蛋白質組學及其研究方法

關于蛋白質組學及其研究方法第一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三一、蛋白質組學的相關概念

蛋白質組澳大利亞學者Williams和Wilkins于1994年首先提出protein+genome=proteome一個基因組所表達的全套蛋白質一個細胞或一個機體的基因所表達的全部蛋白質第二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質組是：對應于基因組的所有蛋白質構成的整體，不是局限于一個或幾個蛋白質。同一基因組在不同細胞、不同組織中的表達情況各不相同。在空間和時間上動態(tài)變化著的整體。第三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

蛋白質組學

旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式與功能模式從整體的角度分析、鑒定細胞內動態(tài)變化的蛋白質的組成、結構、性質、表達水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質之間、蛋白質與大分子之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質的功能與細胞生命活動的規(guī)律第四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三二、蛋白組學的研究內容蛋白質組學的研究內容主要有兩個方面：

結構蛋白質組學和功能蛋白質組學

結構蛋白質組學(Structuralproteomics)主要是蛋白質表達模式的研究，包括蛋白質氨基酸序列分析及空間結構的解析、種類分析及數量確定；

功能蛋白質組學(functionalproteomics)主要是蛋白質功能模式的研究，

包括蛋白質的功能及蛋白質間的相互作用。第五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質的各級結構第六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三0.50nm0.54nm氫鍵α-碳原子側鏈反平行俯視側視第七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三所以，蛋白質組學研究是對不同時間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質群體的研究,從蛋白質水平上探索蛋白質作用模式、功能機理、調節(jié)控制以及蛋白質群體內相互作用,為臨床診斷、病理研究、藥物篩選、新藥開發(fā)、新陳代謝途徑研究等提供理論依據和基礎.第八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三三、蛋白質組研究的理論基礎從mRNA表達水平并不能預測蛋白表達水平。用基因表達連續(xù)分析法(SAGE)研究對數生長期啤酒酵母的80個基因，結果沒有發(fā)現翻譯和轉錄豐度有明顯相關；對某些基因，相同的mRNA豐度翻譯成蛋白的量的差異可達50倍；而相等的蛋白量可由豐度相差40倍的mRNA轉錄而來。這說明轉錄和翻譯水平對蛋白的含量有幾乎相同的重要性。第九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質的動態(tài)修飾和加工并非必須來自基因序列。蛋白質在翻譯后可有多種調節(jié)方式，如糖基化、磷酸化、異戊二烯化、?；饔玫?。此外，許多蛋白質只有與其它分子結合后才有功能，這種修飾是動態(tài)的、可逆的。第十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質組動態(tài)地反映生物系統(tǒng)所處的狀態(tài)。細胞周期的特定時期、分化的不同階段、對應的生長和營養(yǎng)狀況、溫度、應激和病理狀態(tài)等其相應的蛋白質組之間存在差異。對其中蛋白質合成、降解、加工、修飾的調控過程,只有通過蛋白質的直接分析才能提示。第十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質組研究的理論基礎DNAmRNA蛋白質轉錄翻譯基因蛋白質細胞特異性基因表達生理狀態(tài)溫度應激狀態(tài)培養(yǎng)條件藥物作用數量有限結構相對穩(wěn)定復雜性多變性直接反應生命現象復雜的調控第十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三四、蛋白質組表達模式的研究方法蛋白質組表達模式（expressionprofile）：研究蛋白質組的組成成分支撐技術主要有：雙向凝膠電泳(2Delectrophoresis)、以質譜(massspectrograph)為代表的蛋白質鑒定技術,以及生物信息學(Bioinformatics)分析。第十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三ProteinsampleImageanalysisProteiningelProteinonmembraneProteininsolution2-DPAGEExcisionBlottingElutionPartialdegradationPeptidemixtureMassofproteinN-terminalsequenceMSEdmandegradationPeptidemassfingerprintPeptidesequenceMS/MSdataDatabasesearchingNovelorpreviouslystudiedproteinCharacterizationofpost-translocationmodifications蛋白質組的分析流程第十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三（一）蛋白質組研究中的樣品制備通?？刹捎眉毎蚪M織中的全蛋白質組分進行蛋白質組分析。也可以進行樣品預分級，即將細胞或組織中的全體蛋白質分成不同部分，分別進行研究。樣品預分級主要作用在于提高低豐度蛋白質的上樣量和檢測靈敏度。

第十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三樣品預分級的主要方法蛋白質溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質細胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等第十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三三

種

常

用

的

植

物

蛋

白

提

取

方

法第十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三（二）蛋白質組研究中的樣品分離雙向凝膠電泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)，是目前蛋白質組研究中最有效的分析鑒定技術之一。由兩相組成：

第一相：等電聚焦凝膠電泳根據蛋白質電荷差異

第二相：SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳根據蛋白質分子量差異第十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三二維雙向電泳(2Delectrophoresis)

基本原理第一向在高壓電場下對蛋白質進行等電聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)。IEF-focusedproteinsSDS-chargedproteinsinIPGstripSDS-chargedproteinsresolvedaccordingtosizesinSDSgel第十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2-DE原理示意圖

第二十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2-DE分析的基本步驟蛋白質溶解變性還原去除蛋白質雜志利用不同pK固定化電解質可配置不同pH范圍的凝膠或利用商業(yè)化軟件設計

