五種菊花近緣植物組織培養(yǎng)研究

五種菊花近緣植物組織培養(yǎng)研究摘要：以紫花野菊變種、紀伊潮菊、龍腦菊、那賀川野菊和磯菊５個菊花近緣種屬植物無菌苗為試材，進行了莖段離體快繁體系和離體葉片不定芽再生體系研究。結(jié)果表明：最佳莖段增殖培養(yǎng)基分別為：紫花野菊變種，MS＋１.０mg·L－１６BA＋（０.０５～０.１０）mg·L－１IBA；紀伊潮菊，MS＋２.０mg·L－１KT＋０.１mg·L－１NAA；龍腦菊，MS＋０.５mg·L－１KT＋０.１mg·L－１NAA；那賀川野菊，MS＋１.０mg·L－１KT＋０.１mg·L－１NAA；磯菊，MS＋２.０mg·L－１６BA＋０.１mg·L－１NAA。紫花野菊變種、紀伊潮菊、龍腦菊、那賀川野菊試管苗適宜生根培養(yǎng)基是１／２MS；磯菊試管苗適宜生根培養(yǎng)基為１／２MS＋０.２mg·L－１NAA。５個材料試管苗離體葉片愈傷組織誘導率均較高，但不定芽的誘導率則因基因型而異，僅那賀川野菊和磯菊能誘導出不定芽。那賀川野菊在MS＋０.５mg·L－１KT＋０.１mg·L－１NAA培養(yǎng)基上不定芽的再生率和增殖系數(shù)均最高，分別為７５.０％和３.４；而磯菊在MS＋１.０mg·L－１６BA＋０.５mg·L－１NAA培養(yǎng)基上的不定芽再生率和增殖系數(shù)最高，分別達８０.０％和５.８。關(guān)鍵詞：菊花近緣植物；莖段；葉片；組織培養(yǎng)菊花近緣種屬野生資源具有抗蟲、抗病、抗逆等優(yōu)良性狀，對栽培菊花的品種改良、抗性育種等種質(zhì)創(chuàng)新十分重要，同時也是進行菊屬親緣關(guān)系探討和栽培菊花起源研究的重要材料。但來自不同生態(tài)類型的菊花近緣野生材料在越夏或越冬時難以存活，造成種質(zhì)資源嚴重丟失。植物組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源保存和離體快繁。自Hill（１９６８）利用芽尖外植體通過愈傷組織誘導成株建立菊花再生體系以來，許多學者以葉片［１－３］、莖段［４－５］、管狀花［６－７］、花梗［８］等為外植體相繼建立了菊花的離體再生體系，原生質(zhì)體培養(yǎng)［８］和體細胞胚培養(yǎng)再生體系［８］也獲得了成功，但有關(guān)菊花近緣野生物種組織培養(yǎng)研究鮮見報道。本試驗以引自日本的具有抗蟲性、耐鹽性、耐水濕等優(yōu)良性狀的５種野生材料紫花野菊變種（Dendranthemazawadskiivar.latilobum）、紀伊潮菊（Ajaniashiwogikuvar.kinokuniense）、龍腦菊（D.japonicum）、那賀川野菊（D.yoshinaganthum）、磯菊（A.pacificum）為試料，探討了不同生長調(diào)節(jié)劑組合和培養(yǎng)基種類對試管苗增殖、離體葉片愈傷組織誘導、不定芽再生以及試管苗生根的影響，初步建立了５種供試菊花近緣野生植物的離體快繁體系和不定芽再生體系，為該類具優(yōu)良抗性性狀野生資源的保存和利用奠定了基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料５種供試菊花近緣野生材料（表１）均從日本收集，保存于南京農(nóng)業(yè)大學“中國菊花種質(zhì)資源保存中心”。表15種菊花近緣野生材料代號Code中文名染色體數(shù)目花色RG７紫花野菊變種２n＝２x＝１８白色～粉色ZB１紀伊潮菊２n＝８x＝７２黃色ZB６龍腦菊２n＝２x＝１８白色ZB７那賀川野菊２n＝４x＝３６白色～粉色ZB８磯菊２n＝１０x＝９０黃色1.25種菊花近緣野生植物離體快繁體系的建立1.2.1不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對增殖的影響選取生長健壯的無菌苗，切割成帶１個節(jié)的節(jié)段，接種到增殖培養(yǎng)基中誘導不定芽，共設(shè)９個處理（表２）。每處理接種１０個外植體，３次重復(fù)。培養(yǎng)２０d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。增殖系數(shù)＝（增殖后芽總數(shù)－接種芽數(shù)）／接種芽數(shù)（注：接種后死亡芽數(shù)不計入）。不同基本培養(yǎng)基對生根的影響將增殖培養(yǎng)誘導的健壯不定芽切割成帶３個葉片、長１.５～２.５cm的莖段，分別接種至MS、１／２MS培養(yǎng)基中進行生根誘導。每處理６瓶，每瓶接種４個外植體。２０d后統(tǒng)計生根苗數(shù)及平均根數(shù)，測量根長，計算生根率。