蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 考馬斯亮藍(lán)染色法

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染色法第一頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夥止夤舛燃夹g(shù)的一般原理學(xué)習(xí)722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)的操作熟悉考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法第二頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)原理分光光度法是一種利用紫外光、可見(jiàn)光、紅外光和激光等測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，所使用的儀器稱為分光光度計(jì)人眼可見(jiàn)的光只占電磁波譜的很小一部分（400~760nm）。它是一種頻率較大的電磁波。電磁波按頻率大小，從頻率最小的無(wú)線電波到頻率最大的γ-射線排成一列，即組成電磁波的波譜，如下圖所示第三頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日分光光度計(jì)的光譜范圍：包括波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為400～760nm的可見(jiàn)光區(qū)如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液，此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜，它出現(xiàn)了幾條暗線，即光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜，不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的。因此根據(jù)吸收光譜，可以鑒別溶液中所含的物質(zhì)當(dāng)光線通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí)，透過(guò)的光的強(qiáng)度減弱。因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷?，一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收，只有一部分光可透過(guò)溶液，則：

入射光=反射光+吸收光+透過(guò)光如果我們用蒸餾水（或組成此溶液的溶劑）作為“空白”去校正反射等因素造成的入射光的損失，則：

入射光=吸收光+透過(guò)光第四頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日朗伯-比爾（Lambert-Beer）光吸收定律設(shè)I0為經(jīng)過(guò)空白校正后入射光的強(qiáng)度，It為透過(guò)光的強(qiáng)度根據(jù)實(shí)驗(yàn)得知：It=I0·10－εbc，式中：c表示吸收物質(zhì)的摩爾濃度；b表示吸收物質(zhì)的光徑，用cm表示；ε表示吸收物質(zhì)的摩爾消光系數(shù)，它表示物質(zhì)對(duì)光的吸收特性，不同物質(zhì)的ε數(shù)值不同，所以It/I0=10－εbc令T（透射比）=It/I0

，則T=10－εbc

，lg（1/T）=εbclg（l/T）為物質(zhì)的吸光度（A），則A=1g（1/T）＝εbc，此式說(shuō)明了物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和光程成正比，這就是Lambert-Beer光吸收定律I0IrItIa第五頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日分光光度計(jì)的分類無(wú)論哪一類分光光度計(jì)都包括光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和顯示裝置。分光光度計(jì)各部件的次序如圖所示：紅外分光光度計(jì)：測(cè)定波長(zhǎng)范圍為大于760nm的紅外光區(qū)可見(jiàn)光分光光度計(jì)：測(cè)定波長(zhǎng)范圍為400～760nm的可見(jiàn)光區(qū)紫外分光光度計(jì)：測(cè)定波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū)0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示器第六頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日光源不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜，因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源鎢燈的發(fā)射光譜：鎢燈光源所發(fā)出的320～1100nm波長(zhǎng)的光譜，光通過(guò)三棱鏡折射后，可得到由紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫組成的連續(xù)色譜；該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源氫燈的發(fā)射光譜：氫燈能發(fā)出195～400nm波長(zhǎng)的光譜，可作為紫外光光度計(jì)的光源單色器把混合光波分解為單一波長(zhǎng)光的裝置在分光光度計(jì)中多用棱鏡或光柵作為色散元件棱鏡：是根據(jù)光的折射原理而進(jìn)行的分光系統(tǒng)，當(dāng)一束平行光進(jìn)入棱鏡散射器后就會(huì)按波長(zhǎng)順序分解成單一波長(zhǎng)的單色光光柵：是利用光的衍射和干涉原理進(jìn)行的分光系統(tǒng)轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡或光柵的波長(zhǎng)盤(pán)，可以改變單色器出射光束的波長(zhǎng)，調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度純粹的單色光只是一種理想情況，實(shí)際上只是具有一定波長(zhǎng)范圍的譜帶，對(duì)于單色光純度來(lái)說(shuō)，狹縫是越窄越好，但光的強(qiáng)度也就越弱第七頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日吸收池亦稱樣品室、比色池或吸收池，由透明材料（有機(jī)玻璃、石英或藍(lán)寶石等）制成在紫外光波區(qū)檢測(cè)選用石英、藍(lán)寶石比色杯；在可見(jiàn)光波區(qū)檢測(cè)可選用有機(jī)玻璃比色杯吸收池使用注意事項(xiàng)吸收池必須與光束方向垂直每套比色皿的質(zhì)料、厚度應(yīng)完全相同，以免產(chǎn)生誤差比色皿上的指紋、油污或壁上的沉積物都會(huì)顯著地影響其透光性，因此在使用前務(wù)必徹底清洗檢測(cè)器是一種光電轉(zhuǎn)換裝置，主要是把光強(qiáng)度轉(zhuǎn)變成電訊號(hào)，再通過(guò)放大器把信號(hào)輸送給測(cè)量?jī)x器第八頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日常用的檢測(cè)器有光電管、光電倍增管和光電二極管矩陣顯示裝置把從光電監(jiān)測(cè)器中獲得的電信號(hào)，通過(guò)放大器后，以圖形或數(shù)字等形式顯示出來(lái)主要有四種類型：指針式、LD數(shù)字式、VGA屏幕式和計(jì)算機(jī)式第九頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日722型可見(jiàn)光光柵分光光度計(jì)第十頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)的使用步驟將靈敏度旋鈕調(diào)整“1”檔（放大倍率最?。┐蜷_(kāi)分光光度計(jì)電源，開(kāi)蓋預(yù)熱20min選擇所需波長(zhǎng)將空白比色杯垂直放入樣品槽，使光面對(duì)準(zhǔn)光路將旋鈕打至T，開(kāi)蓋調(diào)0，閉蓋調(diào)100將旋鈕打至A，閉蓋調(diào)0將樣品比色杯放入樣品槽，閉蓋，讀出讀數(shù)開(kāi)蓋取出樣品比色杯，關(guān)閉電源第十一頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日756型紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)第十二頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)第十三頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日PE5808紅外光分光光度計(jì)第十四頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，屬于染料結(jié)合法的一種考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈棕紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過(guò)疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，前者的最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0.01～1.0mg/mL），蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合2min左右達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫1h內(nèi)保持穩(wěn)定考馬斯亮藍(lán)G-250染色法簡(jiǎn)單迅速，靈敏度高，一些陽(yáng)離子如K+、Na+、Mg2+、NH4+以及乙醇等物質(zhì)都不干擾測(cè)定，但一些去污劑如TritonX-100、SDS等嚴(yán)重干擾測(cè)定，且樣品測(cè)定后不能回收第十五頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)器材試管及試管架移液管722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)第十六頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日四、實(shí)驗(yàn)材料與試劑染色液蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（0.1mg/mL）稀釋血清第十七頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日五、實(shí)驗(yàn)操作制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支試管，按下表操作以各管的相應(yīng)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線第十八頁(yè)，共二十頁(yè)，2022年，8月28日血清蛋白質(zhì)吸光值的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取0.1mL血清，置于100mL容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，再取1支試管，在試管中加入0.5mL血清稀釋液，0.5mL蒸餾水和3mL染色液，混勻后室溫放置15min，在595nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值血清蛋白質(zhì)含量的計(jì)算：