基因、分子生物學(xué)課件

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生物信息的傳遞（下）

─從mRNA到蛋白質(zhì)

遺傳密碼——三聯(lián)子tRNA核糖體蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機(jī)制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

蛋白質(zhì)的生物合成步驟(1)翻譯的起始核糖體與mRNA結(jié)合并與氨酰-tRNA生成起始復(fù)合物。(2)肽鏈的延伸由于核糖體沿mRNA5’端向3’端移動(dòng)，開始了從N端向C端的多肽合成，這是蛋白質(zhì)合成過程中速度最快的階段。(3)肽鏈的終止及釋放核糖體從mRNA上解離，準(zhǔn)備新一輪合成反應(yīng)。核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所。mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板。轉(zhuǎn)移RNA(transferRNA，tRNA)是模板與氨基酸之間的接合體。在合成的各個(gè)階段有許多蛋白質(zhì)、酶和其他生物大分子參與。參與蛋白質(zhì)合成的各種組分約占細(xì)胞干重的35%。在真核生物中有將近300種生物大分子與蛋白質(zhì)的生物合成有關(guān)。蛋白質(zhì)合成是一個(gè)需能反應(yīng)，要有各種高能化合物的參與。細(xì)胞用來進(jìn)行合成代謝的總能量的90%消耗在蛋白質(zhì)合成過程中。4.1遺傳密碼——三聯(lián)子貯存在DNA上的遺傳信息通過mRNA傳遞為蛋白質(zhì)。mRNA上每3個(gè)核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這3個(gè)核苷酸稱為密碼，也叫三聯(lián)子密碼。翻譯時(shí)從起始密碼子AUG開始，沿著mRNA5’→3’的方向連續(xù)閱讀密碼子，直至終止密碼子為止，生成一條具有特定序列的多肽鏈――蛋白質(zhì)。

從起始密碼子開始，至終止密碼子結(jié)束的核苷酸序列——可譯框架或可讀框。可譯框架圖4-1Crick關(guān)于tRNA分子破譯mRNA遺傳密碼三聯(lián)子的原始構(gòu)想

4.1.1三聯(lián)子密碼及其破譯因?yàn)閙RNA中只有4種核苷酸，而蛋白質(zhì)中有20種氨基酸，以一種核苷酸代表一種氨基酸是不可能的。若以兩種核苷酸作為一個(gè)氨基酸的密碼（二聯(lián)子），它們能代表的氨基酸也只有42=16種。若以3個(gè)核苷酸代表一個(gè)氨基酸，有43=64種密碼子，滿足了編碼20種氨基酸的需要。

若在模板mRNA中插入或刪除一個(gè)堿基，會(huì)改變?cè)撁艽a子以后的全部氨基酸序列。若同時(shí)對(duì)模板進(jìn)行插入和刪除試驗(yàn)，保證后續(xù)密碼子序列不變，翻譯得到的蛋白質(zhì)序列就保持不變（除了發(fā)生突變的那個(gè)密碼子所代表的氨基酸之外）。

如果同時(shí)刪去3個(gè)核苷酸，翻譯產(chǎn)生少了一個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，但序列不發(fā)生變化。圖4-2用核苷酸的插入或刪除實(shí)驗(yàn)證明mRNA模板上每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子

以均聚物、隨機(jī)共聚物和特定序列的共聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成。

Nirenberg把多聚（U）作為模板加入到無細(xì)胞體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，新合成的多肽鏈?zhǔn)嵌嗑郾奖彼?，確定UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以多聚（C）及多聚（A）做模板得到的分別是多聚脯氨酸和多聚賴氨酸。

以多聚UG為模板合成的是多聚Cys和Val，因?yàn)槎嗑郏║G）中含Cys和Val的密碼：5'……UGUGUGUGUGUGUGUGUG……3'

無論讀碼從U開始還是從G開始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）兩種密碼子。Nirenberg及Ochoa等又用各種特定序列如只含A、C的共聚核苷酸作模板，任意排列時(shí)可出現(xiàn)8種三聯(lián)子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，獲得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6種氨基酸組成的多肽。

以多聚（UUC）為模板，可能有3種起讀方式：

5'……UUCUUCUUCUUCUUC……3'

或5'……UCUUCUUCUUCUUCU……3'

或5'……CUUCUUCUUCUUCUU……3'

產(chǎn)生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu），得到多聚苯丙氨酸、多聚絲氨酸或多聚亮氨酸。因此，UUC、UCU、CUU分別是苯丙氨、絲氨酸及亮氨酸的密碼子。

當(dāng)然，也可能只合成2種均聚多肽，如：

5'……GUAGUAGUAGUAGUA……3'或5'……UAGUAGUAGUAGUAG……3'或5'……AGUAGUAGUAGUAGU……3'

