復(fù)制更快，結(jié)果在細菌繁殖幾代之后，細菌的子細胞中絕大多數(shù)都含有占優(yōu)勢的質(zhì)粒，因而這兩種質(zhì)粒中只能有一種長期穩(wěn)定地留在細胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性。

1.質(zhì)粒的基本特性（3）可擴增性

質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類：松弛型復(fù)制及嚴謹型復(fù)制。pMB1或ColEI類質(zhì)粒復(fù)制子的復(fù)制完全依靠宿主細胞提供的半衰期較長的復(fù)制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的產(chǎn)物），因此在蛋白質(zhì)合成中斷時，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復(fù)制時，帶有pMB1或ColEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個細胞可以積聚2000-3000個拷貝，這叫做氯霉素擴增。

但另外兩種質(zhì)粒（psc101和p15A）和的復(fù)制子的復(fù)制受質(zhì)粒上編碼的蛋白因子的正調(diào)節(jié)。氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成后，這類質(zhì)粒便不能持續(xù)復(fù)制。（4）可轉(zhuǎn)移性

在天然條件下，很多天然質(zhì)粒都可以通過細菌接合作用從一種宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)，這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的tra基因產(chǎn)物。2.質(zhì)粒的構(gòu)建

（1）天然存在的兩種質(zhì)粒

1）colE1宿主細菌大腸桿菌6.5kb松弛型復(fù)制20-30/cell

2）pSC101宿主細菌沙門氏菌8.8kb嚴謹型復(fù)制5copy/cell標記基因為Tcr質(zhì)粒的命名p小寫代表質(zhì)粒；后面有兩至三個大寫字母代表發(fā)現(xiàn)者或構(gòu)建者的姓名。

（2）質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的

天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對之進行改造構(gòu)建：

1）加入合適的選擇標記基因，如兩個以上，易于用作選擇

2）增加或減少合適的酶切位點，便于重組

3）縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量

4）改變復(fù)制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝

5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件

方法就是重組，拼拼接接，挖肉補瘡。

3.質(zhì)粒的分類（1）根據(jù)質(zhì)?；蚓幋a的特性將質(zhì)粒分為五大類：

1).Fertility/F質(zhì)粒：只含有tra基因，除了促進接合轉(zhuǎn)移外沒有其他功能。

2).Resistance/R質(zhì)粒：含有氯霉素、青霉素或水銀抗性基因。如RP4，發(fā)現(xiàn)于假單胞桿菌。

3).Col質(zhì)粒：編碼大腸菌素，可以殺死其他細菌，如存在于E.coli中的CoE1。

4).降解質(zhì)粒（Degradativeplasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水楊酸。

5).致瘤質(zhì)粒（Virulenceplasmids）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒

圖2-7利用抗性基因進行重組子的篩選

3.質(zhì)粒的分類（2）人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為:

1).多拷貝質(zhì)粒復(fù)制子經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達到每個細胞數(shù)千，用于擴增外源基因。

2).測序質(zhì)粒

3).整合質(zhì)粒裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因準確重組整合入受體細胞的染色體上

4).穿梭質(zhì)粒含有兩個不同的復(fù)制子，能在兩種不同的受體細胞中復(fù)制

5).表達質(zhì)粒裝有強的啟動基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細胞內(nèi)的高效表達

6).探針質(zhì)粒篩選克隆或?qū)ふ一蛟?，通常裝有一個可以定量測定其表達的標記基因，如抗性基因。篩選啟動基因、終止子等。4.實驗室常用質(zhì)粒

（1）pBR322

該質(zhì)粒具有以下優(yōu)點：

1）分子大小4363bp，容易純化。

2）含有2個抗生素抗性基因，可以作為選擇標記。而且每一個標記基因都含有單一的酶切位點，可以插入DNA，amp基因內(nèi)可被PstI,PvuI,SacI切開，而四環(huán)素抗性基因可被BamHI,HindIII切開，通過插入失活篩選重組子。

