酶工程制藥BETA版

主要內(nèi)容酶工程制藥概述白血病的概述與致病機(jī)理L-天冬酰胺酶L-天冬酰胺酶的修飾及作用機(jī)制L-天冬酰胺酶的生產(chǎn)工藝L-天冬酰胺酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展第一頁，共29頁。酶工程制藥概述

一、酶工程簡介

酶工程是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合發(fā)展而形成一門新的技術(shù)學(xué)科。它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異性催化功能，并通過工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。第二頁，共29頁。酶工程制藥概述二、酶的來源目前工業(yè)生產(chǎn)酶制劑一般都以微生物為主要來源原因：1.微生物種類多，酶的品種齊全2.微生物生長繁殖快，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高3.培養(yǎng)方法簡單，原料來源豐富，價(jià)格低廉，經(jīng)濟(jì)效益高，可通過控制控制培養(yǎng)基來提高酶的產(chǎn)量4.微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力?？赏ㄟ^各種遺傳變異的手段，培育出新的高產(chǎn)菌株。故目前工業(yè)上應(yīng)用的酶大多采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)。第三頁，共29頁。酶工程制藥概述三、藥用酶的一般要求1在機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件下具有較高活力和穩(wěn)定性；2對底物有較高親和力,不受產(chǎn)物和體液中正常成分抑制；3在體內(nèi)有較長的半衰期，可緩慢地被分解或排出體外；4不需要外源性輔助因子；5在生理?xiàng)l件下酶促反應(yīng)不可逆；6酶制劑純度高，不含其它毒性雜志，來自非致病性酶源。第四頁，共29頁。酶工程制藥概述四、酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用1.在疾病診斷方面的應(yīng)用包括兩個(gè)方面：①根據(jù)體內(nèi)酶活力的變化來診斷疾?。虎谟妹笢y定體液中某些物質(zhì)的量診斷疾病。2.在疾病治療方面：酶作為藥物作用于人體具有種類多、用量少、純度高的特點(diǎn)。3.在藥物生產(chǎn)方面的應(yīng)用：利用酶的催化作用將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為藥物。4.在分析檢測方面的應(yīng)用：是以酶的專一性為基礎(chǔ)、以酶作用后物質(zhì)的變化為依據(jù)來進(jìn)行的。第五頁，共29頁。白血病的概述與致病因素概述白血?。↙eukemia）是一類造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病?？寺≈械陌籽〖?xì)胞增殖失控，分化障礙，凋亡受阻。特征白細(xì)胞呈惡性、無限制地增生，浸潤全身各組織和臟器，周圍血液血細(xì)胞有量和質(zhì)的變化。抑制紅細(xì)胞和血小板止血的產(chǎn)生，非常容易受傷、出血、感染。白血病的芽細(xì)胞第六頁，共29頁。白血病的概述與致病因素

對白血病病因的精確原因還在研究中。一般認(rèn)為，骨髓干細(xì)胞內(nèi)的DNA變異導(dǎo)致它們的惡化。其原因可以是暴露在放射線中、接觸致癌物質(zhì)和其它細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的變異。病毒也可能導(dǎo)致白血病。致病因素可大致分為四類：病毒因素：

已證實(shí)C型RNA腫瘤病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒是導(dǎo)致哺乳類動(dòng)物自發(fā)性白血病的病因。這種病毒能通過內(nèi)生的逆轉(zhuǎn)錄酶按照RNA順序合成DNA的復(fù)制品，即前病毒，當(dāng)其插入宿主的染色體DNA中后可誘發(fā)惡變。第七頁，共29頁。白血病的概述與致病因素化學(xué)因素：

一些化學(xué)物質(zhì)有致白血病的作用。如接觸苯及其衍生物的人群白血病發(fā)生率高于一般人群。放射因素：

包括X射線、r射線。有確實(shí)證據(jù)可以肯定各種電離輻射條件可以引起人類白血病。白血病的發(fā)生取決于人體吸收輻射的劑量，整個(gè)身體或部分軀體受到中等劑量或大劑量輻射后都可誘發(fā)白血病。然而，小劑量的輻射能否引起白血病，仍不確定。遺傳因素：

近親結(jié)婚人群急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病率比期望值高30倍。某些染色體有畸變、斷裂的遺傳性疾患常伴有較高的白血病發(fā)病率，如Down綜合征、先天性血管擴(kuò)張紅斑癥（Bloom綜合征）和Fanconi貧血等。第八頁，共29頁。白血病的發(fā)病率