由第二種讀碼方式產(chǎn)生的密碼子UAG是終止密碼，不編碼任何氨基酸，因此，只產(chǎn)生2種密碼子GUA（Val）或AGU（Ser），合成多聚纈氨酸或多聚絲氨酸。2.核糖體結(jié)合技術(shù)以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等為模板，在含核糖體、AA-tRNA的適當(dāng)離子強(qiáng)度的反應(yīng)液中保溫后通過硝酸纖維素濾膜。游離的AA-tRNA因相對(duì)分子質(zhì)量小能自由過膜，與模板對(duì)應(yīng)的AA-tRNA能與核糖體結(jié)合，體積超過膜上的微孔而被滯留。

若用20種AA-tRNA做20組同樣的實(shí)驗(yàn)，每組都含20種AA-tRNA和各種三核苷酸，但只有一種氨基酸用14C標(biāo)記，看哪一種AA-tRNA被留在濾膜上，進(jìn)一步分析這一組的模板是哪個(gè)三核苷酸，從模板三核苷酸與氨基酸的關(guān)系可測(cè)知該氨基酸的密碼子。

表4-1三核苷酸密碼子能使特定的

氨基酰-tRNA結(jié)合到核糖體上

*數(shù)字代表特定氨基酰tRNA與帶有模板三核苷酸的核糖體相結(jié)合的效率。密碼子與核糖體相結(jié)合的14C標(biāo)記的氨基酰-tRNAPhe-tRNAPheLys-tRNALysPro-tRNAProUUU4.6*00AAA07.70CCC003.14.1.2遺傳密碼的性質(zhì)1.密碼的連續(xù)性密碼間無間隔，無重疊，起始密碼決定了后續(xù)密碼的位置。4.1.2遺傳密碼的性質(zhì)2.密碼的簡并性

4種核苷酸可組成64個(gè)密碼子，現(xiàn)在已經(jīng)知道其中61個(gè)是編碼氨基酸的密碼子，另外3個(gè)即UAA、UGA和UAG并不代表任何氨基酸，它們是終止密碼子，不能與tRNA的反密碼子配對(duì)，但能被終止因子或釋放因子識(shí)別，終止肽鏈的合成。

除色氨酸（UGG）只有一個(gè)密碼子外，其他氨基酸都有一個(gè)以上的密碼子。9種氨基酸有2個(gè)密碼子，1種氨基酸有3個(gè)密碼子，5種氨基酸有4個(gè)密碼子，3種氨基酸有6個(gè)密碼子（表4-3）。

由一種以上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象稱為簡并（degeneracy），對(duì)應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymouscodon）。

AUG和GUG既是甲硫氨酸及纈氨酸的密碼子又是起始密碼子。3.密碼的普遍性與特殊性以上介紹的密碼子表是具有普遍性的，適用于一切生物。有一些特例，不編碼普遍性狀況應(yīng)該編碼的氨基酸而編碼別的氨基酸，下表列舉了一些特例。4.密碼子與反密碼子的相互作用

tRNA的反密碼子在核糖體內(nèi)是通過堿基的反向配對(duì)與mRNA上的密碼子相互作用的。1966年，Crick提出擺動(dòng)假說（wobblehypothesis），解釋了反密碼子中某些稀有成分（如I）的配對(duì)，以及許多氨基酸有2個(gè)以上密碼子的問題。圖4-4mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子配對(duì)示意圖。a.密碼子與tRNA反密碼子臂上相應(yīng)序列配對(duì)；b.當(dāng)反密碼子第一位是I時(shí)，密碼子第三位可以是A、U或C。

擺動(dòng)性

在密碼子與反密碼子的配對(duì)中，前兩對(duì)嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)原則，第三對(duì)堿基有一定的自由度，可以“擺動(dòng)”，因而使某些tRNA可以識(shí)別1個(gè)以上的密碼子。

一個(gè)tRNA究竟能識(shí)別多少個(gè)密碼子是由反密碼子的第一位堿基的性質(zhì)決定的，反密碼子第一位為A或C時(shí)只能識(shí)別1種密碼子，為G或U時(shí)可以識(shí)別2種密碼子，為I時(shí)可識(shí)別3種密碼子。

多個(gè)密碼子同時(shí)編碼一個(gè)氨基酸，凡是第一、二位堿基不同的密碼子都對(duì)應(yīng)于各自獨(dú)立的tRNA。原核生物中大約有30-45種tRNA，真核細(xì)胞中可能存在50種tRNA。4.2tRNAtRNA不但為每個(gè)三聯(lián)密碼子翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準(zhǔn)確無誤地將所需氨基酸運(yùn)送到核糖體上提供了運(yùn)送載體，所以，它又被稱為第二遺傳密碼。不同tRNA在結(jié)構(gòu)上存在大量的共性，由小片段堿基互補(bǔ)配對(duì)形成三葉草形分子結(jié)構(gòu)，有4條根據(jù)結(jié)構(gòu)或已知功能命名的手臂。

