細胞工程5單克隆抗體

一、何謂單克隆抗體？現(xiàn)在是1頁\一共有33頁\編輯于星期三現(xiàn)在是2頁\一共有33頁\編輯于星期三現(xiàn)在是3頁\一共有33頁\編輯于星期三現(xiàn)在是4頁\一共有33頁\編輯于星期三只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。現(xiàn)在是5頁\一共有33頁\編輯于星期三單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridomacell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology

）。現(xiàn)在是6頁\一共有33頁\編輯于星期三NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

現(xiàn)在是7頁\一共有33頁\編輯于星期三

1975年，英國劍橋大學學者Kohler和Milstein將小鼠骨髓瘤細胞與經(jīng)綿羊紅細胞免疫后的小鼠脾細胞進行融合，形成既能產(chǎn)生抗綿羊紅細胞抗體、又能進行分裂繁殖的雜交瘤細胞，創(chuàng)立了雜交瘤抗體技術(shù)，獲1984年Nobel獎。1984年通過基因工程技術(shù)，初次建立了人-鼠雜交瘤。1987年單抗制劑開始用于臨床試驗。單抗技術(shù)，解決了抗體不純的問題，標志著抗體制備從機體水平進入了細胞水平。由此而建立的單鏈抗體庫技術(shù)和噬菌體抗體庫技術(shù)等，則使抗體制備技術(shù)邁進分子水平。一、原理與概念現(xiàn)在是8頁\一共有33頁\編輯于星期三雜交瘤技術(shù)基本原理哺乳動物的免疫系統(tǒng)包括體液免疫和細胞免疫，參與這兩種免疫反應(yīng)的細胞有：B淋巴細胞和T淋巴細胞。B淋巴細胞，進一步發(fā)育成漿細胞，漿細胞能產(chǎn)生抗體，抗體參與體液免疫。T淋巴細胞，進一步發(fā)育成吞噬細胞，直接參與細胞免疫。T細胞不能產(chǎn)生抗體，但可以幫助B細胞產(chǎn)生抗體。正常的B淋巴細胞不能在體外培養(yǎng)條件下長期生存，因而不能在體外持續(xù)產(chǎn)生抗體。而骨髓瘤細胞可以在體外快速生長，但不能分泌抗體?，F(xiàn)在是9頁\一共有33頁\編輯于星期三克隆選擇學說作為抗體生成理論的克隆選擇學說是雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的理論依據(jù)，細胞融合技術(shù)和雜交細胞的選擇方法是雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的技術(shù)基礎(chǔ)?？寺∵x擇學說1957年Burnet提出的克隆選擇學說認為：每一個B淋巴細胞有一個獨特的受體(現(xiàn)在認為一個B淋巴細胞有結(jié)構(gòu)相同的10萬個受體)，抗原進入機體后只刺激具有相應(yīng)受體的B淋巴細胞，產(chǎn)生與受體特異性相同的抗體分子。一個淋巴細胞只產(chǎn)生一種抗體分子。因此，根據(jù)克隆選擇學說，一個B淋巴細胞克隆只能產(chǎn)生一種抗體分子。這就是生產(chǎn)單克隆抗體的理論依據(jù)?，F(xiàn)在是10頁\一共有33頁\編輯于星期三單克隆抗體與多克隆抗體單克隆抗體與多克隆抗體的本質(zhì)區(qū)別單克隆抗體是源于一個B淋巴細胞的雜交瘤細胞系所分泌的針對抗原的同一表位的抗體；而多克隆抗體(簡稱多抗)是由免疫動物的無數(shù)不同的B淋巴細胞分泌的針對抗原不同表位的性質(zhì)各異的混合抗體。單抗是同質(zhì)的，多抗是異質(zhì)的?，F(xiàn)在是11頁\一共有33頁\編輯于星期三二、雜交瘤技術(shù)的基本原理現(xiàn)在是12頁\一共有33頁\編輯于星期三三、雜交瘤細胞的制備（一）骨髓瘤細胞選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）現(xiàn)在是13頁\一共有33頁\編輯于星期三HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）現(xiàn)在是14頁\一共有33頁\編輯于星期三（二）免疫小鼠免疫程序是：取6~8周齡Balb／C雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強免疫一次，3~5天后用于融合。免疫時是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強弱有關(guān)，以IgG為例，第一次為l00g，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06一1×107?，F(xiàn)在是15頁\一共有33頁\編輯于星期三（三）脾細胞的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5mL無血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90~100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3mL無血清培養(yǎng)液，反復抽吸數(shù)次獲取細胞，再制成細胞懸液亦可；(5)把細胞懸液注入50mL離心管中，加l0~20mL培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘；(6)離心(800~1000轉(zhuǎn)／分)計數(shù)、備用。現(xiàn)在是16頁\一共有33頁\編輯于星期三（四）細胞準備（1）收集骨髓瘤細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次（37℃），計數(shù)活力細胞（不少于90％）；（2）收集小鼠脾細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次（37℃），并計細胞數(shù)和測定活力細胞；（3）按1：5或1：10混合脾細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。現(xiàn)在是17頁\一共有33頁\編輯于星期三（五）細胞融合(1)將1mL40％的PEG液一滴滴加入列細胞團中，在60秒內(nèi)加完，同時并不斷輕微轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1mL無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢加完20mL無血清培養(yǎng)液；此時細胞對機械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)／分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10mL懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50L；(6)取等體積細胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5％CO2，溫箱中37℃培養(yǎng)，24小時后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖?，F(xiàn)在是18頁\一共有33頁\編輯于星期三（六）融合后細胞培養(yǎng)1、融合后7~10天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的)后每隔2~3天半量換液一次；2、兩周后可改用HAT培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；3、2~3周后出現(xiàn)雜交細胞集落，細胞個大、圓且透明；4、待集落增殖生長至1／3孔時，應(yīng)進行抗體檢測。現(xiàn)在是19頁\一共有33頁\編輯于星期三

