植物組織培養(yǎng)實驗室

第一章植物組織培養(yǎng)實驗室及基本設(shè)備現(xiàn)在是1頁\一共有60頁\編輯于星期二第一節(jié)植物組織培養(yǎng)實驗室

植物植物組織培養(yǎng)是以植物組織和細胞的離體無菌操作為基礎(chǔ)的實驗性學(xué)科，它需要在一定的實驗條件和特定的實驗環(huán)境下完成一系列操作，以無菌條件為重要前提，模擬植物細胞生長發(fā)育需要的各種設(shè)備、設(shè)施、培養(yǎng)條件，是從事本領(lǐng)域工作的基礎(chǔ)?，F(xiàn)在是2頁\一共有60頁\編輯于星期二一、實驗室要求

環(huán)境要求：理想的植物組織培養(yǎng)實驗室應(yīng)該建立在安靜、清潔、遠離污染源的地方，最好在常年主風(fēng)向的上風(fēng)方向，盡量減少污染。規(guī)模化生產(chǎn)的實驗室最好建在交通方便的地方，便于產(chǎn)品的運送。

需考慮兩個方面：一、所從事實驗的性質(zhì)二、實驗室規(guī)模現(xiàn)在是3頁\一共有60頁\編輯于星期二實驗室設(shè)置的基本原則：科學(xué)、高效、經(jīng)濟和實用。實驗室必須滿足3個基本需要：實驗準備（培養(yǎng)基制備、器皿洗滌、培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿滅菌）、無菌操作和控制培養(yǎng)。此外，還可根據(jù)所從事的實驗要求來考慮輔助實驗室及其各種附加設(shè)施，使實驗室更加完善?，F(xiàn)在是4頁\一共有60頁\編輯于星期二基本實驗室輔助實驗室實驗室組成準備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細胞生物學(xué)實驗室溫室生化分析實驗室二、實驗室構(gòu)成與配置現(xiàn)在是5頁\一共有60頁\編輯于星期二（一）基本實驗室基本實驗室包括準備室、無菌操作室、培養(yǎng)室、緩沖間，是植物組織培養(yǎng)實驗所必須具備的基本條件。如進行工廠化生產(chǎn)，年產(chǎn)4萬-20萬，需3-4間實驗用房，總面積60平方米?，F(xiàn)在是6頁\一共有60頁\編輯于星期二準備室緩沖間培養(yǎng)室無菌室基本實驗室示意圖滅菌鍋工作臺藥品柜水槽平臺超凈工作臺培養(yǎng)架平臺平臺現(xiàn)在是7頁\一共有60頁\編輯于星期二1、準備室功能：進行一切與實驗有關(guān)的準備工作：器皿洗滌、培養(yǎng)基配制與分裝、培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿的滅菌、培養(yǎng)材料的預(yù)處理等。

要求：20平方米左右。要求寬敞明亮、以便于放置多個實驗臺和相關(guān)設(shè)備，方便多人同時工作；同時要求通風(fēng)條件好，便于氣體交換；實驗室地面應(yīng)便于清潔，并應(yīng)進行防滑處理。設(shè)備：準備室應(yīng)具備工作臺、柜櫥、水池、儀器、藥品等。

現(xiàn)在是8頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是9頁\一共有60頁\編輯于星期二分類：分體式-研究性質(zhì)實驗室，可將準備室分解為藥品貯藏室、培養(yǎng)基配制與洗滌室和滅菌室等，功能明確，便于管理，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。通間式-規(guī)?；瘜嶒炇遥O(shè)計成大的通間，試驗操作的各個環(huán)節(jié)在同一房間內(nèi)按程序完成。便于程序化操作與管理，減少各環(huán)節(jié)間的銜接時間，提高工作效率。還便于培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌的自動化操作程序設(shè)計，減少規(guī)?；a(chǎn)的人工勞動，更便于無菌條件的控制和標準化操作體系的建立?，F(xiàn)在是10頁\一共有60頁\編輯于星期二2、無菌操作室

功能：也叫接種室，進行材料的離體無菌操作，是植物離體培養(yǎng)研究或生產(chǎn)中最關(guān)鍵的一步。

要求：房間一般不宜過大，10-20平方米即可。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時間保持無菌，因此不宜設(shè)在容易受潮的地方；為便于消毒處理，地面及內(nèi)墻壁都應(yīng)采用防水和耐腐蝕材料；地面要求平坦無縫，便于清潔；為了保持清潔，無菌室應(yīng)防止空氣對流。

