基因工程制藥技術(shù)

基因工程制藥技術(shù)第1頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四分子克隆：是在體外對DNA分子按照既定的目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得DNA分子大量復(fù)制，并使受體細(xì)胞獲得新得遺傳特征的過程基因工程：利用分子克隆技術(shù)來操作目的基因，并改變生物的遺傳性狀的過程就稱為基因工程。第2頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四基因工程最基本的必備的材料：工具酶載體目的基因原核或真核宿主細(xì)胞第4頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四分子克隆的基本過程:分：得到目的基因切：將目的基因和載體用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割接：將目的基因和載體連接，形成重組子轉(zhuǎn)：將重組子轉(zhuǎn)到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中篩：篩選出含正確重組子的宿主細(xì)胞，擴(kuò)增第5頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)

基因工程中常用工具酶第6頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四工具酶分類使核酸降解的核酸酶類：核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶催化核酸合成的酶類：DNA聚合酶，RNA聚合酶，連接酶，逆轉(zhuǎn)錄酶核酸修飾酶類：甲基化酶，激酶，基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶，磷酸酶等第7頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四一、

限制性核酸內(nèi)切酶概念的提出及背景：

30年代初，微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，微生物的噬菌體不能交叉感染（“細(xì)菌免疫”）。限制現(xiàn)象（限制性內(nèi)切酶）修飾現(xiàn)象（甲基化酶）1962年W.Arber提出；菌體中含有2種以上功能不同的酶：核酸內(nèi)切酶（限制）

DNA甲基化酶（修飾）第8頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease，RE)

是由細(xì)菌自己產(chǎn)生的一種能識別雙鏈DNA中的特定序列，并以內(nèi)切方式水解核酸中磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。第9頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四1．限制性核酸內(nèi)切酶的分類：I型RE：由三種不同的亞基組成。需Mg++，S-腺苷甲硫氨酸（SAM），ATP為輔助因子；識別位點復(fù)雜，特異性差。通常在識別位點的400~7000bp范圍內(nèi)切割DNA?，F(xiàn)已報道19種。第10頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四Ⅲ型RE；由兩種亞基組成。需Mg++，ATP為輔助因子；切割位點靠近識別序列但較難預(yù)測。一般在25~27bp范圍內(nèi)切割。現(xiàn)已報道4種。I、Ⅲ型RE酶同時具有限制(剪切)與修飾(甲基化)兩種功能并依賴于ATP，切割DNA鏈的位置遠(yuǎn)離識別序列，因此I型和Ⅲ型酶在DNA重組技術(shù)中都不常用。第11頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四Ⅱ型RE實際應(yīng)用價值最大，這是因為：①Ⅱ型酶只具有限制性活性，無甲基化修飾活性；②

對DNA的切割要求嚴(yán)格的序列作為靶位點，切割精確；③

此類酶作用時只需Mg2+參與，無需ATP。因此Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被譽為“分子生物學(xué)家的手術(shù)刀”。第12頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四2．限制性內(nèi)切酶的命名目前已廣泛采用Smith和Nathams于1973年提出的命名系統(tǒng)：限制性內(nèi)切酶第1個大寫字母：來自細(xì)菌的屬名(genus)，第2、3個小寫字母：來自種名(species)，第四個字母代表菌株(strain)第13頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四3．Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的作用特點：被分子生物學(xué)家廣泛研究應(yīng)用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有200多種識別序列的REMW=60KD的單鏈多肽最適pH：6~8NaCl有抑制作用，Mg2+激活，巰基有保護(hù)作用熱不穩(wěn)定。第14頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四作用特點：有嚴(yán)格的識別、切割的DNA序列，并以內(nèi)切的方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵。識別序列一般為4～6個堿基對。切割靶序列的大小決定了切割DNA鏈后產(chǎn)生的DNA片段的長短切割后產(chǎn)生平頭或粘性末端。只需Mg2+，不需ATP。第15頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四4.Ⅱ型酶切割dsDNA可產(chǎn)生兩種不同的切口1.平頭末端(bluntend)即在識別序列的對稱軸上進(jìn)行切割；2.

粘性末端(cohesiveend)即在識別序列的兩個對稱點切開DNA雙鏈，產(chǎn)生末端帶有單鏈尾巴的切口。根據(jù)突出端不同分為：5’粘性末端和3’粘性末端。第16頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四Ⅱ型酶切割dsDNA產(chǎn)生的兩種不同的切口第17頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第18頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四5.三類特殊性質(zhì)的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶：同裂酶(isoschizomer)：又稱源同異工酶，即識別位點相同，但切割位點可以相同，也可以不同，例如SamI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)第19頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四Sau3AIBamHIGATC GGATCCCTAG CCTAGG