3）受體細胞內(nèi)，pBR322以多拷貝存在，一般一個細胞內(nèi)可達到15個，而在蛋白質(zhì)合成抑制劑存在條件下，可達到1000-3000拷貝，如氯霉素。可以產(chǎn)生大量的重組pBR322分子。圖2-8pBR322的結(jié)構(gòu)

（2）pBR327一個多拷貝質(zhì)粒

pBR327是在pBR322的基礎(chǔ)上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段，但改變了質(zhì)粒的復(fù)制和接合能力。他與pBR322還要有兩點不同：

1）pBR327比pBR322有更高的拷貝，每個細胞中含有30-45個拷貝。但正常細胞中較高的拷貝數(shù)，使它適合于應(yīng)用于基因功能研究。

2）剪切破壞了pBR322的接合能力，pBR327不具有接合能力，不能直接轉(zhuǎn)入其他細胞。這對生物biologicalcontainment是非常重要的（生物防范）。

圖2-9pBR327的結(jié)構(gòu)

（3）pUC8—Lac選擇質(zhì)粒

pUC8也來自于pBR322，但只保留了復(fù)制起點和ampR位點，ampR基因的序列已改變限制性位點不再存在，所有的克隆位點集中在lacZ’基因內(nèi)的一個小片段上。

pUC8的優(yōu)點：

1）突變位點位于復(fù)制起點，復(fù)制前可以使細胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)達到500-700個，可以提高載體的產(chǎn)量。

2)重組子的鑒定可一步完成，固體培養(yǎng)基中添加amp和X-gal,IPTG，節(jié)約了一半的時間。

3）pUC8的多克隆位點，可以使具有不同粘端的DNA片段插入載體，而不必連接linker。

4）載體中的多克隆位點與M13mp系列的載體是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接轉(zhuǎn)入M13mp載體，可以進行DNA測序和體外定點突變。圖2-510pUC8的結(jié)構(gòu)圖

（4）pGEM3Z-DNA的體外轉(zhuǎn)錄

pGEM3Z與pUC載體非常相似，不同的是pGEM3Z含有兩段額外的短的DNA片段，每一段可以作為RNA聚合酶的識別位點。這兩段啟動子存在于限制性內(nèi)切酶的兩端，這意味著如果在重組的pGEM3Z載體中加入RNA聚合酶，可以發(fā)生轉(zhuǎn)錄，合成的RNA可以作為探針使用，或者研究RNA的加工過程或者蛋白質(zhì)的合成。

2-11

pGEM3Z載體的結(jié)構(gòu)及外源DNA的轉(zhuǎn)錄4.質(zhì)粒的制備

實驗室一般使用兩種方法制備質(zhì)粒：

（1）堿裂解法

1）將菌體懸浮在含有EDTA的緩沖液體中

2）加溶菌酶裂解細菌細胞壁

3）加NaOH與SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)

5）離心取上清液，用苯酚－氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質(zhì)及核酸酶

6）乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒

7）無DNase的RNase處理殘余RNA

用此方法制備的質(zhì)粒較純，收得率高，但繁瑣，且質(zhì)粒中有開環(huán)現(xiàn)象4.質(zhì)粒的制備（2）沸水浴法

（1）將菌體懸浮浮在含有EDTA和TritonX-100的緩沖液中

（2）加溶菌酶破細胞壁

（3）放入沸水浴中煮40秒

（4）離心，用無菌牙簽挑去沉淀物

（5）乙醇異丙醇沉淀

用此法制備的質(zhì)粒不純，收得率低，且制備規(guī)模小，但快速，特別適用于重組質(zhì)粒的鑒定。圖2-12細菌DNA的提取

圖2-13質(zhì)粒DNA提取方法圖2-14CsCl梯度離心法純化質(zhì)粒DNA四、以噬菌體DNA為基礎(chǔ)的載體

1.λDNA載體

（1）λ噬菌體的分子生物學(xué)

