暗河式厭氧產(chǎn)沼技術(shù)生物學(xué)基礎(chǔ)

暗河式厭氧產(chǎn)沼技術(shù)生物學(xué)基礎(chǔ)第1頁(yè)/共69頁(yè)目錄一、課題的來(lái)源、目的、意義，國(guó)內(nèi)外概況和預(yù)測(cè)二、預(yù)計(jì)需達(dá)到的要求、技術(shù)指標(biāo)，預(yù)計(jì)的技術(shù)關(guān)鍵、技術(shù)方案和主要試驗(yàn)研究情況三、課題研究進(jìn)展計(jì)劃四、現(xiàn)有的條件、人員及主要設(shè)備情況五、需要增添的主要設(shè)備、儀器和材料。六、經(jīng)費(fèi)概算和來(lái)源。七、承擔(dān)單位和主要協(xié)作單位及分工。第2頁(yè)/共69頁(yè)一、課題的來(lái)源、目的、意義

國(guó)內(nèi)外概況和預(yù)測(cè)1課題的來(lái)源2課題提出背景3前期研究基礎(chǔ)4課題研究目的5課題研究意義6國(guó)內(nèi)外概況和預(yù)測(cè)第3頁(yè)/共69頁(yè)1課題來(lái)源、本課題來(lái)源于湖北省科技攻關(guān)項(xiàng)目——《暗河式生物質(zhì)產(chǎn)沼技術(shù)研究》。第4頁(yè)/共69頁(yè)2課題提出的背景2.1環(huán)保與社會(huì)發(fā)展背景農(nóng)業(yè)污染問(wèn)題：全世界每年的農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量超過(guò)20億t。1988年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部估計(jì)全國(guó)畜禽糞尿年排放量為18.84億噸，相當(dāng)于工業(yè)廢棄物排放量的3.4倍。1999年我國(guó)畜禽糞便產(chǎn)生量為19億t，是工業(yè)固體廢棄物的2.4倍，其中畜禽糞尿COD排放量已達(dá)7118萬(wàn)t，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)工業(yè)廢水與生活污水的排放量之和。截至目前，我國(guó)農(nóng)村每年約有農(nóng)業(yè)生物的廢棄物達(dá)到40多億噸，其中，牲畜糞便的排放量達(dá)到26億噸，農(nóng)業(yè)農(nóng)作物達(dá)到17億噸，目前，農(nóng)村大量的秸稈等有機(jī)固體廢物大多焚燒處理，這樣既浪費(fèi)資源，又造成了嚴(yán)重的大氣污染；畜禽糞便及其沖刷污水大多自然排放污染水體。第5頁(yè)/共69頁(yè)2課題提出的背景城市污染：隨著我國(guó)城市化進(jìn)程的加快和城市人口的增多，城市生活垃圾產(chǎn)量迅速增長(zhǎng)。據(jù)建設(shè)部統(tǒng)計(jì)資料表明，我國(guó)2004年城市生活垃圾的產(chǎn)生量為2億t，總積存量達(dá)66億噸，且每年以8－10%的速度遞增。據(jù)估計(jì)至2010年垃圾年產(chǎn)量將達(dá)2.2億噸。垃圾不僅占用大量的土地資源，而且影響我國(guó)的城市形象，同時(shí)給城市居民的身體健康帶來(lái)極大危害，從而成為制約我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)健康發(fā)展的重要因素。第6頁(yè)/共69頁(yè)2課題提出的背景2.2能源危機(jī)背景能源是社會(huì)文明發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。近四百年來(lái),人類將地球上“積蓄”了25億年的化石燃料如煤炭、石油和天然氣幾乎耗盡。而化石燃料作為不可再生資源，長(zhǎng)期的開發(fā)和使用勢(shì)必使得這類能源資源越來(lái)越少，這些不可再生資源日趨緊缺,能源危機(jī)已直接威脅到世界的和平與發(fā)展,成為不同政治制度國(guó)家共同關(guān)注的難題，此時(shí)人們將目光投到了生物質(zhì)能源的開發(fā)與利用上。