SauI XhoIGTCGAC CTCGAGCAGCTG GAGCTC同尾酶(isocaudarmer)：不同來源的酶其識別和切割序列有一定的相關(guān)性，作用后能產(chǎn)生相同的粘性末端。第20頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四可變酶：此種酶所識別DNA序列中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別序列往往超過6個堿基對，例如BstpI識別序列為：GGTNACC，其中N為一可變堿基。第21頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四6.RE識別序列呈反向?qū)ΨQ，分為四種類型回文結(jié)構(gòu)：（Palindrome）↓如：EcoRI：5，—G

AATTC—3，

3，—CTTAA

G—5，↑間斷回文結(jié)構(gòu)（interruptedPalindrome）↓如：BgI：5，—GCCNNNN

NGGC—3，

3，—CGGN

NNNNCCG—5↑第22頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四簡并序列（degeneratesequence）又稱“松弛”特異識別，即識別位點中某些核苷酸可以被其他核苷酸替換。↓如：ＡｖａⅡ：5’—ＧＧＡ／ＴＣＣ—3’

3’—ＣＣＴ／ＡＧＧ—5’↑非回文結(jié)構(gòu)：↓如：ＭｂｏⅡ：5’—ＧＡＡＧＡＮ—3’

3’—ＣＴＴＣＴＮ—5’↑第23頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四7．限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用

限制性內(nèi)切酶除作為基因工程中剪切DNA的工具外，還廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域內(nèi)。繪制物理圖譜及基因同源性比較DNA測序及基因組分析基因突變與遺傳性疾病的診斷等改造及重組質(zhì)粒DNA克隆及亞克隆的建立第24頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第25頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四8.RE使用時的注意事項要求較純的底物DNAMg2+和Tris-HCl緩沖體系，pH7.2-7.6反應(yīng)體系中不能含有酚、氯仿、乙醚、SDS以及大于10mmol／L的EDTA適合的離子強(qiáng)度二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇低溫或冰浴第26頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四二、DNA聚合酶DNApolymerase分子克隆常用的DNA聚合酶：依賴DNA的大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow大片段T4噬菌體DNA聚合酶TeqDNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶經(jīng)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶（測序酶）耐熱DNA聚合酶依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）第27頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四1．DNA聚合酶I：DNA聚合酶I是Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個DNA聚合酶。此酶是一個多功能酶，包括3種酶活性：①

5’-3’聚合酶活性：催化單核苷酸聚合到DNA的3’-OH末端，使DNA鏈從5’-3’延伸；②5’-3’外切酶活性：即從游離的5’末端降解雙鏈DNA或單鏈DNA成為單核苷酸③3’-5’外切酶活性。另外該酶還具有RNA酶H活性（降解DNA-RNA雜合體中的RNA）。第28頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四DNA聚合酶I作用條件：①

全部4種dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Mg2+②

DNA作為模板，單鏈DNA或有缺口的雙鏈DNA均可；③

需要具有游離3’-OH的引物或缺口的3’末端第29頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四DNA聚合酶I的應(yīng)用：①

催化DNA切刻平移(nicktranslation)反應(yīng)，制備高比活性DNA探針②

第二條cDNA鏈的合成；③

對DNA3’凸出末端進(jìn)行末端標(biāo)記；④

DNA序列分析第30頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四2．Klenow片段

C末端大片段——Klenow片段（70KD）含5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性（保證了DNA復(fù)制的精確性）枯草桿菌

蛋白水解酶

DNA聚合酶I

N末端小片段含5’-3’外切酶活性

第31頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四Klenow片段功能：雙脫氧法序列分析隨機(jī)引物標(biāo)記核酸探針cDNA第二鏈合成對5’凸出粘端補平或?qū)﹄p鏈DNA3’端標(biāo)記PCR技術(shù)：PCR技術(shù)是根據(jù)Klenow酶的5’-3’聚合活性而設(shè)計誕生的第32頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四3．T4噬菌體DNA聚合酶從T4噬菌體感染E.coli中獲得。MW=114KD單鏈多肽。活性與Klenow片段相似：5’-3’聚合活性；3’-5’外切活性。特點：1.外切活性=Klenow片段外切200倍2.外切活性的強(qiáng)度：單鏈底物大于雙鏈底物第33頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四應(yīng)用：補平或標(biāo)記5’凸出粘端。對DNA3’凸出粘端進(jìn)行末端標(biāo)記。用3’-5’外切活性切除3’凸出粘端，甚至形成5’凸出粘端，再用高濃度dNTP標(biāo)記摻入，利用5’-3’聚合活性獲得標(biāo)記物。通過取代反應(yīng)，標(biāo)記核酸探針。第34頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四5’3’3’5’T4DNApol3’—5’外切活性

5’3’

3’5’T4DNApol

32PdNTP

5’3’3’5’ECoRI，BamHIRE消化

5’3’5’3’3’5’3’5’