λ噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和λ-DNA組成

1)λ-DNA的物理圖譜λ-DNA為線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個12核苷酸的互補單鏈（粘性末端）GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，稱為cos區(qū)，全長48.5kb。

特點:是功能相近的基因在基因組中聚集在一起。例如，所有的編碼外殼蛋白的基因都聚集在左端1/3處；控制基因組整合到寄主基因的基因位于分子中央；右端是負責裂解宿主細胞、DNA自主復(fù)制以及調(diào)控的基因；相關(guān)基因的聚集對λ基因組的表達是非常重要的，這能夠使他們一起啟動或關(guān)閉，而不是單獨起作用。圖2-15cos位點的作用2）感染周期

噬菌體通過特殊的生物學(xué)方式感染宿主細胞，將其DNA導(dǎo)入

（1）吸附吸附于大腸桿菌外膜上的LamB受體（正常功能是運轉(zhuǎn)麥芽糖進入細胞內(nèi)），麥芽糖可誘導(dǎo)這些受體的合成，故它也可促進λ噬菌體的吸附與感染（尾部吸附）。

（2）DNA注入

（3）DNA復(fù)制從單一ori區(qū)滾筒復(fù)制，形成線狀多聯(lián)體，λ-DNA上兩個基因的產(chǎn)物激活復(fù)制的起始，但復(fù)制所需的蛋白因子系統(tǒng)則由宿主細胞提供。

（4）包裝包裝蛋白在宿主細胞內(nèi)合成，包裝蛋白首先結(jié)合在cos區(qū)的附近，形成包裝啟動復(fù)合物，因此cos區(qū)對包裝是至關(guān)重要的。

包裝時由一個蛋白因子將cos區(qū)切開，從而保證只有一個DNA線狀負責被保證在一起，每個宿主細胞可包裝多達100個成熟的λ-DNA分子，包裝對DNA本身的性質(zhì)無關(guān)，但對其大小要求比較嚴格，它只能包裝λ-DNA分子的75%-105%，也就是說可以包裝36.4kb-50.9kb范圍內(nèi)的DNA，包裝好了的λ-DNA便形成成熟的噬菌體顆粒。

（5）裂解每個細胞內(nèi)容納了多達100個成熟的噬菌體，這時兩種負責裂解宿主細胞的蛋白被合成，細菌細胞被裂解，成熟的噬菌體釋放出去，又去感染另外的宿主細胞，直至大腸桿菌細胞全部被裂解。圖2-16

λ噬菌體的侵染循環(huán)（2）λ－DNA載體的構(gòu)建

1）λDNA分子只能增加5%的大小，意味著只能插入3kb的DNA分子。

2）λ基因組非常大，對于每一種酶來講都含有超過1個的識別序列，酶切后產(chǎn)生多個片段，連接不能形成λ基因組。建立λ克隆載體前需要解決2個問題

Ⅰ.

縮短長度

野生型λ－DNA包裝的上限為50.5kb，本身長度為48.5kb，那么外源DNA片段允許插入的大小至多為2.4kb，這樣才能被包裝成有感染能力的噬菌體顆粒，如果將縮短便提高裝載量。其實λ－DNA上約有40-50%的DNA片段是復(fù)制，裂解所不必需的，將之切除便可提高載量。Ⅱ.修飾酶切識別位點

天然的λ-DNA上有多個酶切位點，如：EcoRI5個，HindIII7個，這些多余的酶切位點必須被修飾。一般利用自然選擇法獲得限制性位點缺失的λ品系。自然選擇法可以利用一個產(chǎn)生EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細胞的λDNA分子會被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其EcoRI位點缺失了。（3）λ-DNA的抽提

