實(shí)驗(yàn)多抗制備4免疫比濁課件

沉淀反應(yīng)本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)——LDL多抗鑒定及效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)二、免疫濁度測(cè)定——免疫球蛋白檢測(cè)

一、本次實(shí)驗(yàn)的目的：1、掌握可溶性抗原制備抗血清鑒定的常用方法。2、掌握雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法。3、掌握抗體效價(jià)的判斷。4、掌握免疫濁度的測(cè)定原理。5、熟悉免疫球蛋白檢測(cè)的臨床意義。分類液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)免疫濁度測(cè)定凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)免疫擴(kuò)散免疫電泳單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)火箭免疫電泳對(duì)流免疫電泳沉淀反應(yīng)思考：抗原抗體反應(yīng)的四大特點(diǎn)？特異性可逆性比例性階段性沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)抗原為可溶性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段：第一階段、抗原抗體特異性結(jié)合(不可見(jiàn))第二階段、形成可見(jiàn)的免疫復(fù)合物（可見(jiàn)）

條件

電解質(zhì)，溫度，酸堿度

★根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c方法不同，可將固相內(nèi)沉淀驗(yàn)分為2類：（一）免疫擴(kuò)散①單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(singlegeldiffusiontest)②雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(doublegeldiffusiontest)（二）凝膠免疫電泳(gelimmuno-electrophoresis)火箭免疫電泳雙擴(kuò)散免疫電泳一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(一)原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測(cè)的抗原物質(zhì)在凝膠中自由擴(kuò)散，與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。(二)操作步驟

（平板法）1.將抗體和0.9%瓊脂糖50-56℃混合,即刻傾注成平板。2.待凝固后在瓊脂板上打孔,孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液。3.置37℃,讓其向四周自由擴(kuò)散,24-48h后可見(jiàn)其孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。(三)方法評(píng)價(jià)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是一種穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、毋需特殊設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室均可使用的常規(guī)方法，試驗(yàn)的重復(fù)性和線性均好。敏感度為1.25mg/L(四)影響因素1.抗原分子量

抗原分子量大，擴(kuò)散慢，沉淀環(huán)較小；抗原分子量小，擴(kuò)散快，沉淀環(huán)相對(duì)較大。要求待檢血清和抗原標(biāo)準(zhǔn)品在血清學(xué)上具有均一性，否則可能出現(xiàn)結(jié)果偏高或偏低。

2.抗體種類實(shí)驗(yàn)證明兔抗血清優(yōu)于馬、羊抗血清，兔抗血清可測(cè)抗原0.1~1IU/ml，馬抗血清為1~10IU/ml，羊?yàn)?.4~4IU/ml，為提高實(shí)驗(yàn)敏感度，應(yīng)首選敏感度高的抗血清。3.抗體稀釋度

抗體濃度大，沉淀環(huán)小，則敏感度低；抗體濃度小，沉淀環(huán)增大，不同濃度抗原間的差別較顯著，敏感度高。但沉淀環(huán)過(guò)大，常造成邊緣糊不清，致使測(cè)量誤差也增大。因此要求在沉淀環(huán)清晰的基礎(chǔ)上加大稀釋度以提高敏感度。(二)操作步驟

（平板法）融化瓊脂，澆板每張載玻片約4ml。凝固，打孔孔徑3mm，孔間距3~5mm，孔型有雙孔型、三角孔型、雙排孔型和梅花孔型。加樣在相對(duì)孔內(nèi)加抗原或抗體。孵育使抗原抗體自由擴(kuò)散，在兩孔之間抗原抗體相遇，在比例適時(shí)形成可見(jiàn)的沉淀線。沉淀線的數(shù)目、形態(tài)和位置與抗原和抗體的純度、濃度和擴(kuò)散速度有關(guān)。(三)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的應(yīng)用1.檢測(cè)未知抗原或抗體及其相對(duì)含量將已知的抗體或抗原與待檢標(biāo)本加入成對(duì)孔中根據(jù)沉淀線有無(wú)定性；根據(jù)沉淀線的位置估計(jì)抗原或抗體的相對(duì)含量根據(jù)沉淀弧形狀判斷抗原或抗體的相對(duì)擴(kuò)散速率。2.抗原性質(zhì)分析利用三角孔型，將待檢抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原加入相鄰兩個(gè)孔中，與另一孔相對(duì)，根據(jù)沉淀線形狀分析待測(cè)抗原，見(jiàn)圖。

