色譜概論1-3章教學課件

色譜分析概論

第一章緒論第二章色譜法的原理第三章色譜儀第一章緒論1色譜法的發(fā)展簡史32色譜法與其他方法的比較和配合色譜法的定義與分類二、色譜法的發(fā)展1931年德國的化學家?guī)於髦貜土舜木S特的某些實驗，用氧化鋁和碳酸鈣分離了α-、β

-和，γ

-胡蘿卜素，此后用這種方法分離了60多種此類色素。英國科學家Martin和Syng在1940年提出液-液色譜法，即固定相是吸附在硅膠上的水，流動相是某種有機溶劑。1941年，Martin和Synge提出用氣體代替液體作流動相的可能性，11年之后，James和Martin提出了從理論到實踐較完整的氣-液色譜方法，從而獲得了1952年的諾貝爾化學獎。在此基礎上，1957年，Golay開創(chuàng)了開管柱氣相色譜法，習慣上稱為毛細管柱氣相色譜法。1956年，VanDeemter在前人研究的基礎上發(fā)展了描述色譜過程的速率理論，1965年，Giddings總結和發(fā)展了前人的理論，為色譜的發(fā)展奠定了理論基礎。

另一方面早在1944年，Consden等發(fā)展了紙色譜，1949年，Macllean等在氧化鋁中加入淀粉粘合劑制作薄層板，使薄層色譜法（TLC）得以實際應用，而在1956年，Stahl發(fā)明出涂布器之后，才使TLC得到廣泛應用。

在20世紀60年代末把高壓泵和化學鍵合相用于液相色譜，出現(xiàn)了高效液相色譜法（HPLC）。

20世紀80年代初超臨界流體色譜（SFC)興起。而在20世紀90年代毛細管區(qū)帶電泳（CZE）得到廣泛應用。同時集HPLC和CZE優(yōu)點的毛細管電色譜在20世紀90年代后期受到關注。三、色譜法的現(xiàn)狀和未來色譜法是分析化學領域中發(fā)展最快、應用最廣的分析方法之一。這是因為現(xiàn)代色譜法具有分離與分析兩種功能，能排除組分間的相互干擾，逐個將組分進行定性、定量分析，而且還可制備純組分。高效液相色譜近年來以6％-8％的速度增長，其中較活躍的領域是離子色譜、疏水作用色譜、手性分離及反相色譜。HPLC除具有GC的優(yōu)點外，還具有應用面廣，可進行制備分離的特點，多維色譜，可用于藥物、蛋白質、多肽結構測定，并使整個操作完全自動化，這是21世紀色譜分析的發(fā)展方向之一。

第三節(jié)色譜法的定義與分類一、色譜法的定義

色譜法或色譜分析也稱之為層析法，是一種物理化學的分析方法，它利用混合物中各組分在兩相間分配系數(shù)的差別，當溶質在兩相間做相對移動時，各物質在兩相間進行多次分配，從而使各組分得到分離。分離的儀器即色譜儀。二、色譜法的分類

色譜法可按兩相的狀態(tài)及應用領域的不同分為兩大類。（一）按流動相與固定相的狀態(tài)分類1．氣相色譜

氣相色譜又可分為氣固色譜和氣液色譜，前者是以氣體為流動相，以固體為固定相的色譜，后者是以氣體為流動相，以液體為固定相的色譜。

2．液相色譜

液相色譜又可分為液固色譜和液液色譜，前者是以液體為流動相，以固體為固定相的色譜；后者是以一種液體為流動相，以另一種液體為固定向的色譜。（二）按操作形式按操作形式可分為柱色譜法、平面色譜法及逆流分配等類別。

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.柱色譜法柱色譜法將固定相裝在色譜柱里，色譜過程在色譜柱內進行。

按色譜柱粗細，可分為一般柱色譜法、毛細管柱色譜法及微填充柱色譜法等類別。氣相色譜法與高效液相色譜法及超臨界流體色譜法等屬于柱色譜法范圍。2.平面色譜法平面色譜法是色譜過程在固定相構成的平面層內進行的色譜法，又分為紙色譜法、薄層色譜法及薄膜色譜法等。用濾紙作固定液載體的色譜法稱為紙色譜法。將固定相鋪在玻璃板或鋁箔板上，構成一定厚度的薄層板，用這種薄層板進行分離分析的方法稱為薄層色譜法。薄膜色譜法與薄層色譜法類似，主要區(qū)別是它的固定相是用高分子材料制成的薄膜。（三）按色譜過程的分離機制分類按色譜過程的分離機制可將色譜法分為：吸附色譜法、分配色譜法、體積排阻色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法及毛細管電色譜法等類別。