1)大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（在含有乳糖的培養(yǎng)基中）

2)加入λ-噬菌體或重組λ－噬菌體懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時

3)用新鮮培養(yǎng)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時

4)高速離心，沉淀噬菌體

5)苯酚抽提，釋放λ-DNA

6)乙醇或異丙醇沉淀DNA（4）λ-DNA作為載體的優(yōu)點

1)λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌

2)λ-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量

3)重組λ-DNA的篩選較為方便

4)重組λ-DNA分子的提取比質(zhì)粒容易

五、考斯質(zhì)粒（粘性質(zhì)粒，cosmid）

1.考斯質(zhì)粒的構(gòu)建

λ-DNA載體的最大裝載量為25kb,有的往往需要構(gòu)建克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒就是應(yīng)這種需要而人工組建的。

考斯質(zhì)粒顧名思義就是含有λ-DNA兩端cos區(qū)的質(zhì)粒。由于λ-DNA包裝時，其包裝蛋白只識別粘性末端附近的一小段順序，約1.5kb長。如果將這一小段DNA與質(zhì)粒連在一起，則這個重組質(zhì)粒就可裝載更大的外源DNA片段，同時它仍可象λ-DNA一樣，被包裝成有感染活性的噬菌體顆粒，并高效感染大腸桿菌，與噬菌體DNA所不同的是，考斯質(zhì)粒不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細胞，它的制備與質(zhì)粒相同。進入細胞后，質(zhì)粒上的復(fù)制子進行復(fù)制。圖3-17Cos質(zhì)粒pJB8

2.考斯質(zhì)粒的優(yōu)越性

1)能象λ-DNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細胞

2)可以裝載比質(zhì)?；颚?DNA大得多的外源DNA片段，如cos區(qū)及附近順序長為1.7kb，質(zhì)粒長為3.3kb，則該考斯質(zhì)粒最大可裝載46.5kb的外源DNA

3)由于攜帶質(zhì)粒的選擇標記，便于篩選

4)由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點，便于克隆。六、M13-DNA

1.M13單鏈噬菌體的分子生物學(xué)

M13是一種線狀、單鏈DNA噬菌體，總長6407bp。M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。噬菌體首先吸附大腸桿菌的雄性鞭毛上，然后穿過鞭毛內(nèi)孔將DNA注入細菌體內(nèi)。單鏈DNA利用宿主細胞的復(fù)制另一條鏈（負鏈），形成雙鏈DNA（RFDNA），然后以負鏈為模板，滾筒式復(fù)制串聯(lián)式上鏈分子，當拷貝數(shù)達到100-200時，負鏈上的基于產(chǎn)物干擾復(fù)制，使其停止，同時，由兩條鏈上編碼的蛋白基因表達，包裝正鏈，并分泌至體外，宿主細胞不會發(fā)生裂解。細菌細胞每分裂一次，大約可以釋放1000個新的病毒顆粒。2.M13-DNA載體家族

1.M13mp載體家族

M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)域，因而載體的構(gòu)建主要是插入標記基因如，lacZ‘、多克隆位點，消除多余的酶切位點。在M13上引入lacZ’基因，產(chǎn)生了M13mp1，這樣就可以通過插入失活鑒定重組噬菌斑。

M13mp1載體不含有任何的單一切點的的識別序列，在基因的起始端，含有6堿基的序列GCATTC，是一個EcoRI位點，這是通過體外定點突變獲得的，產(chǎn)生了M13mp2。M13mp2是最簡單的M13克隆載體，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位點，在X-gal培養(yǎng)基上可以很容易的區(qū)別出來。

M13載體的構(gòu)建的第二步是將限制性內(nèi)切酶位點引入lacZ’基因，這一步是通過合成短的多聚核苷酸稱為polylinker，含有一系列的限制性位點和EcoRI粘端，完成的。多聚接頭插入到M13mp2的EcoRI位點上，就產(chǎn)生了M13mp7。

2.噬菌粒（Phagemid）

質(zhì)粒與M13-DNA的重組體，它帶有質(zhì)粒上的酶切位點及標記基因，這樣更于篩選及克隆，同時由于不含包裝蛋白基因，載體本身長度減少，裝載量增大，比質(zhì)粒大，但不及λ-DNA。3.M13-DNA作為載體的優(yōu)點及用途