凝膠電泳提取純化特異探針T4DNA聚合酶的應(yīng)用（標(biāo)記探針）第35頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四4.TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是一種依賴DNA的單亞基耐熱DNA聚合酶，分子量約為65kD。該酶最初由極端嗜熱水生菌Thermusaquaticus中提取并純化，目前已能通過基因工程方式大量生產(chǎn)。第36頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四TaqDNA聚合酶的應(yīng)用TaqDNA聚合酶主要用于PCR中。最適溫度在70～75℃，隨著溫度的降低，酶活性明顯下降。同時此酶缺乏3’-5’外切酶活性，因而無校正功能。第37頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四TaqDNA聚合酶的應(yīng)用條件需Mg2+（1mmol/L）。低濃度Mn2+（2mmol/L）有低活性。Ca2+使其完全失活。一價陽離子高至0.1mol/L對其活性無影響。最適濃度：NaCl=40mmoL/LKCl=60mmol/L最適pH：7.8Tris-HClbuff第38頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四三、DNA連接酶：催化雙鏈DNA中相鄰堿基的5’磷酸和3’羥基間磷酸二酯鍵形成的酶，稱為DNA連接酶(DNAligase)。DNA連接酶主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶

第39頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四1．T4噬菌體DNA連接酶T4DNA連接酶最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離的，分子量68kDa。第40頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四

主要功能及用途：連接雙鏈DNA中一條鏈上的切口連接互補粘性末端的DNA片段（連接反應(yīng)通常在12~15℃下進(jìn)行）DNA分子間的平頭末端（平端的連接通常在室溫下進(jìn)行）第41頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四2．大腸桿菌DNA連接酶特點：①連接雙鏈DNA中一條鏈上的切口②間存在的互補粘性末端的DNA片段需NAD+③連接平頭末端DNA分子需聚乙二醇或Ficoll①、②情況下可代替T4DNA連接酶，它產(chǎn)生的背景低，準(zhǔn)確性高。第42頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌DNA連接酶功能可修復(fù)dsDNA中的單鏈切口，并可催化互補黏性末端的連接，主要用于cDNA第二鏈的合成。能促進(jìn)平端連接，但效率仍很低；在非平端連接時可代替T4DNA連接酶，它產(chǎn)生的背景低，準(zhǔn)確性高。第43頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四四、反轉(zhuǎn)錄酶：能以RNA為模板合成DNA的DNA聚合酶稱為反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase，RT)，合成的DNA產(chǎn)物稱為互補DNA(complementaryDNA，cDNA)。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有禽類成骨細(xì)胞性白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和Moloney小鼠白血病病毒(Mo-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶第44頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四反轉(zhuǎn)錄酶的作用特點：以單鏈RNA或單鏈DNA為模板合成DNA，可用于cDNA第一鏈和第二鏈的合成有5’-3’和3’-5’RNA外切酶活性，3’-5’RNA外切酶活性可用于降解RNA-DNA雜交分子中RNA缺乏3’-5’DNA核酸外切酶活性第45頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四反轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用：cDNA的合成補平和標(biāo)記DNA的3’

末端代替Klenow片段雜交探針的制備第46頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四五、末端轉(zhuǎn)移酶

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminaldeosynucleotidyltransferase，TdT)多從小牛胸腺中分離出，能催化多個脫氧核苷酸依次加到DNA3’末端。第47頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用特點：此酶活性尤以帶3’突出的DNA作為受體為佳在含有Mg2+、Co2+和Mn2+的低離子強(qiáng)度緩沖液中此酶也能作用于3’平端或5’凹端的DNA分子，若加入嘧啶核苷酸，則以Co2+為首選陽離子；若加入嘌呤核苷酸，則以Mg2+離子為首選陽離子。第48頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用：末端轉(zhuǎn)移酶常用于給載體或cDNA加上互補的多聚尾巴，構(gòu)建人工粘性末端；也用于DNA分子3’端標(biāo)記。第49頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四六、堿性磷酸酶：

堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)來源于大腸桿菌和牛小腸，能水解DNA、RNA以及脫氧核糖三磷酸(dNTP)上的5’磷酸根。第50頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四堿性磷酸酶應(yīng)用：①在分子克隆的連接反應(yīng)中預(yù)先處理載體DNA片段，以去除5’-P，防止載體重新自體連接，以提高重組效率；②用32P標(biāo)記5’末端時，用此酶去除5’-P，再用激酶對5’末端進(jìn)行同位素標(biāo)記；③作為化學(xué)發(fā)光物測定或其他檢測系統(tǒng)的指示酶。第51頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第52頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四七、依賴于DNA的RNA聚合酶

常用的有噬菌體SP6、T7、T3RNA聚合酶，其中SP6RNA聚合酶來源于SP6噬菌體感染的鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)，T7、T3RNA聚合酶源自大腸桿菌，目前這些RNA聚合酶已能用基因工程的方法大量制備。第53頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四依賴于DNA的RNA聚合酶功能可以識別雙鏈DNA模板上相應(yīng)的噬菌體特異性啟動子，起始RNA的合成．可用于合成單鏈RNA以作為雜交用探針、體外翻譯系統(tǒng)中的功能性mRNA，體外剪接反應(yīng)的底物；也可以直接用于原核或真核細(xì)胞中克隆基因的表達(dá)。第54頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)基因克隆常用載體所謂載體(vecter)是指能在連接酶作用下和外源DNA片段或基因連接，并運送DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子。目前用于基因克隆的載體種類繁多，包括在大腸桿菌中使用的質(zhì)粒、噬菌體載體、酵母菌質(zhì)粒載體以及動、植物病毒載體等