最常見tRNA分子有76個(gè)堿基，相對(duì)分子質(zhì)量約為2.5×104，不同的tRNA分子可有74～95個(gè)核苷酸不等。D臂中存在多至3個(gè)可變核苷酸位點(diǎn)，17：1及20：1、20：2。最常見的D臂缺失這3個(gè)核苷酸，而最小的D臂中第17位核苷酸也缺失了。受體臂（acceptorarm）由鏈兩端序列配對(duì)形成的桿狀結(jié)構(gòu)和3’端未配對(duì)的3～4個(gè)堿基所組成，其3’端的最后3個(gè)堿基序列永遠(yuǎn)是CCA，最后一個(gè)堿基的3’或2’自由羥基（—OH）可以被氨酰化。TψC臂是根據(jù)3個(gè)核苷酸命名的，其中ψ表示擬尿嘧啶（假尿嘧啶）；反密碼子臂是根據(jù)位于套索（環(huán)）中央的三聯(lián)反密碼子命名的；

D臂是根據(jù)它含有二氫尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。tRNA的稀有堿基含量非常豐富，約有70余種。每個(gè)tRNA分子至少含有2個(gè)稀有堿基，最多有19個(gè)，多數(shù)分布在非配對(duì)區(qū)，特別是在反密碼子3'端鄰近部位出現(xiàn)的頻率最高。4.2.1tRNA的L-形三級(jí)結(jié)構(gòu)研究酵母tRNAPhe、tRNAfMet和大腸桿菌tRNAfMet、tRNAArg等的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)都呈L形折疊式（圖4-6）。

在L形三級(jí)結(jié)構(gòu)中，在原來局部雙螺旋的基礎(chǔ)上，通過分子重排又創(chuàng)造了另一對(duì)雙螺旋。受體臂和TψC臂的桿狀區(qū)域構(gòu)成了第一個(gè)雙螺旋，D臂和反密碼子臂的桿狀區(qū)域形成了第二個(gè)雙螺旋。

TψC臂和D臂的套索狀結(jié)構(gòu)位于“L”的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，受體臂頂端的堿基位于“L”的一個(gè)端點(diǎn)，反密碼子臂的套索狀結(jié)構(gòu)生成了“L”的另一個(gè)端點(diǎn)（圖4-7）。tRNA上所運(yùn)載的氨基酸必須靠近位于核糖體大亞基上的多肽合成位點(diǎn)，而tRNA上的反密碼子必須與小亞基上的mRNA相配對(duì)，所以分子中兩個(gè)不同的功能基團(tuán)是最大限度分離的。4.2.2tRNA的功能轉(zhuǎn)錄過程是信息從一種核酸分子（DNA）轉(zhuǎn)移到另一種結(jié)構(gòu)上極為相似的核酸分子（RNA）的過程，信息轉(zhuǎn)移靠的是堿基配對(duì)。

翻譯階段遺傳信息從mRNA分子轉(zhuǎn)移到結(jié)構(gòu)極不相同的蛋白質(zhì)分子，信息是以能被翻譯成單個(gè)氨基酸的三聯(lián)密碼子形式存在的，在這里起作用的是tRNA的解碼機(jī)制。4.2.3tRNA的種類1.起始tRNA和延伸tRNA

能特異性識(shí)別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met），原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet），Met-tRNAfMet必須首先甲?；蒮Met-tRNAfMet才能參與蛋白質(zhì)的生物合成。2.同工tRNA

將攜帶相同氨基酸的不同tRNA稱為同工tRNA。在一個(gè)同工tRNA組內(nèi)，所有tRNA均專一于相同的氨基酰-tRNA合成酶。同工tRNA具備：（1）不同的反密碼子以識(shí)別該氨基酸的各種同義密碼；（2）有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被AA-tRNA合成酶識(shí)別。3.校正tRNA

結(jié)構(gòu)基因中某個(gè)核苷酸的改變可能產(chǎn)生終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變稱為無義突變，而校正tRNA通過改變反密碼子區(qū)校正無義突變（表4-7）。

錯(cuò)義突變是由于結(jié)構(gòu)基因中某個(gè)核苷酸的變化使一種氨基酸的密碼變成另一種氨基酸的密碼。錯(cuò)義突變的校正tRNA通過反密碼子區(qū)的改變把正確的氨基酸加到肽鏈上，合成正常的蛋白質(zhì)。無義突變的校正tRNA會(huì)與釋放因子競爭識(shí)別密碼子；錯(cuò)義突變的校正tRNA則與該密碼的正常tRNA競爭。這些都會(huì)影響校正的效率。無義突變的校正基因tRNA不僅能校正無義突變，也會(huì)抑制該基因3’末端正常的終止密碼子，導(dǎo)致翻譯過程的通讀，合成更長的蛋白質(zhì)，這對(duì)細(xì)胞會(huì)造成傷害。一個(gè)基因錯(cuò)義突變的校正也可能使另一個(gè)基因錯(cuò)誤翻譯。因?yàn)槿绻粋€(gè)校正tRNA在突變位點(diǎn)通過取代一種氨基酸的方式校正了一個(gè)突變，它也可以在另一位點(diǎn)這樣做，從而在正常位點(diǎn)上引入與前述突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基酸，造成錯(cuò)誤。4.2.4AA-tRNA合成酶