最為顯著的優(yōu)點是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈，用途：

（1）用于雙脫氧末端終止測定DNA順序

（2）用于單鏈DNA的定點誘變

（3）用于合成探針第七節(jié)重組DNA的轉(zhuǎn)化與篩選

載體與目的基因連接后，體系中可能存在下列分子：

a.未連接的載體分子

b.未連接的DNA片段

c.載體的自連

d.含有錯誤插入片段的重組DNA分子

e.重組DNA分子

轉(zhuǎn)化過程中，這些分子同時被轉(zhuǎn)移到宿主細胞內(nèi)。未連接的分子即使被細菌攝取，只有在特殊的條件下才能復(fù)制，寄主的酶可降解這些DNA片段。自連的載體和錯誤插入的重組質(zhì)粒可以進入宿主細胞進行正常的復(fù)制。因此，需要將重組克隆鑒定出來。一、細菌的轉(zhuǎn)化方法自然界中，轉(zhuǎn)化并不是細菌獲得遺傳信息的主要方式，實驗室中只有小部分的細菌可以很容易的轉(zhuǎn)化，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這類細菌含有DNA結(jié)合和吸收的代謝機制。正常條件下，大部分細菌包括大腸桿菌，只能吸收有限的DNA，為了提高轉(zhuǎn)化效率，建立了一系列的轉(zhuǎn)化方法：

a.熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞

b.PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

c.高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化

d.顯微注射法轉(zhuǎn)化

e.接合轉(zhuǎn)化

f.噬菌體轉(zhuǎn)染表4—1大腸桿菌常用轉(zhuǎn)化方法的比較轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率Ca誘導(dǎo)107-8原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-6噬菌體轉(zhuǎn)化107-8電穿孔法106-9（<100Kb）結(jié)合轉(zhuǎn)化104-5

圖4-1熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的過程1.受體細胞應(yīng)具備的條件

a.限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、內(nèi)切酶）

b.重組整合缺陷型RecA-（對于用于基因擴增或基因高效表達的受體）

c.具有較高的轉(zhuǎn)化效率

d.具有與重組體互補的遺傳性狀

e.感染與寄生缺陷型安全角度的要求。

2.大腸桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化的突破發(fā)生在1970s的早期，研究發(fā)現(xiàn)，在冷的鹽溶液中轉(zhuǎn)化的效率提高。一般利用50mM的CaCl2，其他的鹽如氯化銣也有較高的效率。經(jīng)過處理的細胞稱為感受態(tài)細胞。

感受態(tài)細胞(Competentcells):受體細胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細胞(competentcell)。3.篩選轉(zhuǎn)化細胞

感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化不是一個高效的過程，雖然1ng的pUC8可以產(chǎn)生1000-10000個轉(zhuǎn)化子，意味著只吸收了0.01%的DNA分子。所以必需篩選轉(zhuǎn)化細胞。1.利用抗生素的插入失活篩選轉(zhuǎn)化子

2.lacZ’基因的插入失活（藍白斑篩選）

載體：含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的調(diào)控序列和頭146個aa的編碼序列

宿主：缺失了lacZ’基因，可編碼β-半乳糖苷酶C端序列

α-互補：lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體可以與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶隱性突變體之間實現(xiàn)互補。二、

轉(zhuǎn)化子的鑒定通過插入失活可以初步篩選重組子，但篩選到的克隆是否插入了正確的片段，還需要進一步的鑒定，鑒定的方法主要有如下幾種情況：

1限制性內(nèi)切酶法：外源片段通過特定的酶切位點插入到載體上，因此，可以通過這些限制性酶酶切重組質(zhì)粒，電泳分析插入片段長度是否正確。

2PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通過PCR的方法進行鑒定

3菌落原位雜交法：將在后面的章節(jié)中提到。

4基因產(chǎn)物檢測法：如果使用的是表達載體，那么就可以通過鑒定基因產(chǎn)物的方法鑒定正確的克隆。第八節(jié)克隆基因的方法克隆基因的方法有很多，根據(jù)研究基礎(chǔ)的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因：