三種擴(kuò)散基本圖型3.抗體效價(jià)滴定用梅花型孔，中間放抗原，周圍孔放下不同稀釋度的相應(yīng)抗體，以出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋倍數(shù)為該抗體的效價(jià)。4.抗體或抗原純度鑒定用混合抗原或抗體鑒定抗體或抗原，出現(xiàn)一條沉淀線說(shuō)明待測(cè)抗原或抗體純，出現(xiàn)多條說(shuō)明不純。雙擴(kuò)散試驗(yàn)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，用途廣泛缺點(diǎn)：技術(shù)靈敏度低，出現(xiàn)結(jié)果慢，不能精確定量。（二）類型透射免疫比濁法散射免疫比濁法免疫膠乳比濁法

1透射免疫比濁法原理：

抗原抗體在一定緩沖液中形成免疫復(fù)合物(IC)，當(dāng)光線透過(guò)反應(yīng)溶液時(shí)，由于溶液內(nèi)復(fù)合物粒子對(duì)光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復(fù)合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和復(fù)合物的量成正比，當(dāng)抗體量固定時(shí)，與待檢抗原量成正比。用抗原標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可測(cè)出待檢抗原含量。方法評(píng)價(jià)：優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度比單擴(kuò)法高5—10倍；②CV小于10％；③操作簡(jiǎn)便快速，1h可報(bào)告結(jié)果；④結(jié)果準(zhǔn)確，且能用全自動(dòng)化或半全自動(dòng)化儀器進(jìn)行分析，尤其隨著膠乳粒子增強(qiáng)濁度測(cè)定法的出現(xiàn)，使敏感度提高，其應(yīng)用更加廣泛。缺點(diǎn)：抗體用量較大；檢測(cè)需抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡，耗時(shí)較長(zhǎng)；不宜用于藥物等半抗原的測(cè)定；靈敏度較散射比濁法低。2散射免疫比濁法原理：

散射光系指一定波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復(fù)合物，光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，這種偏轉(zhuǎn)的角度可因光線波長(zhǎng)和顆粒大小不同而有所區(qū)別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測(cè)粒子發(fā)出的散射光，散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量呈正比，即待測(cè)抗原越多，形成復(fù)合物越多，散射光強(qiáng)度越強(qiáng)。又可分為速率散射比濁法(ratenephelometry)和終點(diǎn)散射比濁法(endpointnephelometry)。3免疫膠乳比濁法原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，則發(fā)生凝集，單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)，光線可透過(guò)，當(dāng)兩個(gè)膠乳凝集時(shí)，則使透過(guò)光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。（a）帶抗體的膠乳在波長(zhǎng)之內(nèi)可透過(guò)光線；（b）結(jié)合后，則形成光線衰減方法評(píng)價(jià)敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應(yīng)液中無(wú)PEG沉淀劑的影響，個(gè)體IC對(duì)結(jié)果影響也小，所以結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設(shè)備，一般分光光度計(jì)、自動(dòng)化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

總評(píng)價(jià)缺點(diǎn)：測(cè)定結(jié)果與儀器的性能和試劑的質(zhì)量密切相關(guān)，特別對(duì)抗體的質(zhì)量要求高，儀器和試劑價(jià)格比較貴。優(yōu)點(diǎn)：①自動(dòng)化②快速(30～60s)③靈敏(μg/L)④準(zhǔn)確⑤精密度高(CV<5％)⑥穩(wěn)定性好⑦節(jié)省試劑⑧檢測(cè)范圍廣⑨不需減去樣本和試劑本底值等優(yōu)點(diǎn)。(三)免疫比濁法主要影響因素抗原抗體比例抗體的質(zhì)量抗原抗體反應(yīng)的溶液增濁劑的使用1抗原抗體比例高劑量鉤狀效應(yīng)（highdosehookeffect)海德堡（heidelberger）曲線理論2抗體的質(zhì)量（1）特異性高（2）效價(jià)高（3）親和力高（4）抗血清來(lái)源3抗原抗體反應(yīng)的溶液pH6.5~8.5電解質(zhì)離子強(qiáng)度、種類（磷酸鹽緩沖液）4增濁劑的使用PEG、tween-20等非離子型親水劑作用：消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復(fù)合物。本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)——LDL多抗鑒定及效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)二、免疫濁度測(cè)定——免疫球蛋白檢測(cè)

血清的采集與處理取血方法：血清的采集：耳緣靜脈取血或頸動(dòng)脈取血。血清處理：

取好血后，放入