1.2.3不同生長素種類及濃度對生根的影響外植體的切取方法同１.２.２，分別接種于添加０.０５、０.１、０.２mg·L－１的NAA（萘乙酸）或IBA（吲哚丁酸）的１／２MS培養(yǎng)基上，以不添加生長素的１／２MS培養(yǎng)基為對照。每處理６瓶，每瓶接種４個外植體。統(tǒng)計項目與方法同１.２.２。1.35種菊花近緣野生植物葉片不定芽再生體系的建立1.3.1不同細胞分裂素對葉片愈傷組織誘導和不定芽分化的影響將無菌苗葉片切成０.５cm×０.５cm左右的小塊作為外植體，分別接種到添加不同種類及不同濃度細胞分裂素的MS培養(yǎng)基中（６BA（６芐基腺嘌呤）：０.５、１.０、２.０mg·L－１；KT（激動素）：０.５、１.０、２.０mg·L－１），再添加０.１mg·L－１NAA。每處理６瓶，每瓶接種５個葉片外植體。１５d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率，再將愈傷組織轉(zhuǎn)接于相同的培養(yǎng)基中，３０d后統(tǒng)計葉片再生率和增殖系數(shù)。愈傷組織誘導率＝形成愈傷組織的葉片數(shù)／接種葉片總數(shù)×１００％；葉片再生率＝發(fā)生分化的葉片數(shù)／接種葉片總數(shù)×１００％；增殖系數(shù)＝葉塊發(fā)生的不定芽總數(shù)／接種葉塊總數(shù)。不同生長素對葉片愈傷組織誘導和不定芽分化的影響外植體的切取方法同１.３.１，將其接種到添加１.０mg·L－１６BA及不同種類及不同濃度生長素（NAA：０.５、１.０、２.０mg·L－１；２，４D（２，４二氯苯氧乙酸）：０.５、１.０、２.０mg·L－１）的MS培養(yǎng)基中。每處理６瓶，每瓶接種５個葉片外植體。愈傷組織誘導率、葉片再生率和增殖系數(shù)統(tǒng)計方法同１.３.１。1.4培養(yǎng)條件培養(yǎng)基均添加３０g·L－１蔗糖、７.０g·L－１瓊脂，pH為５.８，高壓高溫滅菌２０min。在（２５±２）℃、光照１２h·d－１、光照強度３６mmol·m－２·s－１條件下培養(yǎng)。1.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用MicrosoftExcel和SAS軟件處理，多重比較采用Duncan′s檢驗法。2結(jié)果與分析2.1不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對芽增殖的影響５種菊花近緣野生植物帶芽莖段接入增殖培養(yǎng)基第１０天發(fā)現(xiàn)莖段切口處開始膨大，有隆起的愈傷組織形成，第１２天開始有黃綠色叢生芽形成。各個種愈傷組織及不定芽的形成時間先后相差３～５d，其中，RG７最先形成愈傷組織，而ZB７最先分化不定芽。同時，每個種最適的增殖培養(yǎng)基表現(xiàn)出明顯的基因型差異。由表３可知，RG７在１.０mg·L－１６BA、０.０５和０.１０mg·L－１IBA時，增殖系數(shù)較高，分別為２.９３和３.３０，與其他處理之間存在顯著差異，因此，MS＋１.０mg·L－１６BA＋（０.０５～０.１０）mg·L－１IBA是RG７的優(yōu)選增殖培養(yǎng)基（圖１A）。ZB１在MS＋０.５mg·L－１６BA＋０.１mg·L－１NAA中增殖系數(shù)最高，達４.９３（圖１B）；在MS＋２.０mg·L－１KT＋０.１mg·L－１NAA和MS＋０.５mg·L－１KT＋０.１mg·L－１NAA中增殖系數(shù)也較高，分別為４.００和３.９７，與其他培養(yǎng)基之間差異顯著，但三者間差異不顯著。其中，ZB１在MS＋２.０mg·L－１KT＋０.１mg·L－１NAA中分化的不定芽高度適中、節(jié)間均勻、莖充實健壯，生長狀態(tài)良好。ZB６各處理間的增殖系數(shù)差異較大，除處理２和處理７之間差異不顯著外，其他均差異顯著，以MS＋０.５mg·L－１KT＋０.１mg·L－１NAA的增殖系數(shù)最高，達１１.５７（圖１C）。ZB７各處理間除處理３和處理７外，其他差異均顯著，以MS＋１.０mg·L－１KT＋０.１mg·L－１NAA增殖效果最佳，增殖系數(shù)達９.８７（圖１D）。ZB８在各類培養(yǎng)基上的增殖系數(shù)均較低，但６BA比KT更有利于ZB８增殖，其中MS＋２.０mg·L－１６BA＋０.１mg·L－１NAA的增殖系數(shù)最高，達３.５０（圖１E）。圖1不同培養(yǎng)基對試管苗生長的影響2.2不同基本培養(yǎng)基對試管苗生根的影響５種菊花近緣野生植物在１／２MS和MS基本培養(yǎng)基上均能生根，且在生根率、平均根數(shù)和平均根長方面，兩者差異不顯著（表４，圖１F、G）。