1.PCR或RT-PCR法

2.從基因文庫中分離基因

3.從cDNA文庫中分離基因

4.轉(zhuǎn)座子標簽法

5.圖位克隆法

6.差減雜交法、扣除雜交、差異顯示法

7.人工合成法

一、從基因文庫中選擇基因1.基因文庫

基因文庫：是某種特定的生物所含有的能夠包含所有基因的足夠數(shù)目的克隆的集合。基因文庫是通過純化細胞總DNA，然后利用特定的限制性酶酶切產(chǎn)生能插入載體的片段，一般是λ替換載體、粘?；蛘呤荵AC。圖5-21基因文庫的構(gòu)建過程二、PCR法1.

PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)PCR是從復(fù)雜的材料中擴增特殊DNA序列的強有力的技術(shù)。因此，除構(gòu)建基因組文庫外，還可以用采用特異引物的PCR直接從基因組DNA中分離基因。然而，PCR標準條件的一系列限制是它僅對較短產(chǎn)物的擴增有效。PCR酶持續(xù)合成能力的不足，及它們校正能力的缺乏，加上PCR所要求的特殊的反應(yīng)條件也可能對堿基造成損傷都增加了長模板中過早突變的可能性。圖2.7聚合酶鏈式反應(yīng)。2.影響PCR的關(guān)鍵因素PCR的特異性關(guān)鍵是由引物決定的。以下因素對選擇有效引物很重要c1．引物長度應(yīng)該在17—30個核苷酸之間。2．GC的理想含量力50％。對Gc含量偏低的引物，最好選擇較長的引物以避免變件溫度偏低。3．應(yīng)該避免具有單核苷酸長重復(fù)(即大于3或4個)的序列。4．最好不采用有明顯二級結(jié)構(gòu)的引物。5．兩引物之間不得互補。大部分符合這些標準的引物可以有效地參與反應(yīng)，但即使在最優(yōu)的條3.RT一PCR為了將PCR方法用于研究RNA及RNA樣品．必須首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄變?yōu)閏DNA．從而為熱穩(wěn)定性的聚合酶提供DNA模板這個過程稱為反轉(zhuǎn)錄（RT)，進而有了RT一PCR這一名稱。人們常用鳥類成瘤病毒（AMV）或Moloney鼠白血病病毒（M一MtLv）的反轉(zhuǎn)錄酶來產(chǎn)生RNA模板的DNA拷貝4.實時定量PCR

Higuch5等人(1992，1993)最早開始應(yīng)用溴化乙錠來對擴增的PCR產(chǎn)物進行定量。擴增反應(yīng)產(chǎn)生越來越多的雙鏈DNA，它們結(jié)合溴化乙錠后會使熒光增強。用熒光增強量對循環(huán)次數(shù)作圖，可以對實時的PCR動力學(xué)進行分析。使用溴化乙錠的主要缺點是：無論是特異性的產(chǎn)物還是非特異性的產(chǎn)物都可以產(chǎn)生信號。要克服這個問題可通過改變探針的方法來檢測積累的產(chǎn)物(Livak等，1995)。人們開發(fā)出了結(jié)合了熱循環(huán)和熒光測定方法的儀器．可以對PCR的擴增過程進行實時監(jiān)控。這使通過PCR來對DNA進行定量的方法發(fā)生了革命性變比。反應(yīng)的特征是循環(huán)中第一次檢測到擴增產(chǎn)物的時刻，而不是固定循環(huán)次數(shù)后PCR產(chǎn)物的積累量。靶序列的原始拷貝數(shù)越多，檢測到的熒光強度也越大。對未知樣品中靶序列的定