AA-tRNA合成酶是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，其反應(yīng)式如下：AA+tRNA+ATP→AA-tRNA+AMP+PPi它實(shí)際上包括兩步反應(yīng)：第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸復(fù)合物。AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi

第二步是氨?；D(zhuǎn)移到tRNA3'末端腺苷殘基的2'或3'-羥基上。E-AA-AMP+tRNA→AA-tRNA+E+AMP異亮氨酸-tRNA合成酶對(duì)異亮氨酸的親和力比對(duì)纈氨酸大225倍，體內(nèi)纈氨酸的濃度比異亮氨酸高5倍，纈氨酸被錯(cuò)誤滲入到異亮氨酸位點(diǎn)上去的機(jī)率應(yīng)是1/40，但實(shí)際誤差率只有約1/10000。研究發(fā)現(xiàn)，被錯(cuò)誤活化的纈氨酸不會(huì)被結(jié)合到tRNAIle上，而是被異亮氨酰-tRNA合成酶本身水解，即活化階段產(chǎn)生的誤差在后一階段被再次校正了。4.3核糖體核糖體是由幾十種蛋白質(zhì)和多種核糖體RNA（ribosomalRNA，rRNA）所組成的亞細(xì)胞顆粒。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)約有20000個(gè)核糖體，而真核細(xì)胞內(nèi)可達(dá)106個(gè)。這些顆粒既可以游離狀態(tài)存在于細(xì)胞內(nèi)，也可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，形成微粒體。

真核生物中，所有正在進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的核糖體都不是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自由漂浮，而是直接或間接與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)有關(guān)聯(lián)或者與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相連的（圖4-8）。細(xì)菌核糖體大都通過與mRNA相互作用，被固定在核基因組上。

圖4-8結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體。左，電鏡下看到的胰腺細(xì)胞粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；右，局部放大后的草圖。表4-10大腸桿菌核糖體基本成分

核糖體小亞基大亞基沉降系數(shù)70S30S50S總體相對(duì)分子質(zhì)量2.52×1069.30×1051.59×106主要rRNA（堿基數(shù)）

16S（1541）23S（2004）主要rRNA（堿基數(shù)）

5S（120）RNA相對(duì)分子質(zhì)量1.66×1065.60×1051.10×106RNA所占比例66%60%70%蛋白質(zhì)數(shù)量

2136蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量8.57×1053.70×1054.87×105蛋白質(zhì)所占比例34%40%30%4.3.1核糖體的結(jié)構(gòu)1.核糖體由大小兩個(gè)亞基組成

核糖體是一個(gè)致密的核糖核蛋白顆粒，可解離為兩個(gè)亞基，每個(gè)亞基都含有一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量較大的rRNA和許多不同的蛋白質(zhì)分子。表4-11幾種不同生物核糖體及rRNA的組成

核糖體來源大亞基小亞基沉降系數(shù)RNA沉降系數(shù)RNA80S脊椎動(dòng)物60S28S40S18S

5S

5.8S

80S無脊椎動(dòng)物、植物60S25S40S16～18S

5S

5.8S

70S原核生物50S23S30S16S55S脊椎動(dòng)物線粒體40S16～17S30S10～13S

大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質(zhì)組成，分別用S1……S21表示，大亞基由36種蛋白質(zhì)組成，分別用L1……L36表示。

真核生物細(xì)胞核糖體蛋白質(zhì)中，大亞基含有49種蛋白質(zhì)，小亞基有33種蛋白質(zhì)，它們的相對(duì)分子質(zhì)量在8×103～4.0×104之間。2.核糖體蛋白圖4-9是在高倍電鏡下得到的原核生物70S核糖體大、小亞基相結(jié)合的模型，核糖體分子中可容納兩個(gè)tRNA和約40bp長的mRNA。

3.核糖體RNA（1）5SrRNA

細(xì)菌5SrRNA含有120或116個(gè)核苷酸。5SrRNA有兩個(gè)高度保守的區(qū)域，其中一個(gè)區(qū)域含有保守序列CGAAC，這是與tRNA分子TψC環(huán)上的GTψCG序列相互作用的部位，是5SrRNA與tRNA相互識(shí)別的序列。另一個(gè)區(qū)域含有保守序列GCGCCGAAUGGUAGU，與23SrRNA中的一段序列互補(bǔ)，這是5SrRNA與50S核糖體大亞基相互作用的位點(diǎn)，在結(jié)構(gòu)上有其重要性。（2）16SrRNA其長度在1475-1544個(gè)核苷酸之間，含有少量修飾堿基。該分子全部壓縮在30S小亞基內(nèi)。16SrRNA的結(jié)構(gòu)十分保守，其中3'端一段ACCUCCUUA的保守序列，與mRNA5’端翻譯起始區(qū)富含嘌呤的序列互補(bǔ)。在16SrRNA靠近3'端處還有一段與23SrRNA互補(bǔ)的序列，在30S與50S亞基的結(jié)合中起作用。（3）23SrRNA23SrRNA包括2904個(gè)核苷酸，在大腸桿菌23SrRNA第1984～2001核苷酸之間，存在一段能與tRNAMet序列互補(bǔ)的片段，表明核糖體大亞基23SrRNA與tRNAMet的結(jié)合有關(guān)。在23SrRNA靠近5'端(143-157位核苷酸之間)有一段12個(gè)核苷酸的序列與5SrRNA上第72-83位核苷酸互補(bǔ)，表明在50S大亞基上這兩種RNA之間可能存在相互作用。核糖體50S大亞基上約有20種蛋白質(zhì)能不同程度地與23SrRNA相結(jié)合。（4）5.8SrRNA是真核生物核糖體大亞基特有的rRNA，具有與原核5SrRNA中保守序列CGAAC相同的序列。（4）18SrRNA