但供試材料試管苗在１／２MS培養(yǎng)基中的根系明顯粗壯，根毛多，小苗長勢健壯，與多種植物試管苗生根要求較低無機鹽濃度的結(jié)果相似，且可以降低培養(yǎng)基成本。2.3不同生長素種類及其濃度對試管苗生根的影響由表５可知，５種菊花近緣野生植物各處理間的生根率差異不顯著。培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA與IBA對RG７、ZB６、ZB７試管苗生根數(shù)的作用不明顯，對RG７、ZB１、ZB８試管苗平均根長也沒有顯著性影響。與對照相比，IBA對ZB１（圖１H）和ZB８試管苗促進生根作用不顯著，而不同濃度NAA對ZB１的生根有一定的抑制作用，濃度越大抑制作用越明顯（圖１I）；ZB８在NAA為０.２mg·L－１時生根數(shù)顯著高于對照，但NAA在０～０.１mg·L－１時與對照差異不顯著，表明NAA只有達到較適濃度才能起作用，在一定范圍內(nèi)，濃度越大，促進作用越明顯。對ZB６和ZB７而言，添加NAA時其平均根長顯著低于對照，但添加IBA對其平均根長沒有顯著影響，僅０.１mg·L－１IBA對ZB６根伸長存在明顯抑制作用。綜合認為，１／２MS培養(yǎng)基是RG７、ZB１、ZB６、ZB７生根的適宜培養(yǎng)基，ZB８選用１／２MS＋０.２mg·L－１NAA更適合。2.4不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對離體葉片愈傷組織誘導的影響2.4.1不同細胞分裂素種類及濃度對離體葉片愈傷組織誘導的影響葉片外植體接種培養(yǎng)３d后，切口邊緣開始膨大，葉片逐漸增厚；５d后，在切口邊緣觀察到黃綠色的愈傷組織。RG７、ZB１和ZB７愈傷組織誘導較容易，而ZB６和ZB８相對較難。由表６可知，在添加不同種類及濃度的細胞分裂素后，RG７、ZB１和ZB７的愈傷組織誘導率達８０.０％～１００.０％，RG７、ZB１在添加０.５mg·L－１６BA時顯著低于其他處理，ZB７愈傷組織誘導率在相同細胞分裂素的各濃度間差異不顯著。RG７在添加１.０和２.０mg·L－１６BA或０.５、１.０和２.０mg·L－１KT的培養(yǎng)基中愈傷誘導率均達１００％；ZB１在６BA為１.０、２.０mg·L－１或KT為０.５mg·L－１時，ZB７在６BA質(zhì)量濃度為０.５和１.０mg·L－１時愈傷組織誘導率均達到１００％。而ZB６和ZB８的愈傷組織誘導率相對較低，ZB６愈傷組織誘導６BA的效果好于KT，當６BA為２.０mg·L－１時愈傷組織誘導率最高，達８６.７％，而２.０mg·L－１KT未能誘導出愈傷組織；ZB８愈傷組織誘導采用KT的效果好于６BA，在KT質(zhì)量濃度為０.５mg·L－１時誘導率最高，達６６.７％，而６BA質(zhì)量濃度為２.０mg·L－１時愈傷誘導率為０。2.4.2不同生長素種類及濃度對離體葉片愈傷組織誘導的影響由表７可知，RG７的愈傷組織誘導率隨著NAA質(zhì)量濃度的增加而降低。NAA為２.０mg·L－１時，RG７的愈傷組織誘導率只有８０％，顯著低于其他處理；不同質(zhì)量濃度２，４D的愈傷組織誘導率均達１００％。對ZB１、ZB７而言，不同質(zhì)量濃度NAA和２，４D的愈傷組織誘導率均為１００％。NAA各質(zhì)量濃度對ZB６的愈傷組織誘導率均為１００％，而高質(zhì)量濃度２，４D則表現(xiàn)出一定的抑制作用。與RG７類似，高質(zhì)量濃度NAA抑制ZB８愈傷組織的誘導，而０.５～１.０mg·L－１NAA及不同質(zhì)量濃度２，４D的誘導率均達１００％。2.5不同植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織不定芽分化的影響１５d后將帶有愈傷的外植體繼代到相同培養(yǎng)基上，愈傷組織繼續(xù)膨大，繼代后３～５d陸續(xù)觀察到綠色芽點突起，２０d開始有不定芽形成，但僅ZB７和ZB８（圖１J）誘導出不定芽。由表８可知，對ZB７而言，低質(zhì)量濃度的細胞分裂素有利于不定芽的發(fā)生與增殖（圖１K），６BA和KT為０.５mg·L－１時，ZB７的再生率分別為６０.０％和７５.０％，增殖系數(shù)分別為３.０和３.４；NAA或２，４D為１.０mg·L－１時有利于ZB７不定芽再生和增殖，濃度過低作用效果不顯著，濃度過高則表現(xiàn)抑制作用，當NAA為１.０mg·L－１時促進效果顯著（再生率為７０.０％，增殖系數(shù)為３.０）。對ZB８而言，６－BA對不定芽形成和增殖系數(shù)的促進作用顯著高于KT，且表現(xiàn)低濃度促進效應(yīng)，６BA為０.５mg·L－１時不定芽再生率和增殖系數(shù)最高，分別為７０.