第55頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四載體的發(fā)展概況

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322第二階段：增大載體容量(降低載體長度)，建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達(dá)載體及各種探針載體第56頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四載體必須具備以下基本條件：能自我復(fù)制具備多種限制性內(nèi)切酶的識別位點：多克隆位點(multipleclonesite,MCS)具有多個利于選擇和篩選標(biāo)記有足夠的容量，具有拷貝數(shù)高、易與宿主細(xì)胞的DNA分子分離并易提取、抗剪切力強(qiáng)。表達(dá)型載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)調(diào)控元件第57頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記基因的種類

1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr

，Tcr

，Cmr，Kanr，G418r，Hygr，Neorb.重金屬抗性基因:Cur

，Znr

，Cdrc.代謝抗性基因:TK，抗除草劑基因

2）營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

主要是參與氨基酸、核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。

3）生化標(biāo)記基因

其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ,GUS,CAT

第58頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四常用的遺傳標(biāo)記基因

1)氨芐青霉素抗性基因（Apr）

Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化β—內(nèi)酰胺環(huán)的水解，使氨芐青霉素失活。2)四環(huán)素抗性基因（Tcr）

Tetracycline可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。

第59頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四遺傳選擇標(biāo)記：

氨芐青霉素抗性(ampicillinresistance，ampr)基因：

Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。Ampr基因編碼β內(nèi)酰胺酶，催化β-內(nèi)酰胺環(huán)的水解，使氨芐青霉素失活而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。

第60頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四四環(huán)素抗性(tetracyclineresistance，tetr)基因：

Tetracycline可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。Tetr基因編碼一種膜相關(guān)蛋白，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。第61頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四氯霉素抗性基因（Cmr）

Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；?，導(dǎo)致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上?？敲顾?Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。來自轉(zhuǎn)座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。第62頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四

不同的質(zhì)粒具有不同的抗藥基因，質(zhì)粒的Ampr、Tetr基因若被外源基因插入而失活，就失去了耐藥性，因此抗藥基因常作為基因工程的篩選標(biāo)志。第63頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第64頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四Ampicillinresistant?yes

yesTetracyclineresistant?NoyesBXBBBXAmproriAmprTcroripBR322AmprTcroriScreeningbyinsertionalinactivationofaresistancegene第65頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四backReplicaplating:transferofthecoloniesfromoneplatetoanotherusingabsorbentpadorVelvet(絨布).transferofcolonies+ampicillin+ampicillin+tetracyclinethesecolonieshavebacteriawithrecombinantplasmid第66頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌LacZ基因：

LacZ基因編碼半乳糖苷酶。用含有X-gal的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌時，在細(xì)菌的乳糖操縱子(Lacoperon)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的作用下，細(xì)菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落變?yōu)樗{(lán)色；如果LacZ基因被外源DNA分子插入而遭到破壞，則不能生成相應(yīng)的半乳糖苷酶，菌落為白色。通過觀察菌落的顏色，能方便地進(jìn)行基因克隆的篩選工作。第67頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四β-半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)β-半乳糖苷酶基因的優(yōu)點:

a.

酶催化X-Gal水解為藍(lán)色產(chǎn)物，檢測直觀

b.

lacZα編碼5'-端可容許很大的變化而不影響酶活性

c.lacZα和β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大第68頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四LacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物重組DNA分子轉(zhuǎn)化E.coli

外源DNABamHI片段

pUC18BamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子第69頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四1．質(zhì)粒載體：

質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌染色體外的遺傳單位，自身含有復(fù)制起始點，與相應(yīng)的順式調(diào)控元件組成一個復(fù)制子(replicon)，能利用細(xì)菌的酶系統(tǒng)進(jìn)行獨立的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄。

第70頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四用于基因克隆的質(zhì)粒載體具有以下特點：

分子較小，比較穩(wěn)定，拷貝數(shù)高。含有高效的復(fù)制子，能在細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成受阻，染色質(zhì)DNA合成停止時，利用細(xì)菌的酶系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)粒自身的復(fù)制。因此在實驗中常利用氯霉素以阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，而使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加至數(shù)千。具有多種遺傳選擇標(biāo)記，包括各種抗藥基因或營養(yǎng)代謝基因等。

第71頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四pBR322

：pBR322是研究得最清楚應(yīng)用也最廣泛的質(zhì)粒，全長4363bp，由3種野生質(zhì)粒成分構(gòu)建而成，含有Ampr和Tetr兩個抗藥基因標(biāo)記，一個復(fù)制起始點(ori)，復(fù)制子為ColEI。其中ori來自pM9，Ampr來自pRSF2124，Tetr來自pSC101。在Ampr和Tetr基因中共含有8個限制性酶切位點，以供外源DNA片段的插入。其中在Ampr

