控制菌檢查法

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控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進行培養(yǎng)基的適應(yīng)性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配置的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。

菌種試驗用菌種的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍枯燥菌種為第0代），并采用適合的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102或CVCC1570]

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）[CMCC(B)26003或CVCC1882]乙型副傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC(B)50094]銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC(B)64941]白色念珠球菌（canidiaalbicans）[CMCC(F)98001]

菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠球菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18～24小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10～100cfu的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24小時內(nèi)使用。

適應(yīng)性檢查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適應(yīng)性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示能力的檢查。

表1控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指示能力檢查控制菌檢查培養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基特性促生長能力抑制能力試驗菌株大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌大腸埃希菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌大腸埃希菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌金黃色葡萄球菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌大腸埃希菌4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養(yǎng)基促生長能力+指示能力曙紅亞甲基藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基大腸菌群乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基曙紅亞甲基藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基沙門菌膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基或沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基曙紅亞甲基藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示能力促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力促生長能力+指示能力促生長能力促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力促生長能力+指示能力指示能力控制菌檢查培養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基銅綠假單胞菌特性促生長能力抑制能力試驗菌株銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌大腸埃希菌白色念珠菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基促生長能力綠膿菌素測定用培養(yǎng)基亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基抑制能力促生長能力+指示能力促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力抑制能力促生長能力促生長能力促生長能力促生長能力+指示能力促生長能力+指示能力抑制能力促生長能力+指示能力金黃色葡萄球菌卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌念珠菌顯色培養(yǎng)基1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基促生長能力檢查分別接種不大于100cfu的試驗菌（表1）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好。

固體培養(yǎng)基促生長能力檢查取試驗菌各0.1ml（含菌數(shù)50～100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。

培養(yǎng)基抑制能力檢查接種不少于100cfu的試驗菌（表1）于被檢培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度計最長時間下培養(yǎng)，試驗菌應(yīng)不得生長。

固體培養(yǎng)基指示能力檢查取試驗菌各0.1ml（含菌數(shù)50～100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)狀況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。液體培養(yǎng)基指示能力檢查分別接種不大于100cfu的試驗菌（表1）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌生長狀況、指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。

控制菌檢查方法的驗證

當建立獸藥的微生物限度檢查法時，應(yīng)進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該獸藥的控制菌檢查。若獸藥的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢查方法應(yīng)重新驗證。

驗證時，依各品種項下微生物限度標準中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查

法時，采用大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及以下要求進行。

菌種及菌液制備同控制菌檢查用培養(yǎng)基的適應(yīng)性檢查。

驗證方法取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗菌參與增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，驗證菌應(yīng)加在最終一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。

結(jié)果判斷若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。驗證試驗也可以與供試品的控制菌檢查同時進行。

供試品檢查供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗證的方法進行。

陽性對照試驗進行供試品控制菌檢查時，應(yīng)做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10～100cfu，方法同供試品的控制菌檢查。陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。

陰性對照試驗取稀釋液10ml照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長。

（1）大腸埃希菌（Escherichiacoli）取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml或10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時，必要時可延長至48小時。

取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，于5小時、24小時在366nm紫外燈下觀測，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)基浮現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不浮現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀測后，沿培養(yǎng)管的管壁參與數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。

如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時。

表2大腸埃希菌菌落形態(tài)特征

培養(yǎng)基菌落形態(tài)紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或曙紅亞甲藍瓊脂無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，潮濕，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，潮濕（2）大腸菌群（Coliform）取含適量（不少于10ml）的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別參與1：10的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1ml）、1：100的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1:1000的供試液1ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管參與稀釋液1ml作為陰性對照管。培養(yǎng)18～24小時。

乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時。

若平板上無菌生長，或生長的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符或為非革蘭陰性無芽孢桿菌，

判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應(yīng)進行確證試驗。

表3大腸菌群菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基曙紅亞甲藍瓊脂麥康凱瓊脂菌落形態(tài)紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，潮濕鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，潮濕