第7頁(yè)/共69頁(yè)2課題提出的背景2.3社會(huì)發(fā)展政策背景我國(guó)國(guó)務(wù)院“關(guān)于加快發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)的若干意見（國(guó)發(fā)〔2005〕22號(hào)）”將大力開展資源綜合利用,最大程度實(shí)現(xiàn)廢物資源化和再生資源回收利用和大力發(fā)展環(huán)保產(chǎn)業(yè),注重開發(fā)減量化、再利用和資源化技術(shù)與裝備等作為工作的重點(diǎn)之一。并進(jìn)一步指出：“要加快循環(huán)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)。國(guó)務(wù)院有關(guān)部門和地方各級(jí)人民政府有關(guān)部門要加大科技投入,支持循環(huán)經(jīng)濟(jì)共性和關(guān)鍵技術(shù)的研究開發(fā)”?！敖M織開發(fā)綠色再制造技術(shù)以及新能源和可再生能源開發(fā)利用技術(shù)等,提高循環(huán)經(jīng)濟(jì)技術(shù)支撐能力和創(chuàng)新能力?！鞭r(nóng)業(yè)部日前發(fā)出《關(guān)于貫徹〈國(guó)務(wù)院關(guān)于建設(shè)節(jié)約型社會(huì)近期重點(diǎn)工作的通知〉的意見》中提出建設(shè)節(jié)約型農(nóng)業(yè)八大重點(diǎn)，其中第六條就是鞏固提高農(nóng)村可再生資源綜合循環(huán)利用水平，加強(qiáng)農(nóng)村沼氣和可再生能源綜合開發(fā)利用；積極發(fā)展太陽(yáng)能、風(fēng)能、生物質(zhì)能和農(nóng)村水電等可再生能源。第8頁(yè)/共69頁(yè)2課題提出的背景2.4經(jīng)濟(jì)發(fā)展背景由于地球上生物數(shù)量巨大，生物質(zhì)所蘊(yùn)藏的能量相當(dāng)驚人。根據(jù)生物學(xué)家估算，地球上每年生長(zhǎng)的生物能總量約1400-1800億噸（干重），相當(dāng)于目前世界總能耗的10倍。我國(guó)的生物質(zhì)能也極為豐富，現(xiàn)在每年農(nóng)村中的秸稈量約6.5億噸，到2010年將達(dá)7.26億噸，相當(dāng)于5億噸標(biāo)煤。薪柴和林業(yè)廢棄物數(shù)量也很大，林業(yè)廢棄物每年約達(dá)3700萬(wàn)立方米，相當(dāng)于2000萬(wàn)噸標(biāo)煤。從資源學(xué)的觀點(diǎn)看，城市生活垃圾也是資源，而且是目前世界上唯一不斷增長(zhǎng)的潛在資源。垃圾中蘊(yùn)藏著巨大的潛能。如果用1.4×108t垃圾發(fā)電，可以節(jié)約2.3×107t煤炭。據(jù)有關(guān)測(cè)算，充分利用中國(guó)目前的城市垃圾，每年可以創(chuàng)造25億元的財(cái)富。

第9頁(yè)/共69頁(yè)3前期研究基礎(chǔ)

“暗河式生物質(zhì)產(chǎn)沼技術(shù)”是在湖北省自然科學(xué)基金資助下發(fā)展起來(lái)的，它是將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為能源的一種新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)室研制的暗河式厭氧反應(yīng)器，已獲得國(guó)家專利（專利號(hào)ZL200420065078.3）。本實(shí)驗(yàn)室課題組之前在暗河式垃圾厭氧消化技術(shù)和工藝研究方面取得了一定成果，這種工藝將有機(jī)固廢流態(tài)化，實(shí)現(xiàn)有機(jī)固廢厭氧發(fā)酵進(jìn)出料的連續(xù)化，解決產(chǎn)沼的連續(xù)性問(wèn)題。第10頁(yè)/共69頁(yè)4課題研究目的