酵母18SrRNA由1789個(gè)核苷酸組成，它的3'端與大腸桿菌16SrRNA有廣泛的同源性。其中酵母18SrRNA、大腸桿菌16SrRNA和人線粒體12SrRNA在3’端有50個(gè)核苷酸序列相同。（5）28SrRNA長度約在3890～4500bp左右。rRNA之間以及rRNA與tRNA及mRNA之間存在有機(jī)的聯(lián)系，這種關(guān)系是建立在序列互補(bǔ)或同源的基礎(chǔ)之上的。4.核糖體有3個(gè)tRNA結(jié)合位點(diǎn)在多肽合成過程中，由不同的tRNA將相應(yīng)的氨基酸帶到蛋白質(zhì)合成部位，并與mRNA進(jìn)行專一性的相互作用，以選擇對(duì)信息專一的AA-tRNA。核糖體還必須能同時(shí)容納另一種攜帶肽鏈的tRNA，即肽基tRNA（peptidyl-tRNA），并使之處于肽鍵易于生成的位置上。

核糖體上至少有3個(gè)tRNA結(jié)合位點(diǎn)：（1）AA-tRNA接受部位（A位）；（2）肽酰-tRNA結(jié)合部位（P位）；（3）延伸過程中多肽鏈轉(zhuǎn)移到氨酰-tRNA上釋放tRNA的位點(diǎn)（E位）。此外，還應(yīng)有負(fù)責(zé)肽鏈延伸的各種延伸因子的結(jié)合位點(diǎn)。

核糖體小亞基負(fù)責(zé)對(duì)模板mRNA進(jìn)行序列特異性識(shí)別，大亞基負(fù)責(zé)攜帶氨基酸及tRNA的功能，肽鍵的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的結(jié)合等，A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶中心等主要在大亞基上。4.3.2核糖體的功能核糖體存在于每個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成。盡管在不同生物體內(nèi)其大小有別，但組織結(jié)構(gòu)基本相同，而且執(zhí)行的功能完全相同。在多合肽成過程中，不同的tRNA將相應(yīng)的氨基酸帶到蛋白質(zhì)合成部位與mRNA進(jìn)行專一性的相互作用，選擇與密碼子對(duì)應(yīng)的AA－tRNA結(jié)合到肽鏈上。核糖體還能同時(shí)容納肽基-tRNA(Peptidyl-tRNA)，這是肽鏈與AA－tRNA結(jié)合上的瞬時(shí)狀態(tài)。核糖體包括多個(gè)活性中心，即mRNA結(jié)合部位、接受AA-tRNA部位(A位)、結(jié)合肽基－tRNA的部位、肽基轉(zhuǎn)移部位(P位)及形成肽鍵的部位(轉(zhuǎn)肽酶中心)。此外，還有負(fù)責(zé)肽鏈延伸的各種延伸因子的結(jié)合位點(diǎn)。核糖體小亞基負(fù)責(zé)對(duì)模板mRNA進(jìn)行序列特異性識(shí)別，如起始部分的識(shí)別、密碼子與反密碼子的相互作用等，mRNA的結(jié)合位點(diǎn)也在小亞基上。大亞基負(fù)責(zé)攜帶AA-tRNA、肽鍵的形成、AA-tRNA與肽鏈的結(jié)合、A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶中心等在大亞基上。核糖體在體內(nèi)及體外都可解離為亞基或結(jié)合成70S/80S的顆粒。在翻譯的起始階段需要游離的亞基，隨后才結(jié)合成70S/80S顆粒，開始翻譯進(jìn)程。肽鏈釋放后，核糖體脫離mRNA解聚成亞基，直接參與另一輪蛋白質(zhì)的合成。體外反應(yīng)體系中，核糖體的解離或結(jié)合取決于離子濃度。在大腸桿菌內(nèi)，Mg2＋濃度在10－3mol/L以下時(shí)，70S解離為亞基，濃度達(dá)10－2mol/L時(shí)則形成穩(wěn)定的70S顆粒。4.4蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機(jī)制雖然因蛋白質(zhì)的合成和結(jié)構(gòu)最終都取決于核酸，但蛋白質(zhì)仍是生物活性物質(zhì)中最重要的大分子組分，生物有機(jī)體的遺傳學(xué)特性要通過蛋白質(zhì)來得到表達(dá)。