雜交瘤技術(shù)的關(guān)鍵是如何篩選雜交瘤細胞，

使用HAT選擇性培養(yǎng)基解決了此技術(shù)問題。

HAT：H(hypoxanthin)次黃嘌呤

A(aminopterin)氨基喋呤（正常細胞DNA合成的阻斷劑）

T(thymidine)胸腺嘧啶（供旁路途徑利用）

現(xiàn)在是20頁\一共有33頁\編輯于星期三細胞融合、篩選和雜交瘤技術(shù)的建立

腫瘤細胞DNA生物合成有兩條途徑：一條由糖、氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，這是主要途徑。這條途徑可被葉酸的拮抗物—氨基喋呤(A)所阻斷。但如果培養(yǎng)基中含核苷酸“前體“次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，即便有A存在，細胞通過另一途徑(稱替代途徑或應(yīng)急途徑)也可合成核苷酸。正常細胞嘌呤和嘧啶的生物合成途徑可被氨基喋呤阻斷。但細胞在提供了胸腺嘧啶和次黃嘌呤的情況下，依賴胸腺激酶(TK)和次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)可合成DNA?，F(xiàn)在是21頁\一共有33頁\編輯于星期三（七）抗體檢測免疫熒光試驗放射免疫試驗(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)現(xiàn)在是22頁\一共有33頁\編輯于星期三雜交瘤細胞的篩選

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)該法在雜交瘤細胞的篩檢和單抗的鑒定中最為常用。羊抗鼠或兔抗鼠雙抗體夾心ELISA能識別所有鼠源抗體。凡是分泌鼠源抗體的雜交瘤細胞均可被篩選出來，然后再通過間接ELISA或捕獲ELISA或其它特異性檢測方法確定目的雜交瘤細胞。間接ELISA和捕獲ELISA能識別與抗原相對應(yīng)的特異性抗體。一般用于分泌特異性抗體的雜交瘤細胞的篩選和單抗特異性鑒定。其中捕獲ELISA，由于首先用多抗致敏酶標反應(yīng)板，增強板對抗原的結(jié)合能力，因此一般來說它比間接ELISA更穩(wěn)定和敏感。液相ELISA由于抗原和抗體在液相中反應(yīng)，抗原保持自然構(gòu)型，所有表位處于完好狀態(tài)，并可與抗體進行全方位反應(yīng)，其結(jié)果與中和反應(yīng)較為一致，適于中和單抗的篩選和病毒抗原表位分析?，F(xiàn)在是23頁\一共有33頁\編輯于星期三(2)免疫酶組化法主要用于檢測針對細胞抗原成分的單抗或細胞上病毒抗原成分的單抗。常用間接免疫過氧化物酶試驗(IIP)或堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標技術(shù)(APAAP)，鏡檢判定結(jié)果。