（1）在前期研究與試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用好氧堆肥對(duì)暗河式厭氧反應(yīng)器進(jìn)行保溫實(shí)驗(yàn)，解決反應(yīng)器越冬問(wèn)題；（2）對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行生物預(yù)處理以提高反應(yīng)器啟動(dòng)的時(shí)間和發(fā)酵原料的生物轉(zhuǎn)化率；（3）重點(diǎn)對(duì)暗河式產(chǎn)沼反應(yīng)進(jìn)行深入的生物學(xué)基礎(chǔ)研究，揭示反應(yīng)器每一反應(yīng)階段中微生物優(yōu)勢(shì)菌群、群落演替和生理生化指標(biāo)變化對(duì)厭氧發(fā)酵工藝的影響，為厭氧發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化與控制提供理論依據(jù)。（4）運(yùn)用微生物學(xué)技術(shù)、生化和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行培養(yǎng)和研究，力爭(zhēng)篩選出適合生物質(zhì)厭氧發(fā)酵各個(gè)階段的高效菌群，提高反應(yīng)器的產(chǎn)氣率和生物質(zhì)轉(zhuǎn)化率。第11頁(yè)/共69頁(yè)5課題研究的意義5.1環(huán)境意義運(yùn)用厭氧消化技術(shù)處理有機(jī)垃圾具有很大的優(yōu)越性。厭氧消化產(chǎn)生的沼氣可以作為能源加以有效利用，同時(shí)也減少了CO2、CH4等溫室氣體的排放；反應(yīng)設(shè)備均為密閉狀態(tài)，不會(huì)有更多異味逸出；消化后產(chǎn)生的殘?jiān)鼣?shù)量較少進(jìn)行厭氧消化工藝研究，有機(jī)垃圾的資源化處理，對(duì)解決環(huán)境壓力有著非常重大的意義。第12頁(yè)/共69頁(yè)5課題研究的意義通過(guò)沼氣發(fā)酵，可殺滅畜禽糞水中的病原微生物。血吸蟲卵在常溫沼氣池內(nèi)7～22天被殺滅；鉤蟲卵經(jīng)30天殺滅90％，兩個(gè)月死亡率達(dá)99％；蛔蟲卵30～40天被殺滅；痢疾桿菌在沼氣池中30h死亡。所以，厭氧消化產(chǎn)沼技術(shù)的研究，對(duì)于改善生活環(huán)境，減少了人畜共患病的發(fā)生，保證了人民的身體健康同樣有著重要意義。第13頁(yè)/共69頁(yè)5課題研究的意義5.2能源意義生物質(zhì)是植物通過(guò)光合作用生成的有機(jī)物，它的能量最初來(lái)源于太陽(yáng)能，所以生物質(zhì)能是太陽(yáng)能最主要的吸收器和儲(chǔ)存器，是人類最主要的可再生能源之一。生物質(zhì)能源的生產(chǎn)和利用將成為人類能源的發(fā)展方向，其高效轉(zhuǎn)換和潔凈利用日益受到全世界的重視。本課題利用暗河厭氧反應(yīng)器，以城市生活垃圾、畜禽糞便、秸稈、污泥等生物質(zhì)為原料，進(jìn)行高效產(chǎn)沼試驗(yàn)研究，有著非同尋常的能源利用意義。第14頁(yè)/共69頁(yè)5課題研究的意義5.3經(jīng)濟(jì)意義利用厭氧生物處理技術(shù)將有機(jī)物分解為甲烷、二氧化碳和水。這種處理方式一般不需消耗能源，處理后廢水也可達(dá)標(biāo)排放，更重要的是可實(shí)現(xiàn)廢棄物的綜合利用，變廢為寶、化害為利。利用沼氣工程處理畜禽糞便污水，每去除一公斤有機(jī)物可獲得一定的清潔沼氣燃料(可發(fā)0.6度電)。再加上上述日益增長(zhǎng)的城市垃圾的排放量，厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的沼氣即可帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。沼渣液氣的綜合利用所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益同樣是不可估量的。第15頁(yè)/共69頁(yè)6國(guó)內(nèi)外概況和預(yù)測(cè)6.1厭氧消化機(jī)理研究生物質(zhì)經(jīng)過(guò)厭氧消化產(chǎn)生沼氣的過(guò)程就是在特定的厭氧條件下，微生物將有機(jī)質(zhì)進(jìn)行分解，其中一部分碳素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為CH4和CO2，由于厭氧消化參加反應(yīng)的微生物種類繁多，所以過(guò)程復(fù)雜。國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)厭氧發(fā)酵過(guò)程中物質(zhì)的代謝、轉(zhuǎn)化和各種菌群的作用等進(jìn)行了大量的研究。對(duì)厭氧消化的微生物學(xué)和生物化學(xué)的認(rèn)識(shí)，經(jīng)歷了一個(gè)由膚淺到深入的逐漸完善的過(guò)程。第16頁(yè)/共69頁(yè)6.1厭氧消化機(jī)理研究1776年，意大利物理學(xué)家AlexanderVolta測(cè)出湖底植物體腐爛所產(chǎn)生的氣體中含有甲烷。1875年，俄國(guó)科學(xué)家Popof首先利用河泥加入纖維素物質(zhì)中產(chǎn)生甲烷，發(fā)現(xiàn)甲烷發(fā)酵是一個(gè)為生物學(xué)過(guò)程。

1901年，荷蘭學(xué)者所Sohngen對(duì)產(chǎn)甲烷菌的形態(tài)特征以及它們所能進(jìn)行的轉(zhuǎn)化作用提出了一個(gè)較清楚的概念，并發(fā)現(xiàn)氫和二氧化碳的混合物發(fā)酵能夠生成甲烷。1916年，俄國(guó)生物學(xué)家Omeliansky分離出第一株產(chǎn)甲烷菌（現(xiàn)已證明不是一個(gè)純種），命名為奧式甲烷菌（Methanobaillus），第17頁(yè)/共69頁(yè)6.1厭氧消化機(jī)理研究1936年，H..ABarker采用化學(xué)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)下水道污泥，獲得了能很好發(fā)酵乙醇、丙醇和丁酸的有機(jī)體，并發(fā)現(xiàn)沼氣發(fā)酵分為產(chǎn)酸和分解酸產(chǎn)生甲烷兩個(gè)階段，初步形成了甲烷發(fā)酵的兩階段理論。該理論將厭氧發(fā)酵分為分解產(chǎn)酸階段和產(chǎn)氣階段第18頁(yè)/共69頁(yè)6.1厭氧消化機(jī)理研究1950年，美國(guó)R.EHungate教授建立了厭氧技術(shù)，解決了產(chǎn)甲烷菌的分離培養(yǎng)技術(shù)問(wèn)題，為以后對(duì)甲烷菌的研究提供了條件。

1967年，MPBryant采用改良的Hungate技術(shù)分離純化了奧式甲烷菌，證明它是產(chǎn)甲烷桿菌MOH菌株（Atethanobactervium）和“s”

