實驗四過碘酸雪夫反應

細胞化學染色是細胞學和化學相結合的一門科學。它是以細胞形態(tài)學為基礎，根據(jù)化學反應的原理、應用涂片染色的方法觀察細胞的化學成分及其變化的重要方法。細胞化學染色研究的對象：細胞和組織中的化學物質細胞化學染色的要求：1.保持細胞的生前結構。2.保存細胞生前的化學成分和酶的活性。3.所用方法是已知的化學反應或物理變化。4.反應產物必須是一種有色物質，可以進行顯微鏡觀察。5.反應產物不能移位，必須有一定的穩(wěn)定性。現(xiàn)在是1頁\一共有30頁\編輯于星期三細胞化學染色的步驟：1.固定：將細胞的生前結構和化學物質保存下來。2.顯示：通過一系列化學反應形成穩(wěn)定的有色沉淀。3.復染：使各種細胞都顯示出來以便于觀察。細胞化學染色的實用價值一、協(xié)助白血病的診斷1.急性白血病細胞類型的鑒別。檢查順序：POXPASNAE+NaFNCE2.協(xié)助慢性白血病的診斷。NAPPAS二、協(xié)助貧血的診斷1.缺鐵性貧血：鐵染色2.再障：NAP3.鐵粒幼細胞性貧血：鐵染色三、鑒別某些容易混淆的細胞以協(xié)助診斷四、協(xié)助鑒別良性與惡性的淋巴細胞疾病五、協(xié)助兩種感染的鑒別現(xiàn)在是2頁\一共有30頁\編輯于星期三實驗四過碘酸-雪夫反應(糖原染色)

[目的要求]1．掌握本實驗的原理和臨床意義。2．熟悉本實驗的操作方法及注意事項。[實驗原理]糖原中的1，2-乙二醇基經(jīng)高碘酸氧化后產生醛基，此醛基進而與雪夫(Schiff)液作用，使無色品紅變?yōu)榧t色的化合物，定位于胞漿中。[實驗器材和試劑]1．10g／L高碘酸液2．雪夫(Schiff)染液3．亞硫酸液4．20g／L甲綠5．染色架、洗耳球、接水盤及吸水紙。6．光學顯微鏡、香柏油、乙醚和擦鏡紙。現(xiàn)在是3頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是4頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是5頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是6頁\一共有30頁\編輯于星期三[實驗步驟]

1．新鮮血片或骨髓片用95％乙醇固定10min，蒸餾水沖洗，待干。2．10g／L高碘酸氧化15～20min，蒸餾水沖洗，待干。3．置雪夫試液室溫染色30～60min。4．用亞硫酸溶液沖洗3次后，以自來水沖洗2～3min，待干。5．20g／L甲綠復染10～20min。6．水洗，待干，鏡檢。7．結果(1)陽性反應：在細胞漿內染紅色，呈彌漫狀、顆粒或塊狀。胞核染成綠色。陰性反應，胞漿無色。(2)反應強度判斷標準：①中性粒細胞的分級標準：(－)胞漿無紅色顆粒。(+)胞漿內呈淡紅色有極少顆粒。(++)胞漿呈紅色，厚而不透明，或有較少顆粒。(+++)胞漿呈深紅色，顆粒緊密，但尚有空隙。(++++)胞漿呈深紫紅色，顆粒緊密，無空隙。

現(xiàn)在是7頁\一共有30頁\編輯于星期三②淋巴細胞分級標準：(－)胞漿內無顆粒。(+)胞漿內呈彌散淡紅或有少數(shù)細顆粒(<9個)。(++)胞漿內呈彌散較深的紅色或有多數(shù)細顆粒(>10個)。(+++)胞漿內有較粗顆?；蛏贁?shù)小塊狀。(++++)胞漿內呈多數(shù)粗顆粒并有大塊紅色物質。

③幼紅細胞的分級標準：(－)胞漿內無顆粒。(+)胞漿內有少數(shù)分散細小顆粒或淺紅色彌漫物質。(++)胞漿內有1～10個中等顆粒或彌漫的紅色。(+++)胞漿內有11～20個較粗顆?；虺噬罴t色。(++++)胞漿顆粒較多，20個以上，并且粗，致密且呈紫紅色?，F(xiàn)在是8頁\一共有30頁\編輯于星期三

④巨核細胞的分級標準：(－)細胞內沒有糖原，但細胞漿內有彌散性著色，此系其它多糖類物質。(+)含少量糖原，即含數(shù)小塊或一大塊糖原，糖原常定位于近核膜處。(++)胞漿內含有中等糖原，即含許多小塊或少數(shù)大塊糖原，約占胞質的1/3。(+++)胞漿內含有大量糖原，呈大塊狀，其總面積約占胞漿面積的1/2以上。（＋＋＋＋）胞漿內充滿糖原。(3)陽性率和陽性積分：根據(jù)不同情況的需要，觀察同一類細胞100個，求出陽性率的百分比，將百分率與分級數(shù)的積相加，其總和即為積分?，F(xiàn)在是9頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是10頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是11頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是12頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是13頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是14頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是15頁\一共有30頁\編輯于星期三實驗五過氧化物酶(POX)染色[目的要求]1．

掌握本實驗的原理和臨床意義。2．

熟悉本實驗的操作方法及注意事項。[實驗原理]