根據(jù)國外統(tǒng)計(jì)，白血病約占腫瘤總發(fā)病率的3%左右，是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤。白血病的發(fā)病率在世界各國中，歐洲和北美發(fā)病率最高，其死亡率為萬人口。亞洲和南美洲發(fā)病率較低，死亡率為萬人口。男性發(fā)病率略高于女性（1．81：1）。成人急性白血病中以急性粒細(xì)胞白血病最多見。兒童中以急淋白血病較多見。慢粒白血病隨年齡增長而發(fā)病率逐漸升高白血病的概述與致病因素第九頁，共29頁。一、L-天冬氨酰胺酶的性質(zhì)

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase,L-ASP），廣泛存在于微生物、植物和部分嚙齒類動(dòng)物的血清中，純酶的分子量從130000到140000不等。物理性狀為白色結(jié)晶粉末，微有濕性，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙醛、苯等有機(jī)溶劑。對熱穩(wěn)定性好，在溫度50℃下，15min后，活性降低30%，60℃下，1小時(shí)內(nèi)失活。凍干品在2~5℃可穩(wěn)定數(shù)月，但其溶液只能保存數(shù)日，20℃儲(chǔ)存7天，5℃儲(chǔ)存14天均不減少酶的活力。最適宜在pH值為8.5，溫度在37℃下儲(chǔ)存。L-天冬酰胺酶第十頁，共29頁。二、L-天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)L-天冬酰胺酶第十一頁，共29頁。二、L-天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)L-天冬酰胺酶第十二頁，共29頁。二、L-天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)L-ASP結(jié)構(gòu)中與催化活性相關(guān)位點(diǎn)的研究

L-ASP用于臨床以來，人們對其分子結(jié)構(gòu)與催化活性間的關(guān)系進(jìn)行深入的研究。L-ASP結(jié)果中已經(jīng)被研究過的位點(diǎn)包括T12、Y25、S58、T89、N248等，L-ASP的活性中心由T12、Y25、S58、T89、D90。L-天冬酰胺酶E.

coliL-ASPII的活性中心第十三頁，共29頁。三、L-天冬氨酰胺酶的功能L-天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，為抗腫瘤酶制劑。腫瘤細(xì)胞因不能合成生長必需的天冬酰胺而使其生長受到限制。正常細(xì)胞能合成天冬酰胺，故受影響較少。因此，天冬酰胺酶是一種對腫瘤細(xì)胞有選擇性的抑制藥物。對急性淋巴細(xì)胞白血病的緩解率在50%以上，對急性粒細(xì)胞性白血病和急性單核細(xì)胞白血病有一定療效，缺點(diǎn)是單獨(dú)使用不僅緩解期短，切易產(chǎn)生耐藥性。該藥對肌體免疫也有抑制作用，它還可用于治療皮肌炎。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，本品對實(shí)體瘤和白血病均有效，且與常見巰嘌呤、甲蝶呤、長春新堿、阿糖胞苷等無交叉耐藥現(xiàn)象。L-天冬酰胺酶第十四頁，共29頁。一、L-天冬酰胺酶的修飾

1、微囊化修飾

將L-天冬酰胺酶用半透膜性質(zhì)的聚合物制成微囊型固定化酶。其大小一般為1～500Lm。低分子底物可以自由出入膠囊膜,與酶接觸而起反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物則因濃度不斷增加而不斷滲透出膠囊外面。囊型固定化可以克服天然酶針劑出現(xiàn)的抗體抗原反應(yīng)。該固定化酶注射到人體后,對膜具有良好通透性的低分子底物能長時(shí)間發(fā)揮作用,比天然酶的療效好,而且急性毒副反應(yīng)也較低。L-天冬酰胺酶的修飾及作用機(jī)制第十五頁，共29頁。

2、L-天冬酰胺酶的聚乙二醇化

L-ASP的聚乙二醇化不但降級(jí)了胰蛋白酶對它的降解作用，而且修飾酶的抗原性與天然酶相比也大為下降。此外，聚乙二醇化L-ASP與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體化L-ASP相比與有明顯的優(yōu)勢。L-天冬酰胺酶的修飾及其作用機(jī)制第十六頁，共29頁。L-天冬酰胺酶的修飾及作用機(jī)制二、L-天冬酰胺酶的作用機(jī)制