０％和２.４；NAA和２，４D兩種生長素的再生率均較高，NAA質(zhì)量濃度為０.５mg·L－１時增殖系數(shù)可達５.８，而且不定芽生長健壯（圖１L）。3討論植物離體形態(tài)發(fā)生主要受基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、基因型等因素的影響［９］。王麗華等［１０］研究發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基最適合菊花組織培養(yǎng)。本試驗在進行菊花近緣野生植物組織培養(yǎng)時，以MS作為基本培養(yǎng)基，添加不同生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度發(fā)現(xiàn)，莖段外植體的增殖率與生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度相關(guān)性較大，而且各物種的最佳增殖培養(yǎng)基附加的生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度各異，表現(xiàn)出明顯的基因型差異。其中龍腦菊和那賀川野菊的增殖率較其他基因型的野生種高，快繁體系的構(gòu)建相對容易；其余３個野生種也可以誘導增殖，但增殖率相對較低，有必要進一步探討更合適的生長調(diào)節(jié)劑濃度或采用其他的生長調(diào)節(jié)劑來進一步提高增殖率。多數(shù)報道表明１／２MS培養(yǎng)基是菊屬植物試管苗最適合的生根培養(yǎng)基［１０］。本試驗中，以１／２MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA或IBA對５種菊花近緣野生植物生根率沒有顯著影響。紫花野菊變種、紀伊潮菊、龍腦菊、那賀川野菊的適宜生根培養(yǎng)基均是１／２MS，僅磯菊的適宜生根培養(yǎng)基與李辛雷等［１１］關(guān)于栽培菊的生根報道一致。NAA對平均根數(shù)與平均根長表現(xiàn)出不一致的作用效果，存在顯著的基因型差異。劉軍等［１２］曾報道，IBA比NAA對菊花平均根長促進效果好，而本試驗中IBA的促進效果不明顯。對葉片外植體愈傷誘導率的研究表明，當生長素濃度一定時，不同的細胞分裂素濃度對愈傷組織誘導率的影響較大；而當細胞分裂素濃度一定時，不同生長素濃度對愈傷組織誘導率的影響不顯著，僅較高濃度（２.０mg·L－１２，４D和NAA）降低誘導率，表明細胞分裂素對幾個菊花野生近緣種離體葉片愈傷誘導的影響較生長素強烈，這可能與這些菊花內(nèi)源激素的水平有關(guān)。此外，不同植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織再分化芽能力的影響也因基因型而異，采用不同激素配比試驗誘導不定芽時，只有那賀川野菊、磯菊分化出不定芽，其他３個野生種在３０d內(nèi)未能觀察到不定芽的形成，其原因有待進一步研究。參考文獻：［１］YepesLM，MittakV，PangSZ，etal．Biolistictransformationofchrysanthemumwiththenucleocapsidgeneoftomatospottedwiltvirus［J］．PlantCellReports，１９９５，１４：６９４６９８［２］KaulV，MillerRM，HutchinsonJF，etal．ShootregenerationfromstemandleafexplantsofDendranthemagrandifloraTzvelev（SynChrysanthemummorifoliumRamat）［J］．PlantCellTissOrgCult，１９９０，２１：２１３０［３］deJongJ，RademakerW，vanWordragenMF．RestoringadventitiousshootformationonchrysanthemumleafexplantsfollowingcocultivationwithAgrobacteriumtumefaciens［J］．PlantCellTissOrgCult，１９９３，３２：２６３２７０［４］AnnadanaS，RademakerW，RamannaM，etal．Responseofstemexplantstoscreeningandexplantsourceasabasisformethodicaladvancingofregenerationprotocolsforchrysanthemum［J］．PlantCellTissOrgCult，２００