（1）核糖體：場所（2）mRNA：模板（3）轉(zhuǎn)移RNA（transferRNA，tRNA）：是模板與氨基酸之間的接合體蛋白質(zhì)合成是一個(gè)需能反應(yīng)。細(xì)胞用來進(jìn)行合成代謝總能量的90%消耗在蛋白質(zhì)合成過程中。真核生物中可能有近300種生物大分子參與蛋白質(zhì)的生物合成，這些組分約占細(xì)胞干重的35%。蛋白質(zhì)的生物合成包括如下步驟：（1）氨基酸活化（2）肽鏈的起始（3）延伸（4）終止（5）新合成多肽鏈的折疊和加工4.4.1氨基酸的活化

aa+ATP+tRNA

氨酰tRNA合成酶

aa-tRNA+AMP+ppi

蛋白質(zhì)合成的起始是指在模板mRNA編碼區(qū)5'端形成核糖體-mRNA-起始tRNA復(fù)合物并將甲酰甲硫氨酸放入核糖體P位點(diǎn)。原核生物中30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大亞基結(jié)合生成70S·mRNA·fMet-tRNAMet起始復(fù)合物

真核生物中，40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結(jié)合，再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大亞基結(jié)合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始復(fù)合物。起始復(fù)合物的生成除了GTP外，還需要Mg2+、NH4+及3個(gè)起始因子（IF-1、IF-2、IF-3）。4.4.2翻譯的起始細(xì)菌翻譯的起始需要如下7種成份：（1）30S小亞基，（2）模板mRNA，（3）fMet-tRNAfMet，（4）三個(gè)翻譯起始因子，IF-1、

IF-2和IF-3，（5）GTP，（6）50S大亞基，（7）Mg2+。第一步，30S小亞基與翻譯起始因子IF-1，IF-3結(jié)合，通過SD序列與mRNA模板相結(jié)合。第二步，fMet-tRNAfMet在IF-2的協(xié)同下進(jìn)入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對(duì)。第三步，帶有tRNA、mRNA、三個(gè)翻譯起始因子的小亞基復(fù)合物與50S大亞基結(jié)合，釋放翻譯起始因子。圖4-12翻譯起始

復(fù)合物的形成。

原核生物蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成30S亞基具有專一性的識(shí)別和選擇mRNA起始位點(diǎn)的性質(zhì)，IF3協(xié)助該亞基完成這種選擇。Shine及Dalgarno等證明幾乎所有原核生物mRNA上都有一個(gè)5’-AGGAGGU-3’序列，這個(gè)富嘌呤區(qū)與30S亞基上16SrRNA3’末端的富嘧啶區(qū)5’-GAUCACCUCCUUA-3’相互補(bǔ)。圖4-14細(xì)菌mRNA分子上往往存在一個(gè)與16SrRNA3’末端相互補(bǔ)的SD序列。

細(xì)菌核糖體上一般存在三個(gè)與氨基酰-tRNA結(jié)合的位點(diǎn)，即A位點(diǎn)（aminoacylsite），P位點(diǎn)（peptidylsite）和E位點(diǎn)（Exitsite）。只有fMet-tRNAfMet能與第一個(gè)P位點(diǎn)相結(jié)合，其它所有tRNA都必須通過A位點(diǎn)到達(dá)P位點(diǎn)，再由E位點(diǎn)離開核糖體。真核生物蛋白質(zhì)生物合成的起始基本與原核生物相同，只不過其核糖體較大，有較多的起始因子，mRNA具有m7GpppNp帽子結(jié)構(gòu)，Met-tRNAMet不甲?；?，mRNA分子5’端的“帽子”和3’端的多聚A都參與形成翻譯起始復(fù)合物（圖4-15）。圖4-15真核生物翻譯起始復(fù)合物的形成。

4.4.3肽鏈的延伸生成起始復(fù)合物，第一個(gè)氨基酸（fMet/Met-tRNA）與核糖體結(jié)合以后，肽鏈開始伸長。按照mRNA模板密碼子的排列，氨基酸通過新生肽鍵的方式（圖4-15）被有序地結(jié)合上去。肽鏈延伸中的每個(gè)循環(huán)都包括AA-tRNA與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和移位三步。圖4-16多肽鏈上肽鍵的形成——縮合反應(yīng)。1．后續(xù)AA-tRNA與核糖體結(jié)合細(xì)菌中肽鏈延伸的第一步反應(yīng)：第二個(gè)氨基酰-tRNA的結(jié)合。該氨基酰-tRNA首先與EF-Tu·GTP形成復(fù)合物，進(jìn)入核糖體的A位，水解產(chǎn)生GDP并在EF-Ts的作用下釋放GDP并使EF-Tu結(jié)合另一分子GTP，進(jìn)入新一輪循環(huán)。細(xì)菌中肽鏈延伸的第二步反應(yīng)：肽鍵的生成。2.肽鍵的生成。