確證試驗從上述分開平板上挑揀4～5各疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24～48小時。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判斷該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢查大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。

根據(jù)大腸菌群檢出的管數(shù)，按表4報告1g或1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。

表4可能的大腸菌群數(shù)表

各供試品量的檢出結(jié)果可能的大腸菌群數(shù)Ｎ（個／ｇ或個／ｍｌ）0.1g或0.1ml＋＋＋－0.01g或0.01ml＋＋－－0.001g或0.001ml＋－－－＞１０１０＜Ｎ＜１０１０＜Ｎ＜１０＜１０２２３３注：＋代表檢出大腸菌群；－代表未檢出大腸菌群。

（3）沙門菌（Salmonella）取供試品１０ｇ或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適合的方法混勻，培養(yǎng)18～24小時。

取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時（必要時延長至40～48小時）。若平板上無菌生長或生長的菌落或不同于表5所列的特征，判斷供試品未檢出沙門菌。

若平板上生長的菌落與表5所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑揀2～3各菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面培養(yǎng)和高層穿刺培養(yǎng)接種，培養(yǎng)18～24小時，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進行適合的鑒定試驗，確認是否為沙門菌。

表5沙門菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基膽鹽硫乳瓊脂沙門、志賀菌屬瓊脂曙紅亞甲藍瓊脂麥康凱瓊脂菌落形態(tài)無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色無色至淺橙色，透明或半透明，光滑潮濕的圓形菌落無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗色（4）銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml或10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時。取上述培養(yǎng)物，

劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時。

銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表面潮濕，灰白色，周邊時有藍綠色素擴散。如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑揀2～3個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24小時。取斜面培養(yǎng)物進行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗。

氧化酶試驗取清白濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對苯胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。

若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進行綠膿菌素試驗。

綠膿菌素（Pyocyanin）試驗取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時，加三氯甲烷3～5ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，參與1mol/L鹽酸溶液約1ml，振搖后，靜置片刻，觀測。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的PDP培養(yǎng)基斜面同法做陰性對照，陰性對照試驗應(yīng)呈陰性。

若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應(yīng)繼續(xù)進行適合的鑒定試驗，確認是否為銅綠假單胞菌。

（5）金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml或10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時。必要時可延長至48小時。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉培瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24～72小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表6所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

表6金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基甘露醇氯化鈉培瓊脂卵黃氯化鈉瓊脂菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑0.7～1mm金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1～2mm若平板上生長的菌落與表7所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑揀2～3個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24小時。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進行革蘭氏染色．并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時，做血漿凝固酶試驗。

血漿凝固酶試驗取滅菌小試管3支，各參與血漿和無菌水混合液（1:1)0.5ml，再分別參與可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、營養(yǎng)肉湯或0.9％無菌氯化鈉溶液0.5ml,即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3管同時培養(yǎng)，3小時后開始觀測直至24小時。陰性對照管的血漿應(yīng)滾動自如，陽性對照管血漿應(yīng)凝固，若試驗管血漿凝固為血漿凝固酶試驗陽性，否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規(guī)定時，應(yīng)另制備血漿，重新試驗。若上述疑似菌為非革蘭氏陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

(6)梭菌（Clostridium）取供試液10ml（相當于供試品1g、lml、10cm2)2份，其中l(wèi)份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的梭菌增菌培養(yǎng)基中。置厭氧條件下培養(yǎng)48小時。取上述每一培養(yǎng)物0.2ml，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng)48～72小時。若平板上無菌落生長，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長，應(yīng)挑揀2～3個菌落分別進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。

過氧化氫酶試驗取七述平板上的菌落，置清白玻片上，滴加3％過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。

若上述可疑菌落為革蘭氏陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽孢，過氧化氫酶試驗陰性，判供試

品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。

（7）白色念珠菌（Candidaalbicans）取供試液10ml（相當于供試品1g、lml、l0cm2）直接或處理后接種至適量（不少于10Oml）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48～72小時。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時（必要時延長至72小時）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺褶。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑揀2～3個菌落分別接