基因工程制藥11111

基因工程制藥11111第1頁/共34頁一、原核表達系統(tǒng)

二、酵母表達系統(tǒng)三、昆蟲細胞表達系統(tǒng)四、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)五、轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng)六、轉(zhuǎn)基因動物表達系統(tǒng)七、表達系統(tǒng)的選擇2023/4/8第2頁/共34頁重組蛋白表達系統(tǒng)有：原核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)、哺乳動物表達系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因動物表達系統(tǒng)等。2023/4/8重組蛋白表達系統(tǒng)第3頁/共34頁蛋白表達系統(tǒng)是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。通過這個體系可以實現(xiàn)外源基因在宿主中表達的目的。一般由以下幾個部分組成：

1、宿主。表達蛋白的生物體?？梢詾榧毦?、酵母、植物細胞、動物細胞等。由于各種生物的特性不同，適合表達蛋白的種類也不相同。2023/4/8蛋白表達系統(tǒng)概述第4頁/共34頁2、載體。載體的種類與宿主相匹配。根據(jù)宿主不同，分為原核（細菌）表達載體、酵母表達載體、植物表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲表達載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導，外源基因可以在宿主中表達。3、輔助成分。有的表達系統(tǒng)中還包括了協(xié)助載體進入宿主的輔助成分。比如昆蟲-桿狀病毒表達體系中的桿狀病毒。2023/4/8第5頁/共34頁蛋白表達系統(tǒng)分類及優(yōu)劣分析：原核蛋白表達系統(tǒng)既是最常用的表達系統(tǒng)，也是最經(jīng)濟實惠的蛋白表達系統(tǒng)。原核蛋白表達系統(tǒng)以大腸桿菌表達系統(tǒng)為代表，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產(chǎn)物分離純化相對簡單等優(yōu)點，缺點主要是蛋白質(zhì)翻譯后缺乏加工機制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，得到具有生物活性的蛋白的幾率較小。2023/4/8第6頁/共34頁