現(xiàn)在是11頁\一共有60頁\編輯于星期二無菌室現(xiàn)在是12頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是13頁\一共有60頁\編輯于星期二一般新建實驗室的無菌室在使用之前應(yīng)進行滅菌處理，處理方法是甲醛和高錳酸鉀熏蒸，并需定期滅菌處理，還可用紫外線照射1-2h/周，或每次使用前照射10-30min。

設(shè)備：無菌操作室安裝有紫外燈和空調(diào)，工作臺和擱架，還有超凈工作臺和整套滅菌接種儀器、藥品等?，F(xiàn)在是14頁\一共有60頁\編輯于星期二3、培養(yǎng)室

功能：對接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物離體材料進行控制條件下的培養(yǎng)，實驗材料進行培養(yǎng)的場所。

要求：10-20平方米左右。要求能夠控制光照和溫度，并保持相對的無菌環(huán)境。因此，培養(yǎng)室應(yīng)保持清潔和適度干燥；為滿足植物培養(yǎng)材料生長對氣體的需要，還應(yīng)安裝排風(fēng)窗和換氣扇等換氣裝置；為節(jié)省能源和空間，應(yīng)配置適宜的培養(yǎng)架，并應(yīng)安裝日光燈照明。現(xiàn)在是15頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是16頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是17頁\一共有60頁\編輯于星期二研究用實驗室，通?？筛鶕?jù)光照時間設(shè)置成長日照、中日照、短日照培養(yǎng)室，也可以根據(jù)溫度設(shè)置成高溫和低溫培養(yǎng)室，每一個培養(yǎng)室的空間不宜過大，便于對條件的均勻控制。進行精細培養(yǎng)類型如細胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)，可采用光照培養(yǎng)箱或人工氣候箱代替培養(yǎng)室。

設(shè)備：培養(yǎng)架、光照培養(yǎng)箱或人工氣候箱、邊臺用于拍攝培養(yǎng)物生長狀況，除濕機、顯微鏡、溫濕度計、空調(diào)等?，F(xiàn)在是18頁\一共有60頁\編輯于星期二4、緩沖間功能：進入無菌室前的緩沖場地，減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。人員在此換上工作服、拖鞋、口罩，才能進入無菌室和培養(yǎng)室。

要求：3-5平方米，在準備室外或無菌操作室外，應(yīng)保持清潔無菌；備有鞋架和衣帽掛鉤。設(shè)備：1-2盞紫外燈對衣物進行滅菌、滅菌工作服、拖鞋、口罩?，F(xiàn)在是19頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是20頁\一共有60頁\編輯于星期二（二）輔助實驗室根據(jù)研究或生產(chǎn)的需要而配套設(shè)置的專門實驗室，主要用于細胞學(xué)觀察和生理生化分析等。現(xiàn)在是21頁\一共有60頁\編輯于星期二1、細胞學(xué)實驗室

功能：對培養(yǎng)材料進行細胞學(xué)鑒定和研究，分為制片室和顯微觀察室。制片是獲取顯微觀察數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)，制片室配備有切片機、磨刀機、溫箱及樣品處理和切片染色設(shè)備，通風(fēng)櫥和廢液處理設(shè)施。顯微觀察室主要有顯微鏡和圖像拍攝、處理設(shè)備。

要求：明亮、清潔、干燥、防止潮濕和灰塵污染。現(xiàn)在是22頁\一共有60頁\編輯于星期二2、生化分析實驗室

培養(yǎng)細胞產(chǎn)物為主要目的實驗室，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗實驗室，隨時對培養(yǎng)物成分進行取樣檢查。大型次生代謝物生產(chǎn)，還需有效分離實驗室?，F(xiàn)在是23頁\一共有60頁\編輯于星期二第二節(jié)儀器設(shè)備和器皿用具

