細(xì)胞因子檢測(cè)1(干貨分享)

細(xì)胞因子檢測(cè)細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類生物活性物質(zhì)分泌的蛋白質(zhì)，在體內(nèi)廣泛參與免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)、刺激造血系統(tǒng)、刺激細(xì)胞的增殖與凋均起重要作用。某些刺激因子也可導(dǎo)致一些細(xì)胞因子超量表達(dá),株(即靶細(xì)胞)的促增殖作用,以增殖細(xì)胞中的DNA的合成或株(即靶細(xì)胞)的促增殖作用,以增殖細(xì)胞中的DNA的合成或或mRNA量，推算出細(xì)胞因子的合成量。1，或用P388D1(鼠)，THP-1(人)細(xì)胞株制備IL－1。本試清的Hanks液(5％NB—SHBSS),輕揉腹部吸出腹腔液體5、每孔用5％NBS—HBSS洗3次，棄去未粘附細(xì)胞，貼6、將LPS(10μg／ml)加入巨噬細(xì)胞單層,每孔1ml，培養(yǎng)4h;MTT比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑鹽[3－(4。5-bromide，MTT)在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，被還除去消化液后，用10％FCS的RPMI—1640將L929細(xì)3、用PBS溶解MTT為5mg／ml，用0。22μm膜濾器除菌5、從每孔吸出100μl上清棄去,加酸化異丙醇或加DMSO100測(cè)量OD值。測(cè)定應(yīng)在酸化異丙醇加入后1h內(nèi)完成。OD570nm－OD630nm,再減去培養(yǎng)液對(duì)照的OD值.OD值(Y)作直線回歸,按上述概率單位分析法計(jì)算待測(cè)樣品IL-2的活性單位(u/ml)。(三)注意事項(xiàng)可減少操作中的污染。研磨組織可用玻璃勻漿器、不銹鋼網(wǎng).(一)原理選用兩種針對(duì)rHuTNF—α分子不同表位的單克3、標(biāo)準(zhǔn)品:rHuTNF-α(10ng/ml)，使用時(shí)用稀釋液作倍并噻吡咯呆-6磺酸)。8、包被緩沖液：0．05mol/L，pH9.6Na2CO3-NaHCO39、洗滌液：0。05%Tween20—PBS。10、稀釋液:4％PEG-洗滌液(用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和酶標(biāo)抗體)。12、3%H2O2。13、血清、枸緣酸鹽或EDTA抗酸血漿、其它體液及細(xì)胞培養(yǎng)14、ELISA讀數(shù)儀等.(三)操作步驟取標(biāo)準(zhǔn)品150μl(10ng／ml)倍比稀釋7個(gè)濃度:溫或37℃顯色15~30min。ELISAnmOD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.4、疊氮鈉(NaN3)對(duì)辣根過氧化物酶(HRP)有滅活作用，在本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中應(yīng)避免使用.KH2PO40.2g雙蒸水加至100mlNa2CO31．59gNaHCO32。93gPBS1000mlTween200.5ml4。稀釋液PEG(聚乙二醇,MW6000)2。0gNaCl2。9gNa2HPO4·12H2O1．79gABTS5mg3％H2O220μl細(xì)胞因子基因的檢測(cè)包括對(duì)其DNA的檢測(cè)和mRNA表達(dá)的檢2mRNA的測(cè)定(斑點(diǎn)雜交法).將RNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖測(cè)，故很適合于臨床應(yīng)用.亦可用于DNA的檢測(cè)。但其缺點(diǎn)是(一)主要試劑1．RNA提取試劑:TRIZOL試劑(Gibcol，No.15596－(BoerhingerMannheim，5.IL－2DNA探針(1)STE溶液0．1mol/LNaCl1mmol／LEDTA(pH8．0)25mmol/LTris。Cl(pH8．0)mmol/LEDTA(pH8．0)(3)溶液Ⅱ0。2mol／LNaOH(臨用前用10mol/L貯存液稀1％SDS(配20％貯存液)5~10min.5ml(5)含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基l(8)無水乙醇(部分—20℃預(yù)冷).