在核糖體·mRNA·AA-tRNA復(fù)合物中，AA-tRNA占據(jù)A位，fMet-tRNAfMet占據(jù)P位。在肽基轉(zhuǎn)移酶（peptidyltransferase）的催化下，A位上的AA-tRNA轉(zhuǎn)移到P位，與fMet-tRNAfMet上的氨基酸生成肽鍵。起始tRNA在完成使命后離開核糖體P位點(diǎn)，A位點(diǎn)準(zhǔn)備接受新的AA-tRNA，開始下一輪合成反應(yīng)。3．移位肽鍵延伸的最后一步是移位，即核糖體向mRNA3’端方向移動(dòng)一個(gè)密碼子。細(xì)菌中肽鏈延伸的第三步反應(yīng)：移位。核糖體通過EF-G介導(dǎo)的GTP水解所提供的能量向mRNA模板3’末端移動(dòng)一個(gè)密碼子，使二肽基-tRNA完全進(jìn)入P位,準(zhǔn)備開始新一輪肽鏈延伸。4.4.4肽鏈的終止當(dāng)終止密碼子UAA、UAG或UGA出現(xiàn)在核糖體的A位時(shí)，沒有相應(yīng)的AA-tRNA能與之結(jié)合，而釋放因子能識(shí)別這些密碼子并與之結(jié)合，水解P位上多肽鏈與tRNA之間的二酯鍵，釋放新生的肽鏈和tRNA，核糖體大、小亞基解體，蛋白質(zhì)合成結(jié)束。釋放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽鏈與核糖體解離。蛋白質(zhì)肽鏈合成的過程圖示4.4.6蛋白質(zhì)前體的加工1、N端fMet或Met的切除無論原核生物還是真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽鏈合成完畢前就被切除。50%的真核蛋白中，成熟蛋白N端殘基會(huì)被N-乙基化。2、二硫鍵的形成mRNA中沒有胱氨酸密碼子，而不少蛋白質(zhì)都含有二硫鍵。蛋白質(zhì)合成后往往通過兩個(gè)半胱氨酸的氧化作用生成胱氨酸。3、特定氨基酸的修飾氨基酸側(cè)鏈的修飾作用包括磷酸化（如核糖體蛋白質(zhì)）、糖基化（如各種糖蛋白）、甲基化（如組蛋白、肌肉蛋白質(zhì)）、乙基化（如組蛋白）、羥基化（如膠原蛋白）和羧基化等，圖4-21是生物體內(nèi)最普通發(fā)生修飾作用的氨基酸殘基及其修飾產(chǎn)物。圖4-22發(fā)生在小牛組蛋白H3前35個(gè)氨基酸殘基中的4種化學(xué)修飾。

糖蛋白主要是蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸殘基加上糖基形成的，膠原蛋白上的脯氨酸和賴氨酸多數(shù)是羥基化的。實(shí)驗(yàn)證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能是蛋白質(zhì)N-糖基化的主要場所（圖4-23）。圖4-23內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能是蛋白質(zhì)N-糖基化的主要場所4、切除新生肽鏈中非功能片段如新合成的胰島素前體是前胰島素原，必須先切去信號(hào)肽變成胰島素原，再切去C-肽，才變成有活性的胰島素。不少多肽類激素和酶的前體如血纖維蛋白原、胰蛋白酶原都要經(jīng)過加工才能變?yōu)榛钚苑肿?。圖4-23前胰島素原蛋白翻譯后成熟過程示意圖。圖4-23前胰島素原蛋白翻譯后成熟過程示意圖。圖4-25蜂毒蛋白只有經(jīng)蛋白酶水解切除N-端的22個(gè)氨基酸以后才有生物活性。該胞外蛋白酶只能特異性切割X-Y2肽，其中X是丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸，Y是丙氨酸或脯氨酸。4.4.7蛋白質(zhì)合成抑制劑蛋白質(zhì)生物合成的抑制劑主要是一些抗生素，如嘌呤霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素等。此外，5-甲基色氨酸、環(huán)已亞胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖體滅活蛋白都能抑制蛋白質(zhì)的合成。鏈霉素是一種堿性三糖，能干擾fMet-tRNA與核糖體的結(jié)合，從而阻止蛋白質(zhì)合成的正確起始，也會(huì)導(dǎo)致mRNA的錯(cuò)讀。若以多聚（U）作模板，則除苯丙氨酸（UUU）外，異亮氨酸（AUU）也會(huì)被摻入。鏈霉素的作用位點(diǎn)在30S亞基上。圖4-26幾種常見蛋白質(zhì)合成抑制劑的結(jié)構(gòu)式。

嘌呤霉素是AA-tRNA的結(jié)構(gòu)類似物，能結(jié)合在核糖體的A位上，抑制AA-tRNA的進(jìn)入。它所帶的氨基也能與生長中的肽鏈上的羧基反應(yīng)生成肽鍵，反應(yīng)的產(chǎn)物是一條C端羧基端掛了一個(gè)嘌呤霉素殘基的小肽。圖4-27嘌呤霉素抑制蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)制。a.嘌呤霉素的結(jié)構(gòu)類似于帶有氨基酰的tRNA，能與核糖體A位點(diǎn)相結(jié)合；b.肽基嘌呤霉素。