當(dāng)L-天冬酰胺酶注射進(jìn)入人體后，人體正常細(xì)胞內(nèi)由于有天冬酰胺合成酶，可以合成L-天冬酰胺而使蛋白質(zhì)合成不受影響。而對于缺乏天冬酰胺合成酶的癌細(xì)胞來說，由于本身不能合成L-天冬酰胺，外來的天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解掉，因此蛋白質(zhì)合成受阻，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。對治療白血病有顯著療效的L-天冬酰胺酶是第一種用于治療癌癥的酶。第十七頁，共29頁。L-天冬酰胺酶的抗腫瘤作用：

L-ASP抗腫瘤的作用機(jī)制在于它能降低人體內(nèi)L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的濃度，這兩種氨基酸是合成嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的重要組成部分。腫瘤細(xì)胞缺乏天冬氨酰合成酶，不能合成L-天冬酰胺，需要攝取外源L-天冬酰胺才能存活。當(dāng)外源L-天冬酰胺被分解掉時(shí)，癌細(xì)胞合成核苷酸和戴白騅·蛋白質(zhì)的能力就會(huì)顯著降低，因此L-ASP能有效的抑制腫瘤細(xì)胞的增值。

L-天冬酰胺酶的修飾及作用機(jī)制第十八頁，共29頁。L-天冬酰胺酶的生產(chǎn)工藝

L-天冬氨酰酶最初是從豚鼠的血清中提取出來的，含量很低，后來改為發(fā)酵的方式發(fā)酵生產(chǎn)。采用大腸桿菌、歐文菌以及粘質(zhì)賽氏等產(chǎn)生菌制備。大腸桿菌產(chǎn)生的天冬酰胺酶包括天冬酰胺酶Ⅰ和天冬酰胺酶Ⅱ，其中天冬酰胺酶Ⅰ的親和力很小，沒有抗癌活性，存在于細(xì)胞質(zhì)中，而具有抗癌活性的天冬酰胺酶Ⅱ則分布于細(xì)胞周質(zhì)中。因此，生產(chǎn)上常用大腸桿菌作為L-天冬酰胺酶的生產(chǎn)原料。第十九頁，共29頁。L天冬酰胺酶的生產(chǎn)工藝材料與試劑

大腸桿菌；培養(yǎng)基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化鈉0.5g,瓊脂2-2.5g37℃；玉米漿30kg；（NH4)2SO4蔗糖溶液（蔗糖40%溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5)（NH4)2SO450mmol/L,不同PH值的磷酸緩沖液丙酮第二十頁，共29頁。天冬酰胺酶工藝流程圖

大腸桿菌→肉湯菌種→種子菌種→發(fā)酵液→菌體→提取液→上清液→沉淀→洗脫液→洗脫液→凍干→

L-天冬酰胺酶[菌種培養(yǎng)]肉湯培養(yǎng)基37℃48h玉米漿培養(yǎng)基37℃4-8h[種子培養(yǎng)][發(fā)酵]玉米漿培養(yǎng)基37℃6-8h[離心][提取]蔗糖抽提液PH7.530℃

[分級(jí)沉淀]（NH4)2SO455％飽和度PH7.0[分級(jí)沉淀]（NH4)2SO490％飽和度[離子沉淀]DEAE-纖維素(DE52)[離子交換]CM-纖維素(CM52)L-天冬酰胺酶的生產(chǎn)工藝第二十一頁，共29頁。工藝過程及要點(diǎn)1菌種培養(yǎng)

采用大腸桿菌EscherichiacoliA.S.1.357,培養(yǎng)基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化鈉0.5g,瓊脂2-2.5g37℃,在試管中培養(yǎng)24h，茄形瓶培養(yǎng)8h，錐形瓶培養(yǎng)16h。

2種子培養(yǎng)

培養(yǎng)基用玉米漿30kg，加水至300kg，接種量1%-1。5%，37℃，通氣攪拌培養(yǎng)4-8h.L-天冬酰胺酶的生產(chǎn)工藝第二十二頁，共29頁。一、總述3發(fā)酵罐培養(yǎng)取玉米漿100Kg，接種量8%，37℃，通氣攪拌培養(yǎng)6-8h，離心分離發(fā)酵液，得菌體加2倍量丙酮攪拌，壓濾，濾餅過篩，自然風(fēng)干成菌體干粉。4蔗糖溶液抽提將菌體細(xì)胞中加入5倍體積的蔗糖溶液（蔗糖40%溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30℃振蕩2h,8000r/min離心，收取上層酶液。L-天冬酰胺酶的生產(chǎn)工藝第二十三頁，共29頁。5硫酸銨分級(jí)沉淀