吸附色譜法：其分離主要是基于組分在固態(tài)吸附劑表面吸附能力的差異。固定相吸附作用強的組分的色譜保留時間會較長，反之會有較短的保留時間。分配色譜法：固定相為液態(tài)，利用樣品組分在固定相與流動相中的溶解度不同，引起分配系數(shù)的差別而分離。流動相的極性大于固定相的極性的液相色譜法，稱為反相色譜法，常用于極性組分的分離；反之，稱為正相色譜法，常用于非極性組分的分離。

體積排阻色譜法：其分離主要是基于組分分子的大小和形狀。分子較大的組分不能進入固定相孔隙結構內部，很快隨流動相流出，保留時間較短；而分子較小的組分可以進入孔隙結構內，保留時間較長。因此，通過體積排阻色譜可將不同大小和形狀的分子分開。多用于高聚物分子質量分布和含量的測定。第二章色譜法的原理2色譜中常用的術語和參數(shù)1色譜分析的基本原理第一節(jié)色譜分析的基本原理

在色譜法中存在兩相，一相是固定不動的，我們把它叫做固定相；另一相則不斷流過固定相，我們把它叫做流動相。

色譜分析的基本原理是利用待分離的各種物質(混合物質)在兩相中的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進行分離的。

使用外力使含有樣品的流動相（氣體、液體）通過一固定于柱中或平板上、與流動相互不相溶的固定相表面。當流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，混合物中的各組分與固定相發(fā)生相互作用。

由于混合物中各組分在性質和結構上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中先后流出。與適當?shù)闹髾z測方法結合，實現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測。第二節(jié)色譜法中常用的術語及參數(shù)一、色譜術語

1）基線：是色譜柱中僅有載氣通過時，檢測器響應信號的記錄值?；€在穩(wěn)定的條件下應是一條水平的直線。它的平直與否可反應出實驗條件的穩(wěn)定情況，如以下原因可能導致基線不穩(wěn)：進樣器被污染、檢測器及柱箱溫度變化、色譜柱該老化、色譜柱被污染、分流比過低、色譜柱未安裝好、載氣不純、需要更換進樣墊或清洗襯管等。2）峰高（h）：色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示。峰高是色譜分析中常用的定量參數(shù)之一。峰面積（A）：是色譜峰曲線下與峰頂之間的面積。峰面積是色譜分析中常用的定量分析參數(shù)。3）保留值

e.保留體積（VR)：指從進樣到待測物在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。f.調整保留體積（VR’）：某組份的保留體積扣除死體積后的體積g.相對保留值(r2,1)：組份2的調整保留值與組份1的調整保留值之比。r2,1只與固定相和柱溫有關，不受其他色譜條件的影響。