一、基本設(shè)備配置（一）常規(guī)設(shè)備1、天平植物組織培養(yǎng)實驗室需要不同精度的天平。感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（電子天平）用于稱量微量元素和一些較高精確度的實驗用品。感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量較大的藥品的稱量?，F(xiàn)在是24頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是25頁\一共有60頁\編輯于星期二2、冰箱各種維生素和激素類藥品以及培養(yǎng)基母液均需低溫報存，某些試驗還需植物材料進行低溫處理，普通冰箱即可。3、酸度計用于測定培養(yǎng)基及其它溶液的pH，一般要求可測定pH范圍1-14之間，精度0.01即可?，F(xiàn)在是26頁\一共有60頁\編輯于星期二PHS-802中文臺式酸度計通用型或經(jīng)濟型酸度計全溫型恒溫培養(yǎng)搖床多振幅高速軌道搖床現(xiàn)在是27頁\一共有60頁\編輯于星期二4、離心機用于細胞、原生質(zhì)體等活細胞分離，亦用于培養(yǎng)細胞的細胞器、核酸以及蛋白質(zhì)的分離提取。根據(jù)分離物質(zhì)不同配置不同類型的離心機。細胞、原生質(zhì)體等活細胞的分離用低速離心機；核酸、蛋白質(zhì)分離用高速冷凍離心機；規(guī)?；a(chǎn)次生產(chǎn)物，還需選擇大型離心分離系統(tǒng)。

現(xiàn)在是28頁\一共有60頁\編輯于星期二5、加熱器

用于培養(yǎng)基的配制。研究性實驗室一般選用帶磁力攪拌功能的加熱器，規(guī)?；笮蛯嶒炇矣么蠊β始訜岷碗妱訑嚢柘到y(tǒng)。6、其它純水器、分裝設(shè)備現(xiàn)在是29頁\一共有60頁\編輯于星期二不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）現(xiàn)在是30頁\一共有60頁\編輯于星期二（二）滅菌設(shè)備維持相對的無菌環(huán)境是植物組織培養(yǎng)實驗室的基本要求。1、高壓滅菌鍋用于培養(yǎng)基、玻璃器皿以及其它可高溫滅菌用品的滅菌，根據(jù)規(guī)模大小有手提式、立式、臥式等不同規(guī)格。2、干熱消毒柜用于金屬工具如鑷子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的滅菌。一般選用200℃左右的普通或遠紅外消毒柜。現(xiàn)在是31頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是32頁\一共有60頁\編輯于星期二3、過濾滅菌器用于一些酶制劑、激素以及某些維生素等不能高壓滅菌試劑的滅菌，主要有真空抽濾式和注射器式。4、紫外燈方便經(jīng)濟的控制無菌環(huán)境的裝置，緩沖間、接種室和培養(yǎng)室必備。

現(xiàn)在是33頁\一共有60頁\編輯于星期二（三）無菌操作設(shè)備1、接種箱使用較早的最簡單的無菌裝置，主體為玻璃箱罩、入口有袖罩，內(nèi)裝紫外燈和日光燈，使用時對無菌室要求較高。現(xiàn)在是34頁\一共有60頁\編輯于星期二2、凈化工作臺其操作臺面是半開放區(qū)，具方便、操作舒適優(yōu)點，通過過濾的空氣連續(xù)不斷吹出，大于0.03um直徑的微生物很難在工作臺的操作空間停留，保持了較好的無菌環(huán)境。由于過濾器吸附微生物，使用一段時間后過濾網(wǎng)易堵塞，因此應(yīng)定期更換?，F(xiàn)在是35頁\一共有60頁\編輯于星期二超凈工作臺現(xiàn)在是36頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是37頁\一共有60頁\編輯于星期二（四）培養(yǎng)設(shè)備指根據(jù)需要所選用的不同規(guī)格和控制精度的用于植物細胞、組織和器官培養(yǎng)的設(shè)施和設(shè)備。1、培養(yǎng)架目前植物組織培養(yǎng)實驗室植株繁殖培養(yǎng)的通用設(shè)施。成本低、設(shè)計靈活、充分利用培養(yǎng)空間。一般有4-5層，層間間隔40-50cm，光照強度可根據(jù)培養(yǎng)植物特性來確定，一般每架上配備2-4盞日光燈?，F(xiàn)在是38頁\一共有60頁\編輯于星期二2、培養(yǎng)箱細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等要求精確培養(yǎng)的實驗，可用光照培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱、濕度控制培養(yǎng)箱等培養(yǎng)。3、搖床進行液體培養(yǎng)時，為改善通氣狀況，可用振蕩培養(yǎng)箱或搖床。4、生物反應(yīng)器進行植物細胞生產(chǎn)次生產(chǎn)物的實驗室，還需生物反應(yīng)器?，F(xiàn)在是39頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是40頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是41頁\一共有60頁\編輯于星期二5.烘箱（干燥箱）