有機(jī)體的共生體，從而揭示了產(chǎn)氫細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌之間的相互依賴關(guān)系，進(jìn)一步推動(dòng)了厭氧發(fā)酵的機(jī)理研究第19頁(yè)/共69頁(yè)6.1厭氧消化機(jī)理研究1972年，Bryantlzgl等人對(duì)兩階段理論進(jìn)行了修正，提出了厭氧消化的三階段理論，突出了產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的地位和作用。（1）水解階段：厭氧有機(jī)物分解菌產(chǎn)生胞外水解酶把非水溶性大分子的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等水解成可溶性的較小分子化合物；（2）產(chǎn)氫產(chǎn)酸階段：此階段是由厭氧的產(chǎn)氫、產(chǎn)乙酸菌群把第一階段產(chǎn)生的各種有機(jī)酸分解成乙酸、H2和CO2的過(guò)程。（3）產(chǎn)氣階段：此階段是由嚴(yán)格厭氧的產(chǎn)甲烷菌群利用一碳化合物（CO2、甲醇、甲酸、甲基胺或CO）、二碳化合物（乙酸）和H2產(chǎn)生甲烷的過(guò)程。第20頁(yè)/共69頁(yè)6.1厭氧消化機(jī)理研究與此同時(shí)，Zeikuslao等人提出了厭氧消化的四類群理論，反映了同型產(chǎn)乙酸菌的作用該理論認(rèn)為專性產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌對(duì)還原性有機(jī)物的氧化作用，生成H2、HC03－、CH3COOH。同型產(chǎn)乙酸細(xì)菌將H2、HC03－轉(zhuǎn)化為CH3COOH，同時(shí)有少量的CH4、CO2、N2生成。

第21頁(yè)/共69頁(yè)6.2厭氧消化微生物類群研究參加厭氧消化過(guò)程的微生物，有發(fā)酵性細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、同型產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌。在厭氧消化中，發(fā)酵性細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、同型產(chǎn)乙酸菌等可將復(fù)雜的大分子有機(jī)物水解為簡(jiǎn)單的小分子有機(jī)物，并進(jìn)一步發(fā)酵為乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)酸和乙醇等，這類細(xì)菌種類繁多，代謝能力強(qiáng)，繁殖速度快，世代時(shí)間短(幾十分鐘)。產(chǎn)甲烷階段的生物相主要是產(chǎn)甲烷菌，他們的種類相對(duì)較少，利用底物的專一性強(qiáng)，繁殖速度慢，世代時(shí)間最長(zhǎng)可達(dá)4-6d，而且對(duì)環(huán)境因素的影響要比發(fā)酵細(xì)菌敏感得多。隨著對(duì)產(chǎn)甲烷菌研究的不斷深入，截至2000年，發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)甲烷菌種數(shù)已達(dá)99種第22頁(yè)/共69頁(yè)6.2厭氧消化微生物類群研究水解階段的細(xì)菌：（厭氧和兼性厭氧）氣桿菌屬(Aerobacter,Aeromonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、梭狀芽抱桿菌屬(Clostridium)、埃希氏菌屬(Escherichia)、克氏桿菌屬(Klebsiella)、細(xì)螺旋體(Leptospira)、小球菌屬(Micrococcus)、奈氏球菌屬(Nesseria)、副大腸桿菌屬(Paracolobacterium)、變形桿菌屬(Proteus)、賽氏桿菌屬(Serratia)、鏈菌屬(Streptococcus)、假單胞菌屬(Pseudimonas)、紅極毛桿菌屬(Rhodoseudomonas)、八疊球菌屬(Sarcina)等，此外還有一些真菌(霉菌和酵母菌)和及少量的原生動(dòng)物(鞭毛蟲纖毛蟲和變形蟲等)。第23頁(yè)/共69頁(yè)6.2厭氧消化微生物類群研究產(chǎn)氫產(chǎn)酸階段的細(xì)菌：厭氧的產(chǎn)氫、產(chǎn)乙酸菌群。主要是S菌和M.O.H

（MethanogenicorganismutilizesH2的簡(jiǎn)寫)菌的共生體。

2CH3CH2OH+2H2OCH3COO-+4H2+2H+

⊿G。=192千然耳／反應(yīng)

4H2+HCO-+H+CH4+3H2O⊿G。=-135.6千然耳／反應(yīng)S菌M.O.H菌第24頁(yè)/共69頁(yè)6.2厭氧消化微生物類群研究S菌株屬于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌。產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌為產(chǎn)甲烷菌提供乙酸和氫氣，促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)；產(chǎn)甲烷細(xì)菌由于能利用分子氫而降低氫的分壓，有利于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此兩者共生聯(lián)合或稱互營(yíng)聯(lián)合作用。在自然界除S菌株外，還存在著其它種類的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌，此群細(xì)菌將第一階段的發(fā)酵產(chǎn)物如丙酸等三碳以上的有機(jī)酸、長(zhǎng)鏈脂肪酸、芳香族酸和醇類等氧化分解成乙酸和分子氫，目前產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌僅有少數(shù)被分離出來(lái)。第25頁(yè)/共69頁(yè)6.2厭氧消化微生物類群研究產(chǎn)氣階段菌群：起主要作用的細(xì)菌主要有馬氏甲烷細(xì)菌(Methanococcusmazei)、產(chǎn)甲烷球菌屬(Methanococusvanniel)、產(chǎn)甲烷八疊球菌屬(Methanosarcinamethanica、Methanosarcinabarkeru)、利用乙酸鹽甲烷桿菌屬(Methanobacteriumformicicum)、奧氏甲烷桿菌屬(Methanobacterium