酵母蛋白表達系統(tǒng)以甲醇畢赤酵母為代表，具有表達量高，可誘導，糖基化機制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，易實現(xiàn)高密發(fā)酵等優(yōu)點。缺點為部分蛋白產(chǎn)物易降解，表達量不可控。2023/4/8第7頁/共34頁哺乳動物細胞和昆蟲細胞表達系統(tǒng)主要優(yōu)點是蛋白翻譯后加工機制最接近體內(nèi)的天然形式，最容易保留生物活性，缺點是表達量通常較低，穩(wěn)定細胞系建立技術(shù)難度大，生產(chǎn)成本高。2023/4/8第8頁/共34頁2023/4/8一、原核表達系統(tǒng)第9頁/共34頁在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用進行研究的是大腸桿菌表達系統(tǒng)，也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)，大腸桿菌表達系統(tǒng)以其細胞繁殖快速產(chǎn)量高、IPTG誘導表達相對簡便等優(yōu)點成為生產(chǎn)重組蛋白的最常用的系統(tǒng)。2023/4/8第10頁/共34頁于表達不同的蛋白，需要采用不同的載體。目前已知的大腸桿菌的表達載體可分為非融合型表達載體和融合型表達載體兩種。非融合表達是將外源基因插到表達載體強啟動子和有效核糖體結(jié)合位點序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達產(chǎn)物在序列上與天然的目的蛋白一致。融合表達是將目的蛋白或多肽與另一個蛋白質(zhì)或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內(nèi)表達。融合型表達的載體包括分泌表達載體、帶純化標簽的表達載體、表面呈現(xiàn)表達載體、帶伴侶的表達載體。2023/4/8第11頁/共34頁大腸桿菌表達系統(tǒng)優(yōu)點在于遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、表達產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等。2023/4/8第12頁/共34頁2023/4/8第13頁/共34頁BL21（DE3）：為λDE3溶原菌，其染色體上帶有一拷貝由lacUV5啟動子控制的T7RNA聚合酶基因。命名為pLysS和pLysE的宿主菌帶有編碼T7溶菌酶（為T7RNA聚合酶的天然抑制物）的pET相容性質(zhì)粒。帶有pLysS的細胞產(chǎn)生少量溶菌酶，而pLysE宿主菌產(chǎn)生更大量酶。這些菌株用于在誘導前抑制T7RNA聚合酶的基礎表達，這樣可以穩(wěn)定編碼影響細胞生長和活力的目標蛋白的pET重組體。2023/4/8原核表達宿主菌的選擇第14頁/共34頁Rosetta（DE3）：Rosetta宿主菌從BL21衍生而來，可增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達。該菌株通過一個相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補充密碼子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。這樣Rosetta菌株提供了“萬能”的翻譯，從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導致的表達限制。2023/4/8第15頁/共34頁酵母表達系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點，正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用，應用此系統(tǒng)可高水平表達蛋白，且具有翻譯后修飾功能，故被認可為一種表達大規(guī)模蛋白的強有力的工具。2023/4/8二、酵母表達系統(tǒng)第16頁/共34頁一，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達系統(tǒng)：釀酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在釀酒業(yè)和面包業(yè)的使用已有數(shù)千年的歷史，被認為是GRAS(generallyrecognizedassafe)生物，不產(chǎn)生毒素，已被美國FDA確認為安全性生物，但釀酒酵母難于高密度培養(yǎng)，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30kD的外源蛋白質(zhì)，也不能使所表達的外源蛋白質(zhì)正確糖基化，而且表達蛋白質(zhì)的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質(zhì)表達的宿主菌2023/4/8常用的酵母表達系統(tǒng)：第17頁/共34頁二，甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)：甲醇酵母表達系統(tǒng)是目前應用最廣泛的酵母表達系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬(Pichia)應用最多。甲醇酵母的表達載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在該基因的啟動子(PAOX1)作用下，外源基因得以表達。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。2023/4/8第18頁/共34頁這樣可以大大提高表達產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發(fā)生超糖基化。酵母表達的特點酵母是一種單細胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。2023/4/8第19頁/共34頁昆蟲表達系統(tǒng)是一類應用廣泛的真核表達系統(tǒng)，它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強啟動子構(gòu)建的表達載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達。它具有真核表達系統(tǒng)的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白；其最高表達量可達昆蟲細胞蛋白總量的50%；2023/4/8三、昆蟲表達系統(tǒng)第20頁/共34頁可表達非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一個感染昆蟲細胞內(nèi)同時表達多個外源基因的能力；對脊椎動物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的強大啟動子作用下獲得高效表達。。常用的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)和家蠶型多角體病毒(BmNPV)，常用的宿主細胞則來源于草地夜蛾Sf9細胞，用于表達外源基因的質(zhì)粒來源于PUC系列，其含有一個多克隆位點和多角體蛋白啟動子。[2023/4/8第21頁/共34頁1、組蛋白具有完整的生物學功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配