細胞內的過氧化物酶能將底物的過氧化氫分解，產生新生態(tài)氧。后者將試劑中的聯(lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍，它是一種不穩(wěn)定的中間產物，再與亞硝基鐵氰化鈉結合進而生成藍黑色化合物沉淀于酶的所在部位?，F(xiàn)在是16頁\一共有30頁\編輯于星期三[實驗器材和試劑]1.0.3％聯(lián)苯胺乙醇溶液聯(lián)苯胺0.3g88％乙醇加至100ml2.360g／L亞硝基鐵氰化鈉飽和液

3.稀過氧化氫液（新鮮配制）3％過氧化氫0.3ml蒸餾水25ml

4.瑞氏染液、PH6.4～6.8磷酸鹽緩沖液。5.光學顯微鏡、香柏油、乙醚和擦鏡紙。6.染色架、洗耳球、接水盤及吸水紙?，F(xiàn)在是17頁\一共有30頁\編輯于星期三[實驗步驟]

1ml，360g／L亞硝基鐵氰化鈉飽和液10μl，混勻。2.于新鮮干燥血涂片或骨髓片上滴加上述混合液0.5ml，使蓋滿整個血膜，作用1～2min。3.滴加等量的稀過氧化氫液，混勻，染4～8min。4.勿傾去染液，直接用水沖洗。5.干燥后再用瑞氏染液復染。6.結果在細胞的胞漿中出現(xiàn)藍色或藍黑色顆粒為陽性反應。

陽性反應強度的判斷：陰性：無顆粒。弱陽性：顆粒小，分布稀疏。陽性：顆粒略粗，分布較密集。強陽性：顆粒粗大?，F(xiàn)在是18頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是19頁\一共有30頁\編輯于星期三實驗六堿性磷酸酶（NAP）染色

[目的要求]1．

掌握本實驗的原理和臨床意義。2．

熟悉本實驗的操作方法及注意事項。[實驗原理]中性粒細胞胞質內的堿性磷酸酶在PH9.6的堿性條件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀定位于胞漿中的酶活性處。現(xiàn)在是20頁\一共有30頁\編輯于星期三[實驗步驟]

1．取新鮮血片自然干燥后放入95％乙醇液固定10min，用流水沖洗，待干。2．取基質液，預溫至37℃，將血片置入，繼續(xù)溫育4～6h。3．滴加20g／L硝酸鈷，作用5min，蒸餾水沖洗。4．滴加20g／L硫化銨，作用5min，蒸餾水沖洗。5．用20g／L甲綠水溶液復染2～3min或用10g／L伊紅復染3～5min。6．水洗，待干，鏡檢。7．結果(1)正常人的血細胞堿性磷酸酶除中性成熟粒細胞(桿狀核及分葉核)可見陽性外，其它細胞均呈陰性。(2)判斷標準及分級：(-)0分：胞漿呈淡紅色，無任何棕黑色顆粒。(+)1分：胞漿呈均勻淺色，無顆?；蛴猩倭孔睾谏w粒，但不超過胞漿總面積的1／4。(++)2分：全部胞漿呈均勻棕黑色或出現(xiàn)較粗的黑色顆粒，不超過胞漿1／2。(+++)3分：胞漿中已基本充滿棕黑色顆粒，但密度較低。(++++)4分：全部胞漿充滿粗大棕黑色顆粒而呈深黑色甚至掩蓋其胞核。(3)計算積分值：油鏡下計數(shù)100個中性桿狀核、分葉核粒細胞，分別記錄其分級情況，全部陽性反應細胞之和即陽性率。將得出各種積分的百分率乘以該積分數(shù)，然后相加即為總積分?，F(xiàn)在是21頁\一共有30頁\編輯于星期三實驗七鐵染色

[目的要求]1．掌握本實驗的原理和臨床意義。2．熟悉本實驗的操作方法及注意事項。[實驗原理]

骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細胞外鐵，其中的三價鐵與分子中的蛋白質結合不牢，經(jīng)稀鹽酸處理后而游離，并能在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產生普魯士藍反應。細胞內鐵也可用此法顯示。根據(jù)反應的強弱了解骨髓中鐵的含量。[實驗器材和試劑]1.甲醇2．200g/L亞鐵氰化鉀溶液3．濃鹽酸4.2g/L核固紅-硫酸鋁溶液現(xiàn)在是22頁\一共有30頁\編輯于星期三[實驗步驟]1．選髓粒豐富的骨髓片，用甲醇固定10min。配制酸性亞鐵氰化鉀溶液：200g/L亞鐵氰化鉀溶液5份濃鹽酸1份3．玻片上滴滿酸性亞鐵氰化鉀溶液，染色30min。4．用蒸餾水沖洗后用2g/L核固紅-硫酸鋁溶液復染10～15min。5．流水沖洗、待干、鏡檢。6．結果(1)在紅色背景下鐵粒呈藍綠色。(2)細胞外鐵：用低倍鏡觀察涂片，特別是涂片尾部和髓粒附近，注意翠藍色顆粒的存在，可分五級標準。(-)：無顆粒所見。(+)：有少數(shù)鐵顆?；蚺家婅F小珠。(++)：有較多的鐵顆粒和小珠。(+++)：有很多的鐵顆粒、小珠和少數(shù)小塊狀。(++++)：有極多鐵顆粒、小珠，有很多的小塊，密集成堆?，F(xiàn)在是23頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是24頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是25頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是26頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是27頁\一共有30頁\編輯于星期三現(xiàn)在是28頁\一共有30頁\編輯于星期三(3)細胞內鐵：用油鏡計數(shù)100個中、晚幼紅細胞，記錄胞漿