omeliansku)、利用丙酸鹽甲烷桿菌屬(Methanobacteriumpropionicum)、利用醋酸鹽甲烷桿菌屬(Methanobacteriumruminanlium)、利用酪酸鹽甲烷桿菌屬(Methanobacteriumsuboxydans)、孫氏甲烷桿菌屬(Methanobacteriumsohngeny)等。第26頁(yè)/共69頁(yè)6.2厭氧消化微生物類群研究產(chǎn)氣階段是由嚴(yán)格厭氧的產(chǎn)甲烷菌群利用一碳化合物（CO2、甲醇、甲酸、甲基胺或CO）、二碳化合物（乙酸）和H2產(chǎn)生甲烷的過(guò)程。形成的甲烷中，約30％的甲烷來(lái)自氫的氧化和二氧化碳的還原作用；70％的甲烷來(lái)自乙酸。因此乙酸的降解形成甲烷，是甲烷形成過(guò)程中一個(gè)很重要的途徑。第27頁(yè)/共69頁(yè)6.3厭氧消化微生物分子生態(tài)學(xué)研究

分子生態(tài)學(xué)是應(yīng)用分子生物學(xué)的原理和方法來(lái)研究生命系統(tǒng)與環(huán)境系統(tǒng)相互作用的機(jī)理及其分子機(jī)制的科學(xué)．它是生態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相互滲透而形成的一門新興交叉學(xué)科，其特點(diǎn)是強(qiáng)調(diào)生態(tài)學(xué)研究中宏觀與微觀的緊密結(jié)合，用分子生物學(xué)的方法來(lái)解決種群水平的生物學(xué)問(wèn)題。第28頁(yè)/共69頁(yè)6.3厭氧消化微生物分子生態(tài)學(xué)研究厭氧消化是一個(gè)極其復(fù)雜的混合微生物作用的結(jié)果。針對(duì)目前傳統(tǒng)微生物分析方法存在的問(wèn)題,國(guó)際上諸多國(guó)家在環(huán)境微生物領(lǐng)域先后開展了分子生物學(xué)研究方法的建立和生物學(xué)評(píng)價(jià)工作,更精確地揭示了微生物種類和遺傳的多樣性。隨著近代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,不依靠純培養(yǎng)的微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法已得到廣泛發(fā)展和應(yīng)用。目前在微生物生態(tài)學(xué)研究中常用的方法有:PCR技術(shù)、核酸探針雜交技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、DNA直接測(cè)序、rRNA序列同源性分析方法和變形梯度凝膠電泳方法等,使微生物生態(tài)學(xué)研究有了重大突破。第29頁(yè)/共69頁(yè)熒光原為雜交技術(shù)（FISH）熒光原位雜交(簡(jiǎn)稱FISH)技術(shù)是一種應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示DNA序列位置的方法。其原理是利用一小段(通常15-30個(gè)堿基)用熒光物質(zhì)標(biāo)記過(guò)的DNA或RNA序列作為探針,將其直接投加到環(huán)境樣品中,利用其與樣品中同源性微生物細(xì)胞內(nèi)核酸分子的堿基互補(bǔ)配對(duì)特性,在熒光顯微鏡下,直接觀察和探測(cè)特定微生物的分布與數(shù)量。第30頁(yè)/共69頁(yè)熒光原為雜交技術(shù)（FISH）的發(fā)展與應(yīng)用1969年Gall和Pardue利用放射性同位素標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)細(xì)胞制片上非洲爪蟾細(xì)胞核內(nèi)的rDNA獲得成功。之后,Pardue等同年又以小鼠衛(wèi)星DNA為模板,利用體外合成的含3H的RNA為探針成功地與中期染色體標(biāo)本進(jìn)行了原位雜交,從而開創(chuàng)了RNA-DNA的原位雜交技術(shù)。1974年Evans第一次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái),提高了基因定位的準(zhǔn)確性。1981年,Roumam首次報(bào)道了熒光素標(biāo)記的cDNA作原位雜交。同年,Langer等用生物素標(biāo)記核苷酸制備探針。第31頁(yè)/共69頁(yè)熒光原為雜交技術(shù)（FISH）的發(fā)展與應(yīng)用1986年,Cremer與Licher等分別證實(shí)了熒光原位雜交(FISH)技術(shù)應(yīng)用于間期核檢測(cè)染色體非整倍體的可行性,從而開辟了間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究。1988年,Giovannoni將原位雜交技術(shù)引入了細(xì)菌學(xué)的研究中,他首先用放射性標(biāo)記rRNA寡核苷酸探針顯微探測(cè)細(xì)菌。隨著安全性較強(qiáng)的熒光技術(shù)的發(fā)展,1989年,DeLong首先用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針來(lái)探測(cè)獨(dú)立的微生物細(xì)胞，此項(xiàng)技術(shù)即熒光原位雜交(FISH)技術(shù)。隨后Amann,Stahl等人利用該技術(shù)對(duì)多種環(huán)境樣品進(jìn)行了研究,使該技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用日趨廣泛和成熟。

