實(shí)驗(yàn)四 血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳

實(shí)驗(yàn)四血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳第1頁(yè)/共40頁(yè)31三月20232【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握電泳法分離血清蛋白質(zhì)的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義第2頁(yè)/共40頁(yè)31三月20233電泳：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)【實(shí)驗(yàn)原理】第3頁(yè)/共40頁(yè)31三月20234H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI第4頁(yè)/共40頁(yè)31三月20235電泳速度:帶電粒子在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)時(shí)，單位電場(chǎng)強(qiáng)度內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，以u(píng)表示，即

V—粒子運(yùn)動(dòng)的速度X—電場(chǎng)強(qiáng)度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度第5頁(yè)/共40頁(yè)31三月20236影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦越小，u越大。球形分子>纖維狀分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；第6頁(yè)/共40頁(yè)31三月202372.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大離子強(qiáng)度(I)：

I越大，電動(dòng)電勢(shì)越小，u越小；

I越小，電動(dòng)電勢(shì)越大，u越大，但樣品易擴(kuò)散。離子強(qiáng)度如果過(guò)低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定

選擇離子強(qiáng)度時(shí)要兩者兼顧，一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.02～0.2之間。第7頁(yè)/共40頁(yè)31三月20238電場(chǎng)強(qiáng)度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢(shì)梯度。3.電場(chǎng)強(qiáng)度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。

電場(chǎng)強(qiáng)度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。在進(jìn)行高壓電泳的時(shí)候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無(wú)法分離第8頁(yè)/共40頁(yè)31三月202394.支持介質(zhì)：①纖維薄膜(玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜)②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)第9頁(yè)/共40頁(yè)31三月202310負(fù)極正極－－－－－－－－表面帶負(fù)電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動(dòng)

如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動(dòng)的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動(dòng)的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場(chǎng)作用下液體對(duì)固體支持物相對(duì)移動(dòng)的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:第10頁(yè)/共40頁(yè)31三月202311區(qū)帶電泳的分類（一）支持物物理性狀1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維薄膜)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。第11頁(yè)/共40頁(yè)31三月202312（二）支持物裝置形式：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳第12頁(yè)/共40頁(yè)31三月202313(三)pH連續(xù)性：1．連續(xù)pH電泳：即整個(gè)電泳過(guò)程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續(xù)pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等第13頁(yè)/共40頁(yè)31三月202314

醋酸纖維薄膜為支持物

pH=8.6的巴比妥緩沖液血清蛋白的pI均小于8.6

負(fù)電荷電泳時(shí)向正極移動(dòng)由于遷移率不同而被分離第14頁(yè)/共40頁(yè)31三月202315γβα2α1清蛋白

分子越小，泳動(dòng)速度越快帶電量越多，泳動(dòng)速度越快第15頁(yè)/共40頁(yè)31三月202316膜條經(jīng)過(guò)氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.定性,定量各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_(kāi)，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計(jì)算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。第16頁(yè)/共40頁(yè)31三月202317醋酸纖維薄膜：醋酸纖維加工的細(xì)密且薄的微孔膜廣泛應(yīng)用醫(yī)學(xué)臨床各種生物分子的分離分析

血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、類固醇及同工酶等第17頁(yè)/共40頁(yè)31三月202318優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速缺點(diǎn)分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE）不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）第18頁(yè)/共40頁(yè)31三月202319【器材及試劑】1、器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀竹鑷點(diǎn)樣器人血清或雞血清粗濾紙2、試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液第19頁(yè)/共40頁(yè)31三月202320[操作]（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備1、醋酸纖維素薄膜的潤(rùn)濕與選擇2.電泳槽的準(zhǔn)備3、電極槽的平衡第20頁(yè)/共40頁(yè)31三月202321（二）點(diǎn)樣

取出薄膜，無(wú)光澤面向上平放在濾紙上點(diǎn)樣區(qū)距陰極端1.5cm

血清均勻涂在點(diǎn)樣器表面將點(diǎn)樣器輕輕印在點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線

實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)第21頁(yè)/共40頁(yè)31三月202322（三）電泳

點(diǎn)樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點(diǎn)樣面朝下)

另一端平貼在陽(yáng)極端支架

要求：薄膜緊貼濾紙橋并繃直，薄膜之間相隔幾毫米蓋電泳槽蓋，平衡10min

打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度為0.3mA/片，通電10min

調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度為0.5mA/片，電泳60~90min

電泳后調(diào)節(jié)旋鈕電流為O，關(guān)閉電泳儀切斷電源第22頁(yè)/共40頁(yè)31三月202323DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽第23頁(yè)/共40頁(yè)31三月202324第24頁(yè)/共40頁(yè)31三月202325第25頁(yè)/共40頁(yè)31三月202326【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】

不要用手觸摸纖維素膜注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面點(diǎn)樣位置要在1.5厘米以內(nèi)，不要距邊緣太近不要重復(fù)點(diǎn)樣膜放進(jìn)電泳槽時(shí)，將點(diǎn)樣面向下，點(diǎn)樣端靠近陰極第26頁(yè)/共40頁(yè)31三月202327

用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣時(shí)不要點(diǎn)的太多，但也不能太少線條均勻，用力水平。電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液第27頁(yè)/共40頁(yè)31三月202328（四）染色和漂洗

取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min

自來(lái)水沖洗，漂洗液漂洗更換3次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖譜第28頁(yè)/共40頁(yè)31三月202329【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】繪出電泳圖譜并標(biāo)明各條帶含義第29頁(yè)/共40頁(yè)31三月202330第30頁(yè)/共40頁(yè)31三月202331臨床意義

血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L

絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成

正常值： 白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％

α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％

γ球蛋白12％—20％第31頁(yè)/共40頁(yè)31三月202332可能相關(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低球蛋白血癥↓*臨床上還可用A/G比來(lái)表示清球蛋白的量的關(guān)系：正常人A/G＝1.5～2.5第32頁(yè)/共40頁(yè)31三月202333血漿蛋白的主要功能

維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝物、激素、藥物及金屬離子等免疫作用第33頁(yè)/共40頁(yè)31三月202334白蛋白降低：

合成能力不足：肝功能下降

合成原料不足：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期

去路增加：腎病綜合癥，嚴(yán)重?zé)齻蟪鲅?/p>

消耗過(guò)多：糖尿病，甲亢等第34頁(yè)/共40頁(yè)31三月202335球蛋白增加：感染，多發(fā)性骨髓瘤，自身免疫性疾病等球蛋白降低：皮質(zhì)功能亢進(jìn)，免疫缺陷病第35頁(yè)/共40頁(yè)31三月202336肝?。篈,α2-G,β-G,α1-G,γ-G，A/G下降甚至倒置腎?。涸缙冢哼x擇性蛋白尿，Mw較小蛋白質(zhì)丟失，含量下降。如白蛋白后期：非選擇性蛋白尿，Mw較小的蛋白質(zhì)丟失，含量下降分子量較大的蛋白質(zhì)（如γ-球蛋白）丟失，含量下降第36頁(yè)/共40頁(yè)31三月202337【實(shí)驗(yàn)思考】1．電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的正極還是負(fù)極？為什么？2．電泳后，泳動(dòng)在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種成分？請(qǐng)分析原因第37頁(yè)/共40頁(yè)31三月202338【常見(jiàn)問(wèn)題及原因】1.電泳圖譜不齊：點(diǎn)樣時(shí)血清滴加不均2.電泳圖譜出現(xiàn)條痕：點(diǎn)樣后薄膜過(guò)干，或電泳槽密閉性不