基因中的單一酶切位點有PstⅠ、PvuⅡ等；在Tetr基因中的位點有BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ等。第72頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第73頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四pUC18／pUC19

pUC系列質(zhì)粒是由大腸桿菌pBR質(zhì)粒和M13噬菌體改建而成的質(zhì)粒載體。全長2674bp，具有氨芐青霉素抗性基因，一個復(fù)制起始點，復(fù)制子為ColEI。pUC系列質(zhì)粒帶有一段大腸桿菌Lac操縱子DNA片段，能編碼β-半乳糖苷酶氨基端的一部分，同時與大腸桿菌的gal-基因互補。第74頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四

當(dāng)pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到gal-的宿主菌后，在含有誘導(dǎo)物IPTG和生色底物X-gal的培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落；如果外源DNA片段克隆到pUC的LacZ基因區(qū)域時，造成LacZ基因失活，在含有IPTG、X-gal的培養(yǎng)基上將生成白色菌落。第75頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第76頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第77頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四Recreatedvector:bluetransformantsRecombinantplasmidcontaininginsertedDNA:whitetransformantsRecreatedvector(noinsert)Recombinantplasmid(containinsert)第78頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四2．λ噬菌體

λ噬菌體的基因組DNA長度約為50kb，基因組比較復(fù)雜，共含有66個基因。從λ噬菌體顆粒中分離出的DNA分子為雙鏈線狀，當(dāng)感染細(xì)胞后，λ噬菌體連接形成雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并按造θ方式和滾環(huán)方式復(fù)制。λ噬菌體感染細(xì)菌后可進(jìn)行裂解性生長和溶源性生長。

第79頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第80頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四λ噬菌體作為載體具有兩個特點：

λ噬菌體生長繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌體基因組中央含有約30％的DNA是λ噬菌體生長所非必需的。λ噬菌體的成熟需要經(jīng)過包裝，當(dāng)與外源DNA片段重組后的大小介于原來的78％一105％之間時，重組的DNA分子才可包裝為成熟的噬菌體顆粒。

第81頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四λ噬菌體載體類型：置換型載體(replacementvectors)：允許外源DNA片段代替自身的生長非必需區(qū)，這種克隆方式容納的外源DNA片段可達(dá)30kb。插入型載體(insertionvectors)：允許克隆的外源DNA片段較小，一般為7kb以下。第82頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四

目前已構(gòu)建了大量的λ噬菌體載體，例如Charon系列、λgt系列、EMBL系列等各種類型的載體。第83頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第84頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四λgtⅡ：長43700bp，改造后含有LacZ片段，克隆位點是EcoRⅠ，位于LacZ的羧基端，插入的外源片段可達(dá)7kb。重組的λgtⅡ因LacZ基因的失活，在X-gal培養(yǎng)基中形成白斑，而未重組的λgtⅡ形成藍(lán)斑。第85頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四3.病毒載體：

在目前廣泛使用的各種真核病毒載體中均含有各種相似的調(diào)控序列，包括DNA在真核細(xì)胞中的復(fù)制起始點、啟動子、剪切位點、多聚腺苷化信號、增強(qiáng)子等。第86頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四反轉(zhuǎn)錄病毒載體(retrovialvector)

反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)是一種RNA病毒，基因組全長8～10kb，該RNA有mRNA的功能，其5’端是甲基化帽子結(jié)構(gòu)，3’端是polyA尾巴。第87頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四反轉(zhuǎn)錄病毒一般含有3個基因：結(jié)構(gòu)蛋白基因(gag)、反轉(zhuǎn)錄酶基因(pol)、糖蛋白基因(env)。許多反轉(zhuǎn)錄病毒還含有一個癌基因(onc)能使感染細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。在反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的兩端分別有一個長末端重復(fù)序列(longterminalrepeat，LTR)，其中含有啟動子、增強(qiáng)子、整合信號及多聚腺苷化信號等調(diào)控序列。第88頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四反轉(zhuǎn)錄病毒改造為載體：

用標(biāo)記基因和外源基因替代病毒的編碼基因制備輔助細(xì)胞為載體DNA提供其喪失的功能將載體DNA導(dǎo)入輔助細(xì)胞以產(chǎn)生有感染力的病毒載體病毒載體感染靶細(xì)胞，外源基因在細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)反轉(zhuǎn)錄病毒載體：通過基因工程改造，使病毒載體成為只有一次感染能力的重組RV載體。第89頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四反轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點：具有穿透細(xì)胞的能力，可使近100％的受體細(xì)胞被感染，轉(zhuǎn)化細(xì)胞效率高；能感染廣譜動物物種和細(xì)胞類型而無嚴(yán)格的組織特異性；隨機(jī)整合的病毒可長期存留，且單拷貝、單位點，很少發(fā)生重排；容量大，可包裝10kB外源基因第90頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四反轉(zhuǎn)錄病毒載體缺點：這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細(xì)胞的染色體，而不適合于那些不能正常分裂的細(xì)胞，如神經(jīng)元。最嚴(yán)重的問題是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細(xì)胞感染病毒和致癌的危險性。操作較復(fù)雜第91頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四操作過程：