第32頁(yè)/共69頁(yè)熒光原為雜交技術(shù)（FISH）的發(fā)展與應(yīng)用通過(guò)利用FISH技術(shù)在環(huán)境樣品上直接原位雜交,不僅可測(cè)定不可培養(yǎng)微生物的形態(tài)特征及豐度,而且可原位分析它們的空間及數(shù)量分布。德國(guó)慕尼黑大學(xué)的Amann教授在環(huán)境微生物FISH技術(shù)研究中,進(jìn)行了大量深入詳盡的工作。Wagner、Manz及Luxmy,在此方面，特別是在污水處理中對(duì)微生物的種群原位監(jiān)測(cè)投入了大量的精力，對(duì)不同城市污水處理廠混合液樣品的微生物種群進(jìn)行熒光探針原位檢測(cè),。第33頁(yè)/共69頁(yè)熒光原為雜交技術(shù)（FISH）的發(fā)展與應(yīng)用進(jìn)入20世紀(jì)90年代以后,FISH技術(shù)在方法上逐步形成了從單色向多色-FISH的發(fā)展趨勢(shì),靈敏度和分辨率也有了大幅度的提高。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰熒光素(AFA)標(biāo)記探針建立了雙色FISH技術(shù)。1990年，Nederlof等提出用3種熒光素探測(cè)3種以上的靶位DNA序列,創(chuàng)建了多色FISH方法。Perry-O’keefe等[35]應(yīng)用4種PNA探針的M-FISH對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌進(jìn)行了檢測(cè)。第34頁(yè)/共69頁(yè)熒光原為雜交技術(shù)（FISH）的發(fā)展與應(yīng)用厭氧顆粒污泥是由多種具有互營(yíng)共生關(guān)系的厭氧微生物形成的復(fù)雜聚集體,由于其中微生物組成及其相互關(guān)系的復(fù)雜性、以及某些厭氧細(xì)菌(如產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌和產(chǎn)甲烷細(xì)菌)的生長(zhǎng)特異性等,使得對(duì)厭氧顆粒污泥的認(rèn)識(shí)至今仍未取得共識(shí)。FISH技術(shù)的出現(xiàn),可以在很大程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者利用此技術(shù)對(duì)厭氧顆粒進(jìn)行了研究。第35頁(yè)/共69頁(yè)第36頁(yè)/共69頁(yè)熒光原為雜交技術(shù)（FISH）的發(fā)展與應(yīng)用Harmsen等人利用EUB338,ARC915,MX825和MG1200等探針的不同組合,研究發(fā)現(xiàn)蔗糖為基質(zhì)的顆粒污泥分為三層:外層為真細(xì)菌,中間層為產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌與產(chǎn)甲烷絲菌的共生體,內(nèi)層存在著較大空洞,有少量產(chǎn)甲烷細(xì)菌和無(wú)機(jī)物;而以混合揮發(fā)酸為基質(zhì)的顆粒污泥只分為較明顯的兩層:外層是真細(xì)菌,內(nèi)層則以產(chǎn)甲烷絲菌為主。第37頁(yè)/共69頁(yè)熒光原為雜交技術(shù)（FISH）的發(fā)展與應(yīng)用Sekiguchi等人利用EUB338和ARC915探針確定了真細(xì)菌和古細(xì)菌在中溫和高溫厭氧顆粒污泥中的分布情況,然后利用MX825,MG1200,MB1174MS1414和D660等探針的不同組合對(duì)不同種類產(chǎn)甲烷細(xì)菌與真細(xì)菌的空間分布進(jìn)行研究。結(jié)果表明：中溫和高溫顆粒污泥具有相似的微生物分布結(jié)構(gòu),外層主要是真細(xì)菌,內(nèi)層主要是古細(xì)菌;顆粒中心均不能被染色,可能是無(wú)機(jī)物或死亡細(xì)菌;古細(xì)菌中以索氏產(chǎn)甲烷絲菌為主,在高溫顆粒污泥中還存在少量的產(chǎn)甲烷八疊球菌;真細(xì)菌則種類較多,主要有脫硫葉菌、互營(yíng)桿菌、和綠色非硫細(xì)菌等。

第38頁(yè)/共69頁(yè)熒光原為雜交技術(shù)（FISH）的發(fā)展與應(yīng)用Tagawa等人利用ARC915,MB1174和MT757等探針,采用計(jì)數(shù)法描述了顆粒污泥中古細(xì)菌、產(chǎn)甲烷絲菌和產(chǎn)甲烷八疊球菌的豐度。結(jié)果表明:古細(xì)菌是顆粒污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群,占細(xì)菌總數(shù)的28%-53%；古細(xì)菌中產(chǎn)甲烷絲菌和產(chǎn)甲烷八疊球菌是主要代表,分別占細(xì)菌總數(shù)的13%-38%和4%-27%。我國(guó)清華大學(xué)主要就污水處理中厭氧顆粒污泥進(jìn)行了分子生物學(xué)水平的研究