80℃測定植物組織干重

80-100℃烘干物品

150-160℃干熱滅菌現(xiàn)在是42頁\一共有60頁\編輯于星期二（五）其他設(shè)備時間程序控制器、溫度控制系統(tǒng)或空調(diào)

實體顯微鏡、倒置式生物顯微鏡及配套的攝影、錄像和圖像處理設(shè)備

電泳儀、萃取和層析設(shè)備

紫外分光光度計、高效液相色譜儀、

氣相色譜儀、酶聯(lián)免疫測定系統(tǒng)?，F(xiàn)在是43頁\一共有60頁\編輯于星期二小型臭氧發(fā)生器現(xiàn)在是44頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是45頁\一共有60頁\編輯于星期二8.細胞培養(yǎng)設(shè)備現(xiàn)在是46頁\一共有60頁\編輯于星期二9.培養(yǎng)架現(xiàn)在是47頁\一共有60頁\編輯于星期二10、細胞學(xué)鑒定設(shè)備光學(xué)研究顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡現(xiàn)在是48頁\一共有60頁\編輯于星期二二、培養(yǎng)容器與用具培養(yǎng)容器指盛有培養(yǎng)基并提供培養(yǎng)物生長空間的無菌置，培養(yǎng)用具指培養(yǎng)物接種封口所用的各種金屬或塑料制品，實驗室必備。現(xiàn)在是49頁\一共有60頁\編輯于星期二（一）培養(yǎng)容器包括各種規(guī)格的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶。一般分為：

玻璃容器—一般用無色并不產(chǎn)生顏色折射的硼硅酸鹽玻璃材質(zhì)。

塑料容器—材質(zhì)輕、不易破碎、制作方便，廣泛使用。一般為聚丙烯、聚碳酸酯材料的培養(yǎng)容器?，F(xiàn)在是50頁\一共有60頁\編輯于星期二培養(yǎng)容器現(xiàn)在是51頁\一共有60頁\編輯于星期二（二）金屬用具1、鑷子植物組織解剖用小的尖頭鑷子，分株轉(zhuǎn)移繁殖轉(zhuǎn)接用槍型鑷子，16-22cm長。2、剪刀不銹鋼醫(yī)用彎頭剪，做取材和切段轉(zhuǎn)移繁殖，14-22cm長。現(xiàn)在是52頁\一共有60頁\編輯于星期二3、解剖刀進行組織切段，多用短柄可換刀片的醫(yī)用不銹鋼解剖刀。4、其他用具接種鏟、接種針在花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)中有用?，F(xiàn)在是53頁\一共有60頁\編輯于星期二無菌操作器械現(xiàn)在是54頁\一共有60頁\編輯于星期二（三）塑料用具各種封口膜、蓋、塑料盤及其它實驗用具。

現(xiàn)在是55頁\一共有60頁\編輯于星期二第三節(jié)基本操作一、洗滌（一）重鉻酸鉀洗滌法飽和重鉻酸鉀洗液的配制方法是：將43g重鉻酸鉀溶與1000ml蒸餾水（20℃可以達到飽和狀態(tài)），制成重鉻酸鉀飽和水溶液。然后緩慢加入濃硫酸，最后使重鉻酸鉀飽和水溶液以濃硫酸比例達到1：1。在配制過程中，只能把濃硫酸緩慢加入進去，決不可把重鉻酸鉀水溶液加入濃硫酸中，因會產(chǎn)生大量熱量而來不及擴散，從而引起濃硫酸濺出?，F(xiàn)在是56頁\一共有60頁\編輯于星期二洗滌方法：一般用具：用水洗凈玻璃器皿，晾干后放入重鉻酸鉀洗滌液中，浸泡1夜，第二天取出，用自來水沖洗，然后用蒸餾水洗兩次。干燥后備用。小的玻璃制品法：吸管：先用自來水沖洗，放在特制的防腐不銹鋼網(wǎng)筒內(nèi)，用重鉻酸鉀浸泡一夜，再將網(wǎng)筒放入虹吸式自動沖洗裝置中，用自來水沖洗數(shù)十次，最后用蒸餾水沖洗，干燥后備用?，F(xiàn)在是57頁\一共有60頁\編輯于星期二（二）洗滌劑洗凈法重鉻酸鉀洗液的最大缺