取上述酶液，加入（NH4)2SO4至55%飽和度，調(diào)PH至7.0，室溫?cái)嚢?h，離心除去沉淀，取上清液加入（NH4)2SO4到90%飽和度，離心收集沉淀。6L-天冬酰胺酶的分離純化

將沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸緩沖液溶解并透析，透析后的酶液，通過預(yù)先用10mmol/L，PH7.6磷酸緩沖液平衡的DEAE-纖維素層析柱（1cm×30cm）,用30mmol/L磷酸緩沖液洗脫，流速為40mL/h,收集天冬酰胺酶活性組分，再調(diào)整PH4.8,通過預(yù)先用50mmol/L,PH4.9的磷酸緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱（1cm×8cm）,用50mmol/L,PH5.2的磷酸緩沖液洗脫，收集酶活性組分，冷凍干燥，即得L-天冬酰胺酶凍干粉，總收率為31%，比活為220U/mg蛋白。L-天冬酰胺酶的生產(chǎn)工藝第二十四頁，共29頁。

Erwinase獲準(zhǔn)用于治療對大腸桿菌源性天冬酰胺酶過敏的急性淋巴細(xì)胞性白血病患者2011年11月18日，EUSA制藥和美國食品藥品管理局(FDA)宣布孤兒藥Erwinase獲準(zhǔn)用于治療對大腸桿菌源性的天冬酰胺酶有超敏反應(yīng)的急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)患者。

Erwinaze是一種可降低循環(huán)血液中天門冬酰胺水平的天冬酰胺酶。天門冬酰胺是細(xì)胞生長的必需氨基酸，將其從血液中清除可抑制ALL相關(guān)細(xì)胞的生長。天冬酰胺酶產(chǎn)品來源于細(xì)菌，近15%~20%的患者可對大腸桿菌源性的現(xiàn)代制劑產(chǎn)生超敏反應(yīng)因而無法持續(xù)治療。Erwinaze是由歐文氏菌產(chǎn)生的，在免疫學(xué)性質(zhì)上有別于原有的制劑，適用于對大腸桿菌源性治療有超敏反應(yīng)的患者。

FDA批準(zhǔn)Erwinase是基于相關(guān)的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果，共涉及630例ALL患者。在一項(xiàng)納入58名受試者的關(guān)鍵性療效研究中，100%的可評估患者達(dá)到了天冬酰胺酶活性主要終點(diǎn)。Erwinaze的不良反應(yīng)：過敏反應(yīng)、胰腺炎、轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素水平升高、血栓形成、出血、高血糖癥、惡心和嘔吐。

L-天冬酰胺酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)展

1、Erwinase獲準(zhǔn)用于治療對大腸桿菌源性天冬酰胺酶過敏的急性淋巴細(xì)胞性白血病患者第二十五頁，共29頁。

2、靜脈注射天冬酰胺酶對于55歲左右新診斷急性成淋巴細(xì)胞白血病誘導(dǎo)緩解期治療的藥效動(dòng)力學(xué)以及安全性

與兒童相比，天冬酰胺酶成人治療的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)以及安全性信息非常有限。研究人員采用單次靜脈注射天門冬酰胺酶(2000IU/m(2))作為25例成人患者誘導(dǎo)緩解的線藥物，并在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得血清樣本。結(jié)果可見，天門冬酰胺酶活性血清峰濃度的總體均值為1IU/ml，消除半衰期為7天，分布容積為2.43L/m(2)。單劑量給藥后，患者2小時(shí)后完全去氨基，并分別在14、21和28天完成100%、81%和44%。藥效動(dòng)力學(xué)相關(guān)模型顯示，0.2IU/ml的最小酶活性最適天門冬酰胺酶消除。動(dòng)態(tài)的POSTHOC分析顯示酶活性可以持續(xù)3個(gè)星期或更長。1例患者在給藥后22天產(chǎn)生了抗天門冬酰胺酶抗體。天門冬酰胺酶耐