異丙醇．75%乙醇(部分4℃預(yù)冷)(9)TE緩沖液(pH8.0)(11)RNA酶，RPMI－1640,胎牛血清(FCS)，ConA(刀豆蛋白A)等(12)500μl含13％(W/V)聚乙二醇(PEG800)的(二)主要儀器(三)IL－2質(zhì)粒DNA探針的大量制備取含IL—2質(zhì)粒DNA的單個(gè)菌落置兩個(gè)25mlLB培養(yǎng)基(含100μg/mlAmp)↓37℃220r/min振搖過夜(約16h)取10ml菌液加200mlLB培養(yǎng)液(含100μg/mlAmp)每管加40mlSTE溶液(冰預(yù)冷)懸浮細(xì)菌后,用移液管轉(zhuǎn)入到(pH8．0)的溶菌酶(10mg/ml)加7。5ml溶液Ⅲ(冰預(yù)冷)，輕振蕩離心管數(shù)次使之混合置用1。5mlTE(pH8.0)將沉淀溶解，加等體積冰預(yù)冷的5MRNA酶(終濃度100μg/ml)加等體積(500μl)含13％(W／V)PEG(800)的1.6mol／LNaCl，充分混合↓12000r/min×10min離心24:1)劇烈混勻呈乳白狀吸上層水相移至另一EP管，加等體積氯仿：異戊醇(24:1)混勻吸上層水相移至新EP管(硅化)，加入0．1體積的3mol/LNaAc(pH5.2)和2體積的—20℃預(yù)冷的無水乙醇，混勻次↓4℃12000r/min×5min離心去上清盡↓質(zhì)粒DNA10μlDW38μldTMMinicolumn中，用2ml80％異丙醇洗滌Minicolum,1(四)用DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒對(duì)IL-2探針進(jìn)行地高辛標(biāo)記ddUTP，它們分別適用于RNA探針，DNA探針和寡核苷酸探針的標(biāo)記。地高辛精標(biāo)記核苷酸主要通過酶反應(yīng)標(biāo)記核酸探針，用標(biāo)記探針做原位雜交，雜交體用特異性抗地高辛精抗體通過在適宜的標(biāo)記反應(yīng)條件下，一般每20~25地高辛精之間的反應(yīng)。因?yàn)橐粋€(gè)標(biāo)記抗體大約復(fù)蓋20個(gè)核苷酸。BoehringerMannheim公司生產(chǎn)的地高辛精DNA標(biāo)記試劑盒和地高辛檢測(cè)試劑盒在分子雜交中的應(yīng)用愈來愈廣泛?，F(xiàn)介紹地高辛標(biāo)記cDNA探針隨機(jī)對(duì)照DNA作為對(duì)照.DNAl苷混合物(試劑5)；③2μldNTP混合3、離心片刻后，將離心管置37℃恒溫箱內(nèi)孵育60min.延6、離心(16500r／min)，棄上清液,用50μl70％冷(五)培養(yǎng)細(xì)胞RNA的提取(采用Trizol試劑盒提取RNA)1、收集培養(yǎng)細(xì)胞，用RPMI—1640培養(yǎng)液離心洗滌3次,第心機(jī)離心,棄上清,加入1mlTRIZOL試劑,用移液器輕輕吹打3、于2~8℃離心14600r/min×15min，上層無色水相(RNA4、小心吸取其中400μl移至另一Eppendorf管中，加入0。5、于2~8℃離心14600r/min×10min，在管壁下底處可見一乳白色小沉淀塊，即為RNA。棄上清。(六)RNA的斑點(diǎn)雜交60℃溫育30min,水浴冷卻樣品2、纖維素膜處理過程：硝酸纖維素膜(0。45μm)水中浸泡5min,再用20×SSC室溫浸泡1h。3、濾器的處理及點(diǎn)樣：用0。1NNaOH浸泡(洗)多孔過濾4、取出膜,80℃烤2~3h,膜保存于-20℃CpHNaCl175。3g用10NNaOHor10NHCl調(diào)pH至7。0,高壓消毒1)預(yù)雜交液：5×SSC,0．75%(W／V)封閉劑,0.1%(W/V)2)先將預(yù)雜交液熱至60℃。3)將帶有目的RNA的硝酸纖維素膜放入稍寬于濾膜的塑料1)雜交液(DIGEasyHyb(20ml／100cm2)預(yù)溫輕2)將標(biāo)記探針DNA(5~25ng/ml)煮沸變性5min，迅速置冰水3)加入到預(yù)溫的DIGEasyHyb(2．5ml/100cm2)中混4)然后每張膜上注入預(yù)雜交液和滴加探針/DIGEasyHybh7)68℃振蕩條件下,0。1×SSC,0.1％SDS清洗2次，每次(七)免疫測(cè)定1、雜交后徹底清洗,將膜置入清洗緩沖液中1~5min.2.、100ml封閉緩沖液(1×)中封閉30min。3、抗地高辛—AP復(fù)合物(75mU/ml)用封閉緩沖液(1×)1∶5、100ml清洗緩沖液中2次，每次15min。6、20ml測(cè)定緩沖液中平衡2~5min。