目的基因+有缺陷的反轉(zhuǎn)錄病毒↓重組DNA裝入質(zhì)?！龑?dǎo)入輔助細(xì)胞↓分泌有感染力的病毒顆?！腥舅拗骷?xì)胞↓培養(yǎng)2~3天↓篩選第92頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四①

卸甲載體(disarmedvector):

以用完整的反轉(zhuǎn)錄病毒雙鏈DNA為載體，將外源DNA片段取代反轉(zhuǎn)錄病毒中的癌基因，這樣的載體就稱為卸甲載體。目前已構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒載體有兩種第93頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四②穿梭載體(shuttlevector):是一種既能在原核細(xì)胞又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的載體，由反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR、包裝信號和質(zhì)粒的復(fù)制起始點、篩選元件等成分重組而成。由于此類載體缺乏反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)基因，需要野生病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白，以形成有感染力的重組體。目前此類載體已成為表達(dá)外源基因的重要基因工程載體。第94頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四1.用反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體需要相應(yīng)的包裝細(xì)胞，以形成完整的體系。2.包裝細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)蛋白，與帶有外源基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體分子一起生成能高效感染靶細(xì)胞的病毒顆粒。反轉(zhuǎn)錄病毒載體的作用條件：第95頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四

目前常用的反轉(zhuǎn)錄病毒載體有多種，例如經(jīng)Moloney小鼠白血病病毒(Mo-MLV)改造構(gòu)建成的載體，其宿主廣泛，傳染率極高，是目前最常用的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。包裝細(xì)胞也有多種，均由穩(wěn)定的小鼠成纖維細(xì)胞系或QT6鵪鶉細(xì)胞系衍生而來，如第一代的ψ-2、ψ-am；第二代的PA3l7；新一代的ψCRIP，原則上包裝細(xì)胞應(yīng)避免產(chǎn)生具有復(fù)制力的野生型病毒。第96頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四SV40(Simianvirus40)(猴腎病毒)載體

SV40是一種小型球狀病毒，其基因組為共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA，長5243bp，編碼5種蛋白質(zhì)。SV40病毒顆?？芍苯幼鳛榭寺≥d體使用，外源DNA以置換的方式取代SV40的晚期區(qū)和早期區(qū)形成重組體。

第97頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四

直接用作克隆載體時存在許多缺點，因此目前已對其進(jìn)行了相應(yīng)的改造，衍生出一系列的SV40載體，能在多種哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，對基因組DNA和cDNA均能表達(dá)，對插入的外源基因大小無限制。目前常用的SV40衍生載體有pSVT7、pMT2等，它們都可進(jìn)行外源基因的瞬時表達(dá)，廣泛用于基因表達(dá)研究的各個領(lǐng)域。

第98頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四昆蟲病毒載體：

目前最常用的昆蟲病毒載體是桿狀病毒載體系統(tǒng)。桿狀病毒(baculovirus)是一種大型、有包被的雙鏈DNA病毒，主要感染節(jié)肢動物。

第99頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四桿狀病毒載體的特點：是真核表達(dá)系統(tǒng)，可直接進(jìn)行蛋白修飾加工；重組區(qū)是病毒生長非必需區(qū)，基因組較大，可插入的外源DNA片段較大；含有一個強(qiáng)包含體蛋白啟動子不感染脊椎動物，比較安全；第100頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四4.酵母人工染色體載體：酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)載體可克隆和分離的DNA片段達(dá)l000kb。由于YAC系統(tǒng)作為載體其容量大，故能保持克隆基因的完整性，而且利用YAC構(gòu)建人類的基因組文庫，只需數(shù)千個重組體即可滿足需要。

第101頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四YAC的調(diào)控元件：(1)著絲粒(centromere)，以保證染色體在分裂過程中能正確分配到子代細(xì)胞。(2)端粒(telomere)，作為染色體復(fù)制所必需的成分，能防止染色體被核酸外切酶降解，(3)復(fù)制起始點、限制性酶切位點和篩選標(biāo)記。(4)原核序列及調(diào)控元件，包括大腸桿菌復(fù)制起始點、Ampr基因等，以利于在大腸桿菌中操作。第102頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四重組DNA技術(shù)的基本過程第三節(jié)目的基因的分離與制備第四節(jié)目的基因的體外重組第五節(jié)重組子導(dǎo)人宿主細(xì)胞第六節(jié)陽性重組子的篩選和鑒定第103頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)目的基因的分離與制備一、通過基因組文庫分離、篩選基因二、cDNA文庫分離、篩選基因三、人工合成基因四、應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)獲取目的基因五、高通量獲取目的基因

