第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法(4學(xué)時)

細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗證的假說設(shè)計試驗收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識生物學(xué)研究模式生物是基于不同物種享有共同分子機(jī)制現(xiàn)在是1頁\一共有46頁\編輯于星期四CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana現(xiàn)在是2頁\一共有46頁\編輯于星期四第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)現(xiàn)在是3頁\一共有46頁\編輯于星期四第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

1光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

2

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)3掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)現(xiàn)在是4頁\一共有46頁\編輯于星期四一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserScanningConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）（自習(xí)）現(xiàn)在是5頁\一共有46頁\編輯于星期四普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離現(xiàn)在是6頁\一共有46頁\編輯于星期四普通光學(xué)顯微鏡現(xiàn)在是7頁\一共有46頁\編輯于星期四各種顯微鏡的分辨率梯度現(xiàn)在是8頁\一共有46頁\編輯于星期四熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）原理現(xiàn)在是9頁\一共有46頁\編輯于星期四熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接熒光標(biāo)記技術(shù)(免疫熒光標(biāo)記技術(shù))

用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

現(xiàn)在是10頁\一共有46頁\編輯于星期四應(yīng)用：綠色熒光蛋白現(xiàn)在是11頁\一共有46頁\編輯于星期四激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：應(yīng)用： 排除焦平面以外光的干擾，增強 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，通過“光切片”觀察樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在是12頁\一共有46頁\編輯于星期四激光共焦掃描顯微系統(tǒng)(Confocal

System)現(xiàn)在是13頁\一共有46頁\編輯于星期四PineTreepollen-collectedonaBio-RadMRC1024atPurdueUniversityCytometryLaboratories

利用光切片技術(shù)顯示的花粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是14頁\一共有46頁\編輯于星期四1為轉(zhuǎn)GFP基因的煙草單細(xì)胞；2為轉(zhuǎn)SCaM1-GFP融合基因的煙草單細(xì)胞；3為轉(zhuǎn)SCaM4-GFP融合基因的煙草單細(xì)胞。

質(zhì)壁分離后轉(zhuǎn)基因煙草單細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞壁細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞壁細(xì)胞壁細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞膜細(xì)胞壁細(xì)胞核細(xì)胞膜現(xiàn)在是15頁\一共有46頁\編輯于星期四二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較

電子顯微鏡的基本構(gòu)造

現(xiàn)在是16頁\一共有46頁\編輯于星期四電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差現(xiàn)在是17頁\一共有46頁\編輯于星期四電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子束照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)現(xiàn)在是18頁\一共有46頁\編輯于星期四二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較

電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)

負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)超薄切片技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

現(xiàn)在是19頁\一共有46頁\編輯于星期四主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）

染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)，如病毒、核糖體等結(jié)構(gòu)。

冷凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）

冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。

電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）

主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實驗手段。

現(xiàn)在是20頁\一共有46頁\編輯于星期四固定

包埋切片染色超薄切片技術(shù)現(xiàn)在是21頁\一共有46頁\編輯于星期四超薄切片技術(shù)圖片示例現(xiàn)在是22頁\一共有46頁\編輯于星期四冷凍蝕刻現(xiàn)在是23頁\一共有46頁\編輯于星期四二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)

負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)超薄切片技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

現(xiàn)在是24頁\一共有46頁\編輯于星期四掃描電鏡原理與應(yīng)用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。

CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題現(xiàn)在是25頁\一共有46頁\編輯于星期四現(xiàn)在是26頁\一共有46頁\編輯于星期四三、掃描遂道顯微鏡ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器。反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。特點：分辨率高：

側(cè)分辨率：分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.001nm不受介質(zhì)限制非破壞性

用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)，觀察生物大分子、膜、病毒等的結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在是27頁\一共有46頁\編輯于星期四

2.特異蛋白抗原的定位與定性

3.細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

4.放射自顯影技術(shù)

1.離心分離技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法現(xiàn)在是28頁\一共有46頁\編輯于星期四一、離心分離技術(shù)

用途：分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分

密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離現(xiàn)在是29頁\一共有46頁\編輯于星期四差速離心現(xiàn)在是30頁\一共有46頁\編輯于星期四密度梯度離心常用的介質(zhì)：蔗糖、氯化銫、甘油等?，F(xiàn)在是31頁\一共有46頁\編輯于星期四二、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限免疫電鏡技術(shù)免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用：能對蛋白進(jìn)行精細(xì)定位。如通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)現(xiàn)在是32頁\一共有46頁\編輯于星期四免疫熒光技術(shù)圖片示例現(xiàn)在是33頁\一共有46頁\編輯于星期四免疫膠體金技術(shù)原理與圖片示例現(xiàn)在是34頁\一共有46頁\編輯于星期四三、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

現(xiàn)在是35頁\一共有46頁\編輯于星期四四、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動態(tài)和追蹤研究。

現(xiàn)在是36頁\一共有46頁\編輯于星期四現(xiàn)在是37頁\一共有46頁\編輯于星期四第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程

1細(xì)胞的培養(yǎng)2細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)現(xiàn)在是38頁\一共有46頁\編輯于星期四一、細(xì)胞的培養(yǎng)

動物細(xì)胞培養(yǎng) 類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturecell） 傳代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell）

細(xì)胞株（cellstrain）正常二倍體，具有接觸抑制。

細(xì)胞系（cellline）染色體改變，接觸抑制喪失，無限傳代植物細(xì)胞培養(yǎng)非細(xì)胞體系（cell-freesystem）

研究DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成等生命活動現(xiàn)在是39頁\一共有46頁\編輯于星期四現(xiàn)在是40頁\一共有46頁\編輯于星期四Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng)現(xiàn)在是41頁\一共有46頁\編輯于星期四二、細(xì)胞工程細(xì)胞融合（cellfusion）與細(xì)胞雜交（cellhybridization）技術(shù)單克隆抗體技術(shù)細(xì)胞拆合與顯微鏡操作技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物與轉(zhuǎn)基因植物

現(xiàn)