(3)免疫熒光技術(shù)與免疫組化法相似，主要用于各種細胞抗原成分和感染細胞中病毒抗原成分的檢測，具有操作簡便、敏感，可對抗原成分直觀定位等優(yōu)點，常用于單抗的篩選和鑒定。凡檢測針對細胞內(nèi)成分的單抗，將細胞片經(jīng)-20℃冷丙酮固定后作熒光染色；而檢測針對細胞內(nèi)成分的單抗，則用活細胞作膜熒光染色。

(4)放射免疫測定在篩選和鑒定單抗時常用固相抗原法，其反應(yīng)原理與ELISA相似，所不同的是用放射性同位素(如125I)標記的羊或兔抗鼠抗體代替酶標抗體作指示系統(tǒng)。由于同位素半衰期的限制，操作和同位素污染對人的危害以及廢物處理的困難，一般實驗室很少采用。

(5)間接血凝試驗(PHA)該法快速、簡便、較為敏感、影響因素少，易掌握，也常應(yīng)用于單抗的篩檢。但因敏感性和反應(yīng)范圍的限制，不如ELISA應(yīng)用廣?，F(xiàn)在是24頁\一共有33頁\編輯于星期三雜交瘤細胞的克隆化融合后必須對陽性孔中雜交瘤細胞進行克隆化，其原因是：①融合后陽性孔中的雜交瘤細胞不一定都是目的細胞；②一些初生雜交瘤細胞是不穩(wěn)定的，可能丟失染色體，喪失產(chǎn)生抗體能力，需不斷清除變異細胞；③在液氮中長期保存的雜交瘤細胞也有喪失分泌抗體的可能。所有這些情況說明，需對雜交瘤細胞進行連續(xù)克隆化，以純化目的細胞。現(xiàn)在是25頁\一共有33頁\編輯于星期三（八）單克隆抗體的大量制備體內(nèi)法培養(yǎng)法現(xiàn)在是26頁\一共有33頁\編輯于星期三雜交瘤技術(shù)操作中應(yīng)注意的主要問題(1)對所用的骨髓瘤細胞的使用歷史要清楚，即一定是沒有污染的曾獲得高融合率的可靠細胞。融合時，骨髓瘤細胞要處于最佳生長狀態(tài)。

(2)用于融合的主要試劑，如聚乙二醇(PEG)、胸腺密啶核苷(T)、次黃嘌呤和小牛血清的質(zhì)量要可靠、特別是小牛血清和PEG，就是同一廠家不同批次產(chǎn)品的質(zhì)量差異也影響融合和培養(yǎng)效果。在實驗室中一定要貯備經(jīng)過融合考驗的主要試劑。對每批小牛血清都要作細胞生長試驗。

現(xiàn)在是27頁\一共有33頁\編輯于星期三(3)配液用的水質(zhì)好壞也是一個重要問題。一般來說，無離子水再經(jīng)雙蒸或三蒸水用于配制各種液體是沒有什么問題的。

(4)在進行雜交瘤試驗之前，要調(diào)好培養(yǎng)箱溫、CO2濃度，使其穩(wěn)定，并保持飽和濕度。

(5)嚴格無菌操作對搞好雜交瘤技術(shù)是至關(guān)重要的。一切用于培養(yǎng)的液體均需十分可靠。各種培養(yǎng)液的包裝盡量要小。同一包裝的液體最好一次用完，不能多次重復使用。每次使用的剩余液體要放在30℃溫箱菌檢?，F(xiàn)在是28頁\一共有33頁\編輯于星期三四、單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學的疾病診斷，以提高疾病診斷的準確性。利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成本，同時也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學研究，從而推動現(xiàn)代醫(yī)學的不斷發(fā)展。

現(xiàn)在是29頁\一共有33頁\編輯于星期三單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展1.在融合技術(shù)上除用聚乙二醇融合劑外，發(fā)展了電融合、激光融合和定向融合技術(shù)2.發(fā)展了異源和非鼠源雜交瘤用小鼠骨髓瘤細胞與其它動物(如兔、牛、豬、綿羊等)脾細胞融合，獲得異源雜交瘤。但融合率低，穩(wěn)定性差。3.發(fā)展了雙特異性抗體這是兩種分泌不同單抗的雜交瘤細胞間融合產(chǎn)生的雜交的雜交瘤。其方法是先研制對HAT敏感的親本雜交瘤細胞，然后與另一雜交瘤細胞融合，篩選。篩選出的雜交瘤分泌的單抗為雙特異性?，F(xiàn)在是30頁\一共有33頁\編輯于星期三4.發(fā)展了嵌合抗體、重構(gòu)抗體和小分子抗