第39頁(yè)/共69頁(yè)變性梯度凝膠電泳（DGGE）

變性梯度凝膠電泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世紀(jì)80年代初期發(fā)明的，起初主要用來(lái)檢測(cè)DNA片段中的點(diǎn)突變。Muyzer等人在1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究。后來(lái)又發(fā)展出其衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。此后十年間，該技術(shù)被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一。第40頁(yè)/共69頁(yè)變性梯度凝膠電泳（DGGE）的原理雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長(zhǎng)度的DNA片段能夠被區(qū)分開，但同樣長(zhǎng)度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。DGGE/TGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來(lái)。一個(gè)特定的DNA片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomain,MD)和解鏈行為(meltingbehavior)。

第41頁(yè)/共69頁(yè)變性梯度凝膠電泳（DGGE）的應(yīng)用PCR-DGGE/TGGE技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的一個(gè)主要用途是分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成Muyzer等人于1993年首次將該技術(shù)用于研究微生物菌苔和生物膜系統(tǒng)的群落多樣性。此后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各微生物生態(tài)系統(tǒng)，包括土壤，活性污泥，人體和動(dòng)物腸道，溫泉，植物根系，海洋，淡水湖，油藏等。絕大部分研究都是通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌或古細(xì)菌的16SrRNA基因來(lái)研究各生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌或古細(xì)菌群落多樣性。我國(guó)哈爾濱工業(yè)大學(xué)用此項(xiàng)技術(shù)對(duì)生物產(chǎn)清發(fā)酵細(xì)菌的種群和群落演替進(jìn)行了研究。第42頁(yè)/共69頁(yè)6.4厭氧消化微生物分離與培養(yǎng)研究1950年，美國(guó)R.EHungate教授建立了厭氧技術(shù)，解決了產(chǎn)甲烷菌的分離培養(yǎng)技術(shù)問(wèn)題，為以后對(duì)甲烷菌的研究提供了條件。1967年，MPBryant采用改良的Hungate技術(shù)分離純化了奧式甲烷菌，證明它是產(chǎn)甲烷桿菌MOH菌株（Atethanobactervium）和“s”

有機(jī)體的共生體，近年來(lái)，許多學(xué)者運(yùn)用厭氧培養(yǎng)技術(shù)對(duì)一些產(chǎn)甲烷菌、產(chǎn)氫菌、產(chǎn)乙酸菌、高溫纖維素分解菌、丁酸菌等等進(jìn)行了分離和培養(yǎng)，使用的多為改良亨蓋特滾管技術(shù)。關(guān)于高效優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌群的培養(yǎng)、開發(fā)與應(yīng)用研究未見報(bào)道。

第43頁(yè)/共69頁(yè)6.5國(guó)內(nèi)外厭氧消化工程應(yīng)用于發(fā)展概況

厭氧產(chǎn)沼技術(shù)的應(yīng)用也已有100多年的歷史：

1896年，英國(guó)小城市Exeter建起了一座處理生活污水污泥的厭氧消化池，所產(chǎn)沼氣用作一條街道的照明燃料；1906年印度Matunga建造了利用人糞生產(chǎn)沼氣的沼氣池。隨著工藝的進(jìn)步與發(fā)展，厭氧消化被應(yīng)用于畜牧業(yè)和農(nóng)產(chǎn)品加工廢料的處理，并逐漸在高濃度有機(jī)廢水的處理上得到廣泛應(yīng)用，但將其應(yīng)用于固體廢物的處理，尤其是有機(jī)生活垃圾的處理，則只有十幾年的歷史。第44頁(yè)/共69頁(yè)6.5國(guó)內(nèi)外厭氧消化工程應(yīng)用于發(fā)展概況近十年來(lái)，有機(jī)垃圾厭氧消化系統(tǒng)在德國(guó)、瑞士、奧地利、芬蘭、瑞典等國(guó)家發(fā)展尤其迅速。我國(guó)的沼氣工程始建于1936年，最近二十多年才開始有較大發(fā)展，截至2000年，我國(guó)已建成了400-500個(gè)不同類型工藝處理工業(yè)廢水的沼氣工程。600多個(gè)處理畜禽廢水、廢渣的沼氣工程.隨著新農(nóng)村建設(shè)進(jìn)程的不斷推進(jìn)，沼氣工程技術(shù)正在逐步被大力推廣應(yīng)用。第45頁(yè)/共69頁(yè)6.5國(guó)內(nèi)外厭氧消化工程應(yīng)用于發(fā)展概況目前，我國(guó)在固廢垃圾處理行業(yè)中應(yīng)用厭氧產(chǎn)氣并回收利用則還處于起步階段。與國(guó)外相比，我國(guó)厭氧發(fā)酵技術(shù)還有很大差距。主要表現(xiàn)在：厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣率低；系統(tǒng)運(yùn)行和管理自動(dòng)化程度不高；與沼氣發(fā)酵和綜合利用配套的設(shè)備和技術(shù)不成熟；厭氧發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化、工業(yè)化發(fā)展進(jìn)程緩慢等多方面。不同的反應(yīng)器，不同的反應(yīng)底物，其微生物的種類、生長(zhǎng)規(guī)律、群落演替，菌群關(guān)系等還有待深入研究。第46頁(yè)/共69頁(yè)6.6發(fā)酵底物生物預(yù)處理研究根據(jù)現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，固體厭氧消化的速度較慢，特別是植物性原料，富含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，不易被微生物降解，因而影響沼氣轉(zhuǎn)化率，是很多厭氧消化過(guò)程中的限制性因素。一些研究和試驗(yàn)表明，對(duì)固體廢物采用物理法、化學(xué)法、生物法等預(yù)處理可以提高甲烷產(chǎn)氣量。目前對(duì)固態(tài)厭氧消化底物的物理和化學(xué)預(yù)處理方法研究較多，對(duì)生物預(yù)處理的研究則較少。