2、蛋白翻譯后的加工修飾；

3、表達水平高，可達總蛋白量的50%；2023/4/8桿狀病毒系統(tǒng)的主要有點包括：第22頁/共34頁4、可容納大分子的插入片段；

5、能同時表達多個基因。主要缺點是外源蛋白表達處于極晚期病毒啟動子的調(diào)控之下，這時由于病毒感染，細胞開始死亡。2023/4/8第23頁/共34頁哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達系統(tǒng)則可快速感染細胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產(chǎn)物中檢測出目的蛋白。哺乳動物細胞表達載體必須包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件。2023/4/8四、哺乳動物表達系統(tǒng)：第24頁/共34頁根據(jù)目的蛋白表達的時空差異，可將表達系統(tǒng)分為瞬時、穩(wěn)定和誘導表達系統(tǒng)。瞬時表達系統(tǒng)是指宿主細胞在導入表達載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達時限短暫；瞬時表達系統(tǒng)的優(yōu)點是簡捷，實驗周期短。穩(wěn)定表達系統(tǒng)是指載體進入宿主細胞并經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定存在于細胞內(nèi)，目的蛋白的表達持久、穩(wěn)定。由于需抗性選擇甚至加壓擴增等步驟，穩(wěn)定表達相對耗時耗力。誘導表達系統(tǒng)是指目的基因的轉(zhuǎn)錄受外源小分子誘導后才得以開放。采用異源啟動子、增強子和可擴增的遺傳標記，可提高蛋白產(chǎn)量。2023/4/8第25頁/共34頁哺乳動物表達系統(tǒng)在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有獨特優(yōu)勢，適合表達完整的大分子蛋白。由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠勝于原核表達系統(tǒng)及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)，但構(gòu)成復雜、操作技術(shù)要求高、表達產(chǎn)量不大、產(chǎn)率低，且有時會導致病毒感染等是該表達系統(tǒng)的不足之處。2023/4/8第26頁/共34頁植物能夠表達來自動物、細菌、病毒以及植物本身的蛋白質(zhì)易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)，且在基因表達與修飾及安全性方面有特別的優(yōu)勢，因此利用植物生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的研究展現(xiàn)了極其誘人的前景。多種抗體、酶、激紊、血漿蛋白和疫苗等都已通過基因工程的手段在植物的葉、莖、根、果實、種子以及植物細胞和器官中得到表達，然而提取與純化始終是大規(guī)模利用植物生產(chǎn)重組蛋白的主要障礙。2023/4/8五、植物表達系統(tǒng)：第27頁/共34頁Doloressa等據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肚在蛋白質(zhì)合成中的作用，把3種重組蛋白，即嗜熱細菌來源的木聚糖酶、水母的綠色熒光蛋白和人胎盤分泌的堿性磷酸酶(SEAP)定位到質(zhì)外體中，通過根分泌和葉分泌途徑獲得表達，從而建立了兩種新的重組蛋白表達系統(tǒng)——植物根分泌和葉分泌，簡化了分離和純化程序，為利用轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白提供了潛在的途徑。雖然利用植物表達、生產(chǎn)外源性蛋白起步較晚，但目前已經(jīng)能夠利用植物生產(chǎn)多種醫(yī)用、食用以及工業(yè)用蛋白及酶制劑。2023/4/8第28頁/共34頁總之，各種表達系統(tǒng)各有優(yōu)缺點，使用大腸桿菌表達系統(tǒng)能夠在較短時間內(nèi)獲得表達產(chǎn)物，且所需的成本相對較低；但目的蛋白常以包涵體形式表達，產(chǎn)物純化困難，且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產(chǎn)物的生物活性較低。酵母和昆蟲細胞表達系統(tǒng)蛋白表達水平高，成本低，但翻譯后加工修飾體系與哺乳動物不完全相同。2023/4/8第29頁/共34頁哺乳動物表達系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然狀態(tài)，但表達量低，操作繁瑣。因此，選擇表達系統(tǒng)時，應充分考慮各種因素，如要表達蛋白的性質(zhì)、生產(chǎn)成本、表達水平、安全性、表達周期等。隨著對外源基因表達系統(tǒng)研究的不斷深入，隨著更多表達機理和影響因素的發(fā)現(xiàn)，相信在不久的將來，原核與真核兩種表達系統(tǒng)在重組蛋白的生產(chǎn)研究中仍然都會占有一席之地，并將出現(xiàn)更多更加完善的表達系統(tǒng)。2023/4/8第30頁/共34頁2023/4/8各種表達系統(tǒng)的比較：表達系統(tǒng)優(yōu)劣產(chǎn)量適用大腸桿菌具有良好的可操作性，成本低，但不能進行糖基化修飾，胞內(nèi)易形成包涵體。外源蛋白10%—70%胞內(nèi)表達，0.3%—4%胞外表達抗體片段以及表達產(chǎn)物翻譯后的有無不會影響其活性的蛋白類藥物。酵母兼具原核細胞良好的可操作性和真核系統(tǒng)的后加工能力。外源蛋白占菌體總蛋白的10%—30%。對蛋白結(jié)構(gòu)有一定的要求，如牛凝乳酶、人血清蛋白。昆蟲細胞具有高等真核生物表達系統(tǒng)的優(yōu)點，產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)相似。外源蛋白最多可占菌體總蛋白的50%。適用于大部分蛋白。第31頁/共34頁各種表達系統(tǒng)的比較（續(xù)）：哺乳動物細胞產(chǎn)物的活性和功能與天然蛋白質(zhì)最接近，糖基化等后加工最準確，但表達水平較低，成本較高。很少對蛋白結(jié)構(gòu)要求較高，分子較大，結(jié)構(gòu)復雜的蛋白。轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)