4）區(qū)域寬度：色譜峰的區(qū)域寬度是色譜流出曲線的重要參數(shù)之一，它的大小反映色譜柱或所選色譜條件的好壞。寬度越窄，其效率越高，分離的效果也越好。區(qū)域寬度通常有三種表示方法：標準偏差：峰高0.607倍處峰寬處的一半。半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬。W1/2=2.354峰底寬Wb：色譜峰兩側拐點上切線與基線的交點間的距離。Wb=4氣相色譜圖二、色譜流出曲線的意義：從色譜圖上可獲得的信息有：色譜峰的個數(shù)，可判斷樣品中所含組份的最少個數(shù)；色譜峰的保留值，可進行定性分析；色譜峰的峰高或峰面積，可進行定量分析；色譜的保留值或區(qū)域寬度，是評價色譜柱分離性能的依據(jù)；色譜峰間距是固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。第一節(jié)氣相色譜儀一、氣相色譜儀的主要部件1.氣相色譜儀的流程氣相色譜流程15MPa0.2-0.5MPa分子篩柱前壓2.氣相色譜儀主要部件氣相色譜儀由五大系統(tǒng)組成：溫控系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及記錄流動相固定相氣路系統(tǒng)2）進樣系統(tǒng)進樣裝置和氣化室進樣系統(tǒng)作用：a、定量引入樣品B、將樣品加熱氣化，轉入柱內進樣器：微量注射器色譜柱的作用：分離混合組分分離柱種類：填充柱和毛細管柱構成：擔體/載體+固定液3）分離系統(tǒng)d.火焰光度檢測器(FPD)：是基于樣品在富氫火焰中燃燒，使含硫、磷化合物經(jīng)燃燒后又被氫還原而得到特征光譜的檢測器。氮磷檢測器（NPD）又稱熱離子檢測器（TID)：是在FID的噴嘴和收集極之間放置一個含有硅酸銣的玻璃珠。適于測定氮、磷化合物的選擇性檢測器。f.光離子化檢測器(PID)：是利用紫外光能激發(fā)解離電位較低的化合物，使之電離產(chǎn)生信號的檢測器。檢測器溫度影響:a、色譜柱的選擇分離b、檢測器的靈敏度c、檢測器的穩(wěn)定性溫度控制部分：色譜柱爐，氣化室，檢測器色譜柱的溫度控制方式:恒溫，程序升溫。5）控溫系統(tǒng)程序升溫指在一個分析周期內柱溫隨時間由低溫向高溫作線性或非線性變化，以達到用最短時間獲得最佳分離的目的。分析對象：沸點范圍寬的混合物樣品經(jīng)色譜柱分離后，各組分按保留時間不同，順序地隨載氣進入檢測器檢測，把進入的組分的濃度或質量按時間的變化而變化，轉化成易于測量的電信號，經(jīng)過必要的放大傳遞給記錄儀或計算機，最后得到該混合樣品的色譜流出曲線及定性和定量信息。6）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和記錄系統(tǒng)第二節(jié)高效液相色譜儀一、高效液相色譜儀的流程二、現(xiàn)代高效液相色譜儀的性能☆高效液相色譜系統(tǒng)性能的要求：應用面廣；分析速度快；重復性好；靈敏度高?！罡咝б合嗌V系統(tǒng)的要求：可測多種樣品；有高選擇性；高流動性；自動化；高靈敏度檢測器；☆高效液相色譜設備的要求：

①使用抗化學腐蝕的材料，有各種檢測器，各種色譜柱；②高性能高壓泵，進樣器，檢測器，管線的死體積小，有快速記錄和數(shù)據(jù)處理器的設備；③可精確控制柱、溫度、流動相的組成和流量；④高信噪比的檢測系統(tǒng)。三、高效液相色譜儀的主要部件色譜泵自動進樣器色譜柱及柱溫箱檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溶劑1.高壓輸液泵的一般性能1）可重復性是指把泵重新調到某一流量的能力，即從較高或較低流量恢復到某一特定流量的能力。2）輸出液體流量的短周期精密度是指泵在短時間內（常指幾分鐘），輸出液體體積恒定性的指標。精密度的變差是由于泵的某些故障所引起的。例如，往復泵的單向閥無規(guī)則地泄漏所引起的輸出液體流量不穩(wěn)。3）泵噪音一些類型的泵，如往復泵，有泵噪音是它所固有的特性，是由活塞的正常運動和單向閥的工作所引起的。4）漂移（長周期的測量精度）是指在較長的時間里，泵流量的連續(xù)變化的情況，往往是由于室溫的變化而引起輸出流量的變化。5）準確度是指按設定值輸出準確流體的能力。2.輸液泵1）輸液泵應具備的性能：

流量精度高且穩(wěn)定

流量范圍寬

能在高壓下連續(xù)工作

液缸容積小

密封性能好，耐腐蝕2）輸液泵操作注意事項：◆防止固體微粒進入泵體◆流動相不應含有腐蝕性物質◆防止溶劑瓶內的流動相被用完◆不超過規(guī)定的最高壓力◆流動相一般應該先脫氣四、高效液相色譜儀的檢測器紫外可見分光光度檢測器—應用最廣的檢測器特點：①靈敏度高；②線性范圍寬；③可做成很小池體積的流通；④對流動相的流速和溫度變化不太敏感（靈敏度高時除外）；⑤易于操作，十分可靠；⑥不破壞樣品；⑦波長可以選擇；⑧對不同的溶質響應有很大的差別；⑨可用于梯度洗脫。2.示差折光檢測器1)示差折光檢測器基本原理檢測基于被分析物的折光指數(shù)的差異,測量樣品流路與參比流路在折光指數(shù)上的差別;當折光指數(shù)差異最大時靈敏度也達到最大;并不測量絕對的折光指數(shù)而是測定折光指數(shù)的差別。2)示差折光檢測器的優(yōu)、缺點a、優(yōu)點：通用檢測器；容易使用，通常來說是比較耐用的檢測器；維護成本低。b、缺點：靈敏度低、選擇性差；對流速、溫度及粘度的變化敏感；不能用于梯度方法；色譜峰可能是正的，也可能是負的。3.熒光檢測器熒