青霉素、四環(huán)素和紅霉素只與原核細(xì)胞核糖體發(fā)生作用，從而阻遏原核生物蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌生長。

氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細(xì)胞核糖體結(jié)合，又能與真核生物核糖體結(jié)合，妨礙細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，影響細(xì)胞生長。4.5蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制由于細(xì)胞各部分都有特定的蛋白質(zhì)組分，因此合成的蛋白質(zhì)必須準(zhǔn)確無誤地定向運(yùn)送才能保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。

若某個(gè)蛋白質(zhì)的合成和運(yùn)轉(zhuǎn)是同時(shí)發(fā)生的，則屬于翻譯運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制；若蛋白質(zhì)從核糖體上釋放后才發(fā)生運(yùn)轉(zhuǎn)，則屬于翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制。這兩種運(yùn)轉(zhuǎn)方式都涉及到蛋白質(zhì)分子內(nèi)特定區(qū)域與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系。表4-15幾類主要蛋白質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制

蛋白性質(zhì)

運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制主要類型分泌

蛋白質(zhì)在結(jié)合核糖體上合成，以翻譯運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制運(yùn)輸免疫球蛋白、卵蛋白、水解酶、激素等細(xì)胞器發(fā)育

蛋白質(zhì)在游離核糖體上合成，以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制運(yùn)輸核、葉綠體、線粒體、乙醛酸循環(huán)體、過氧化物酶體等細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)膜的形成兩種機(jī)制兼有質(zhì)膜、內(nèi)織網(wǎng)、類囊體中的蛋白質(zhì)4.5.1翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制

蛋白質(zhì)定位信息存在于自身結(jié)構(gòu)中，并通過與膜上特殊受體的相互作用得以表達(dá)。信號(hào)序列在結(jié)合核糖體上合成后便與膜上特定受體相互作用，產(chǎn)生通道，允許這段多肽在延長的同時(shí)穿過膜結(jié)構(gòu)（圖4-29）。因此，這種方式是邊翻譯邊跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)。圖4-29蛋白質(zhì)通過其N-端的信號(hào)肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中運(yùn)轉(zhuǎn)到不同的細(xì)胞器。

絕大部分被運(yùn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔的蛋白質(zhì)都帶有一個(gè)信號(hào)肽，位于蛋白質(zhì)的氨基末端（13-36個(gè)殘基）：（1）一般帶有10-15個(gè)疏水氨基酸；（2）在靠近該序列N-端常常有1個(gè)或數(shù)個(gè)帶正電荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點(diǎn)處常常帶有數(shù)個(gè)極性氨基酸，離切割位點(diǎn)最近的那個(gè)氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈（丙氨酸或甘氨酸）。

分泌蛋白的生物合成開始于結(jié)合核糖體，翻譯進(jìn)行到50～70個(gè)氨基酸殘基時(shí)，信號(hào)肽從核糖體的大亞基上露出，與粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體相結(jié)合。SRP（信號(hào)識(shí)別蛋白/顆粒）能同時(shí)識(shí)別需要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)的新生肽和自由核糖體，并導(dǎo)致該多肽合成的暫時(shí)終止（此時(shí)新生肽一般長約70個(gè)殘基左右）。SRP-信號(hào)肽-多核糖體復(fù)合物即被引向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜并與SRP的受體——DP（?？康鞍?，又稱SRP受體蛋白）相結(jié)合。只有當(dāng)SRP與DP相結(jié)合時(shí)，多肽合成才恢復(fù)進(jìn)行，信號(hào)肽部分通過膜上的核糖體受體及蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)復(fù)合物跨膜進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔，新生肽鏈重新開始延伸。

SRP與DP的結(jié)合很可能導(dǎo)致受體聚集而形成膜孔道，使信號(hào)肽及與其相連的新生肽得以通過（圖4-30）。

信號(hào)肽過膜后被水解，新生肽隨之通過蛋白孔道穿越疏水的雙層磷脂。一旦核糖體移到mRNA的“終止”密碼子，蛋白質(zhì)合成即告完成，翻譯體系解散，膜上的蛋白孔道消失，核糖體重新處于自由狀態(tài)。圖4-30蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)的信號(hào)肽假說及其運(yùn)輸過程4.5.2翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制1、線粒體蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)特征①通過線粒體膜的蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)之前大多數(shù)以前體形式存在，由成熟蛋白質(zhì)和位于N端的20～80個(gè)殘基的前導(dǎo)肽（leaderpeptide）組成；②蛋白質(zhì)跨線粒體內(nèi)膜運(yùn)轉(zhuǎn)是一種需能過程；③蛋白質(zhì)跨線粒體膜運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，首先由外膜上的Tom受體復(fù)合蛋白識(shí)