第47頁(yè)/共69頁(yè)6.6發(fā)酵底物生物預(yù)處理研究Peter等從高溫反應(yīng)器中分離到能分解有機(jī)固體廢物的嗜溫微生物,用該微生物對(duì)污水污泥進(jìn)行預(yù)處理,在1-2d內(nèi)近40%的有機(jī)物被分解,而且與沒(méi)有經(jīng)過(guò)該預(yù)處理相比，厭氧消化過(guò)程中沼氣產(chǎn)量提高50%；Ejlertsson研究表明，在消化開始階段進(jìn)行間歇曝氣能有效去除易降解的固廢，克服高濃度VFA帶來(lái)的抑制問(wèn)題。Mshandete等研究了紙漿厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中，啟動(dòng)階段進(jìn)行9h堆肥預(yù)處理后甲烷產(chǎn)量提高26%；Katsura和Hasegawa進(jìn)行了類似的預(yù)處理研究，對(duì)污泥進(jìn)行微好氧熱處理后甲烷產(chǎn)量提高50%。

第48頁(yè)/共69頁(yè)6.6發(fā)酵底物生物預(yù)處理研究堆肥處理是在有氧的條件下，借助好氧微生物(主要是好氧菌)的作用而進(jìn)行的。微生物在堆肥過(guò)程中起著十分重要的作用，而在堆肥過(guò)程中堆肥微生物的數(shù)量和種群不斷發(fā)生變化。變化過(guò)程通常表現(xiàn)為：細(xì)菌、真菌纖維素分解菌放線菌木質(zhì)素分解菌。。第49頁(yè)/共69頁(yè)6.6發(fā)酵底物生物預(yù)處理研究有機(jī)固體廢物中含有大量的木質(zhì)纖維素，其成分復(fù)雜，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，纖維素分子本身的結(jié)構(gòu)致密，由木質(zhì)素和半纖維素形成的保護(hù)層造成木質(zhì)纖維素不容易降解，因此，難以被充分利用或被大多數(shù)微生物直接作為碳源物質(zhì)而轉(zhuǎn)化利用。所以，木質(zhì)纖維素的生物降解成為生物技術(shù)處理有機(jī)固體廢物的關(guān)鍵，也是近年來(lái)研究的重點(diǎn)。應(yīng)用堆肥微生物的分解作用對(duì)纖維素、木質(zhì)素等大分子進(jìn)行講解預(yù)處理，可以提高其厭氧發(fā)酵的生物轉(zhuǎn)化率第50頁(yè)/共69頁(yè)二、預(yù)計(jì)需達(dá)到的要求、技術(shù)指標(biāo)，預(yù)計(jì)的技術(shù)關(guān)鍵、技術(shù)方案和主要試驗(yàn)研究情況。1研究?jī)?nèi)容2技術(shù)方案3技術(shù)關(guān)鍵4檢測(cè)指標(biāo)5預(yù)期研究成果第51頁(yè)/共69頁(yè)1研究?jī)?nèi)容（1）暗河式厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中各階段微生物代謝生化機(jī)理與微生物形態(tài)學(xué)研究（2）暗河式厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中各階段微生物群落分子生態(tài)學(xué)研究（3）厭氧發(fā)酵底物堆肥預(yù)處理對(duì)厭氧發(fā)酵的影響研究（4）高效產(chǎn)甲烷菌種的分離培養(yǎng)與篩選（5）暗河式厭氧發(fā)酵技術(shù)高效產(chǎn)氣工藝優(yōu)化與控制研究第52頁(yè)/共69頁(yè)2技術(shù)方案2.1實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定方法：（1）固含量的測(cè)定（TS）:常規(guī)（2）有機(jī)碳（TOC）值的測(cè)定：采用Aopplo9000測(cè)定儀測(cè)定。（3）氣體成分及含量的測(cè)定：氣相色譜（4）揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測(cè)定：NaOH滴定法測(cè)定。（5）氨氮的測(cè)定：鈉氏試劑分光光度法（6）COD的測(cè)定：COD的測(cè)定采用重鉻酸鉀法（7）酶活性測(cè)定：濾紙怦匱法測(cè)定纖維素酶活性；茚三酮比色法測(cè)定蛋白酶活性；（8）丙酮酸的測(cè)定：2，4-二硝基苯肼分光光度法（9）微生物檢測(cè)：光學(xué)顯微鏡和電子掃描顯微鏡第53頁(yè)/共69頁(yè)2技術(shù)方案2.2分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用FISH技術(shù)結(jié)合DGGE技術(shù)檢測(cè)暗河各個(gè)階段微生物群落結(jié)構(gòu)，探索各