第104頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四一、通過基因組文庫分離、篩選基因基因組文庫(genomiclibrary)是指用基因克隆的方法保存在適當(dāng)宿主中的DNA重組分子的集合，所有重組子所含的插入片段的總和代表某種生物基因組全部核酸序列。基因組文庫的構(gòu)建是將細(xì)胞中的基因組DNA切割成一定大小的片段，與合適的載體(λ噬菌體、質(zhì)粒、YAC系統(tǒng)等)進(jìn)行重組，并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。第105頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四在進(jìn)行任一基因篩選時達(dá)到99％以上的概率，這種方法類似于霰彈打鳥，因此也稱為鳥槍法。要從如此龐大的文庫中篩選出某一特定基因十分困難，尤其是單拷貝基因。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如分子雜交及探針技術(shù)的應(yīng)用等，從基因組文庫中篩選出特定基因已無大的困難。第106頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四二、cDNA文庫分離、篩選基因

cDNA文庫(cDNAlibrary)是指利用基因克隆的方法保存在宿主細(xì)胞中的DNA重組體的群體，每一重組子只含一種mRNA信息，這些重組子的總和包含某種生物的全部mRNA序列。

第107頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四cDNA文庫是以mRNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，經(jīng)雙鏈化后與合適的載體重組并導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成的。cDNA文庫中的插入片段是由mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成，可直接指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和翻譯。亦即針對不同的組織或細(xì)胞所建立的cDNA文庫代表各自特定的mRNA表達(dá)譜。

第108頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四基因組DNA文庫cDNA文庫第109頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四三、人工合成基因：

知道目的基因的結(jié)構(gòu)與核苷酸序列及其他相關(guān)的基因信息。對于短片段(20～30bp)的合成效率較高，對于較長的基因片段的合成，必須先按照已知的DNA序列將其劃分為較短的片段，由合成儀逐一合成，再拼接成大片段。

第110頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四四、應(yīng)用PCR獲取目的基因

選擇不同的DNA分子為模板，通過PCR擴(kuò)增以獲取包括外顯子、內(nèi)含子以及相應(yīng)調(diào)控元件的完整基因片段；還可以用RNA分子為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增生成cDNA以獲得大量的不含內(nèi)含子及調(diào)控序列，只含有結(jié)構(gòu)基因的DNA片段。通過PCR技術(shù)獲取的DNA片段可直接用于后續(xù)的基因克隆、探針制備、cDNA文庫的建立等眾多的分子生物學(xué)研究中。第111頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四五、高通量獲取目的基因

系統(tǒng)生物學(xué)、組學(xué)(Omics)、高通量消減雜交技術(shù)：抑制性消減雜交(SSH)等基因芯片分析技術(shù)第112頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第四節(jié)目的基因的體外重組

DNA分子的體外重組:是DNA分子之間的連接過程。這是一個DNA連接酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)。第113頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四幾種常用的DNA分子連接方法

粘性末端連接法(cohesiveendligation)平頭末端連接法(bluntendligation)人工接頭法(artificallinker)同源多聚尾序(homopolymerictails)連接法第114頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四1．粘性末端連接法(cohesiveendligation)

這種方法適用于插入片段和載體分子具有相同的粘性末端(cohesiveend)，相同的粘性末端在DNA連接酶的作用下很容易重新連接在一起。

第115頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四II類限制酶一般識別長度為4個或6個呈二重對稱的核苷酸特異序列第116頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四粘性末端連接法存在以下幾點缺陷：高背景即存在一定數(shù)量的載體自身環(huán)化分子

雙向插入

可采用定向克隆方式，即對載體和插入片段均使用兩種內(nèi)切酶進(jìn)行處理。多拷貝插入將造成表達(dá)困難。適當(dāng)調(diào)整插入片段與載體分子的比例能減少多拷貝插入的產(chǎn)生，一般采用2:1(插入片段摩爾數(shù):載體摩爾數(shù))第117頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四2．平頭末端連接法(bluntendligation)

平頭結(jié)構(gòu)，在T4DNA連接酶的作用下同樣能進(jìn)行連接。但是這種連接方式的效率較低。這時應(yīng)適當(dāng)增加酶量，提高反應(yīng)中底物的濃度并延長反應(yīng)時間。

第118頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四3．人工接頭法(artificallinker)

人工接頭主要用于在DNA分子的平頭末端上添加新的內(nèi)切酶位點以產(chǎn)生粘性末端，以提高連接效率。人工接頭大小一般為8~12個堿基對。第119頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四4．同源多聚尾序(homopolymerictails)連接法