第一相電泳：IPG－IFE平衡第二相電泳：SDS－PAGE考馬斯亮藍染色、銀染色、銅染色樣品制備IPG膠制備雙相電泳染色第二十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2-DE的操作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS

SDSpolyacrylamidegelelectrophoresisSDS帶負電荷，破壞蛋白質的氫鍵、疏水鍵，使之形成單個亞基。SDS-蛋白質復合物為雪茄形的長橢圓棒，消除或掩蓋了不同種類蛋白質間原有電荷的差異。SDS-蛋白質復合物在凝膠電泳中的遷移率只是蛋白質分子量的函數有關。第二十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

制膠：試劑分離膠（ml）濃縮膠（ml）1.5MTris-HCl（pH8.9）2.50——30%單體3.501.0010%SDS0.100.10蒸餾水3.846.340.5MTris-HCl（pH6.8）——2.5010%過硫酸銨AP0.050.05四甲基乙二胺TEMED0.010.01第二十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

樣品處理：Loadingbuffer40%甘油溴酚蘭SDSβ-巰基乙醇0.5MTris-HCl（pH6.8）50ul樣品50ul(2×)LoadingbufferMix950C/5min第二十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三電泳槽上電極緩沖液下電極緩沖液樣品槽上樣器陰極陽極電泳方向聚丙烯酰胺凝膠板第二十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第二十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質點的染色凝膠上的蛋白質點染色常用方法有銀染法、考馬斯亮藍染色法,另外還采用以下染色試劑:麗春紅S、氨基黑、印度墨、35S硫脲銀、膠態(tài)金、咪唑鋅等.銀染法廣泛用于雙向凝膠電泳分離后蛋白質點的染色,該法靈敏度為4ng,但對質譜測定有干擾,必須先脫銀.考馬斯亮藍染色法可用于膠上或膜上蛋白質點染色,該法操作方便、重現性好,同銀染法一樣,質譜測定時也必須先脫色.第二十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2-DE圖像分析技術通過2-DE得到的蛋白質分離圖譜，需要經過攝像或掃描轉換為以像素為基礎的、具有不同灰度強弱和一定邊界方向的斑點電腦信號。2-DE獲得的蛋白質圖譜第二十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三圖像采集斑點檢測背景消減獲得蛋白質相關信息圖像內及圖像間的比較2-DE圖像分析軟件包操作過程：第二十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2-DE技術的優(yōu)缺點

優(yōu)點：可以同時直觀顯示數千個蛋白質點；缺點：

極酸、極堿性蛋白質，疏水性蛋白質，極大蛋白質、極小蛋白質以及低豐度蛋白質用此種技術難于有效分離；

膠內酶解過程費時、費力，難于與質譜聯(lián)用實現自動化；丙烯酰胺有神經毒作用。第三十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三新型非凝膠技術液相色譜法(liquidchromatography，LC)毛細管電泳(capillaryelectrophoresis，CE)液質聯(lián)用技術（LC-MS/MS）蛋白質混合物直接通過液相色譜分離以代替2-DE的分離，然后進入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量，再通過串聯(lián)MS技術，得到部分序列信息，最后通過計算機聯(lián)網查詢、鑒定蛋白質。多維色譜技術（LC/LC-MS/MS）多維蛋白質鑒定技術第三十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三（三）蛋白質組研究中的樣品分析鑒定傳統(tǒng)方法：蛋白質微量測序氨基酸組成分析新型蛋白質鑒定技術

——質譜（MS）法基本原理：樣品分子離子化后，根據離子間質荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。

第三十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三主要質譜類型基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）電噴霧質譜（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）質譜分析目前是經2D分離的蛋白質鑒定的核心技術第三十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第三十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第三十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三（四）蛋白質組學研究的生物信息學2D-PAGE分離的蛋白質經過識別與鑒定后，用圖像掃描儀數字化2D-PAGE膠上分離的蛋白質，在蛋白圖形工作站上，應用軟件，對數字化的蛋白點的分布部位，斑點面積和灰階、背景過濾、2-DE匹配與比較，建立參考圖譜；對蛋白質鑒定的數據庫的搜索是蛋白質組信息學的一大特點；第三十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三當用2D-PAGE分離一個蛋白質組后,應用質譜技術測定能夠刻劃蛋白質屬性的各種屬性參數(attributeparameter),同時把已有數據庫(如OWL或dbEST)中的每一個序列轉換成相應屬性參數,形成屬性化的數據庫。然后以此屬性參數,形成屬性化的蛋白質或核酸數據庫。若搜索不到,那可能是新的蛋白質,就須采用傳統(tǒng)的生化鑒定。第三十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質數據庫（一）蛋白質序列數據庫（二）蛋白質結構數據庫（三）蛋白質直系同源簇數據庫（四）DIP數據庫瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質組數據庫目前應用最普遍的數據庫是NRDB和dbEST數據庫蛋白質組數據庫是蛋白質組研究水平的標志和基礎第三十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質數據庫的應用（一）序列比較序列兩兩對比多序列對比（二）臨床診斷（三）腫瘤治療藥物的開發(fā)

第三十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第四十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三五、蛋白質組功能模式的研究方法（一）蛋白質翻譯后修飾的研究（二）蛋白質相互作用研究技術蛋白質－蛋白質蛋白質－核酸間相互作用研究第四十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質-蛋白質相互作用的形式

1、蛋白質亞基的聚合

2、交叉聚合

3、分子識別

4、分子的自我裝配

5、多酶復合體第四十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質之間的相互作用力