末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）能催化脫氧核苷酸逐個添加到單、雙鏈DNA分子的3’-OH末端上。目的DNA分子與載體分子可通過多聚尾巴的同源互補連接在一起。末端轉(zhuǎn)移酶的最適底物是具有3’端突出的雙鏈DNA。第120頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四同源多聚尾序連接法要求DNA分子內(nèi)部必須完整，即兩個DNA鏈間不存在缺口；否則末端轉(zhuǎn)移酶也會在3’-OH上加入多聚尾巴，破壞了DNA分子活性。由于在重組分子中加入了新的核苷酸序列，從而影響了DNA片段表達(dá)的真實性，而且外源DNA片段一般難以從載體上完整切下并回收。第121頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四定向克?。憾ㄏ蚩寺∈侵笇⑼庠碊NA片段定向插入到載體中的方法。要做到定向插入則要求載體DNA分子的兩端不能互補，同時外源DNA分子的末端是不相互補的粘性末端，或者一端為粘性末端，另一端為平頭末端。

第122頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第123頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第五節(jié)重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞體外重組生成的重組子必須導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞中才能進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)。宿主細(xì)胞分為兩種：原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。

第124頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四質(zhì)粒DNA分子或以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。通過噬菌體的釋放和感染將DNA從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。轉(zhuǎn)染：是由轉(zhuǎn)化和感染兩個詞構(gòu)成的新詞，指真核細(xì)胞主動或被動導(dǎo)入外源DNA的過程。第125頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四

宿主細(xì)胞重組載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞質(zhì)粒感染（轉(zhuǎn)導(dǎo)）原核細(xì)胞噬菌體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞質(zhì)粒、病毒第126頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四感受態(tài)細(xì)菌(competentcell):

系指利用理化的方法人工誘導(dǎo)細(xì)菌，使之處于易于吸收和容納外源DNA分子的狀態(tài)，這時的細(xì)菌就稱為感受態(tài)細(xì)菌。

一、轉(zhuǎn)化第127頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四（一）感受態(tài)細(xì)菌的制備：用冰預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)菌：即用低滲CaCl2溶液在0℃時處理快速生長的細(xì)菌，從而獲得感受態(tài)細(xì)菌。此時細(xì)菌膨脹成球型，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)菌表面。第128頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四（二）DNA進(jìn)入細(xì)胞：通過熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對DNA的吸收。然后將細(xì)菌接種于含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上，含有重組子的感受態(tài)細(xì)菌將形成單菌落。這時可挑選單菌落進(jìn)行相應(yīng)的篩選及鑒定分析。

第129頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四二、λ噬菌體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

λ噬菌體能將自身的DNA分子注入到宿主細(xì)胞內(nèi)，但DNA分子必須被λ噬菌體的蛋白包裝形成成熟的噬菌體顆粒以后才能完成感染過程。因而應(yīng)用λ噬菌體載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源DNA必須先完成體外包裝。

第130頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四體外包裝(invitropackaging)是指在離體條件下，將提取的包裝蛋白與DNA混合，產(chǎn)生噬菌體顆粒的過程。通過噬菌體的釋放和感染將DNA從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)，而通過轉(zhuǎn)導(dǎo)接受外源DNA的細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子(transductant)。

第131頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四第六節(jié)陽性重組子的篩選和鑒定

一、根據(jù)遺傳表型篩選

二、應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切分析篩選

三、核酸探針篩選

四、PCR篩選

五、菌落原位雜交技術(shù)

第132頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四一、根據(jù)遺傳表型篩選

1．抗生素平板篩選2．互補篩選3．插入表達(dá)篩選4．噬菌斑篩選

第133頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四1．抗生素平板篩選

大多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因，常見的有抗氨芐青霉素基因(Ampr)、抗四環(huán)素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入載體的位點在抗藥性基因之外，不導(dǎo)致抗藥性基因的插入失活，仍能編碼抗藥性基因，這種含有重組子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠在含有相應(yīng)藥物的瓊脂平板上生長成菌落。第134頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四

但是除陽性重組子以外．自身環(huán)化的載體、未酶解完全的載體以及非目的基因插入載體形成的重組子均能轉(zhuǎn)化細(xì)胞而能生長，故本法僅是陽性重組子的初步篩選。第135頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四

同樣還可應(yīng)用插入失活雙抗生素對照篩選法，在含有兩個抗藥性基因的載體中，通過插入插入失活其中一個基因，可用兩個分別含有同藥物的平板對照篩選陽性重組子。第136頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四Ampicillinresistant?yes

yesTetracyclineresistant?NoyesBXBBBXAmproriAmprTcroripBR322AmprTcroriScreeningbyinsertionalinactivationofaresistancegene第137頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四Replicaplating:transferofthecoloniesfromoneplatetoanotherusingabsorbentpadorVelvet(絨布).transferofcolonies+ampicillin+ampicillin+tetracyclinethesecolonieshavebacteriawithrecombinantplasmid第138頁，共160頁，2023年，2月20日，星期四2．互補篩選：

利用-半乳糖苷酶基因構(gòu)建的載體如pUC系列的質(zhì)粒常采用互補篩選。載體中帶有大腸桿菌Lac操縱子的調(diào)節(jié)序列和編碼-半乳糖苷酶N末端145個氨基酸的序列（亞基）。用IPTG可誘導(dǎo)這個片段的合成，合成的片段能