植物基因工程

植物基因工程第1頁/共80頁

（1）從種類繁多的植物基因群體中分離出有用的基因。（2）尋找或者構(gòu)建植物克隆載體，使其與人們感興趣的外源基因重組并能被導(dǎo)入到植物細(xì)胞中去。（3）將重組的載體通過各種途徑導(dǎo)入植物受體細(xì)胞中去，并整合到植物寄主染色體的基因組上。

（4）使獲得帶有目的基因的植物細(xì)胞或者組織再生成形態(tài)上正常的健康的植株。這種植株稱為轉(zhuǎn)基因植物。（5）在理想的情況下，使這些轉(zhuǎn)基因植物通過有性過程，將外源目的基因持續(xù)地傳種接代下去。

一、植物基因工程的主要內(nèi)容和研究方向第2頁/共80頁根據(jù)目前的植物基因工程研究狀況，大致可把植物基因工程的研究方向亦即研究目的主要分為以下幾類：

①提高光合作用效率。②讓重要的經(jīng)濟(jì)作物轉(zhuǎn)變?yōu)楣痰参?。③增加種子的營養(yǎng)價(jià)值。④提高農(nóng)作物抗病蟲害及除草劑的能力。⑤增加植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。第3頁/共80頁

二、植物基因工程的受體細(xì)胞

從植物基因工程的表達(dá)角度考慮，植物基因工程可以說是由兩大部分組成：①受體系統(tǒng)；②載體系統(tǒng)。目前植物基因工程所用的受體系統(tǒng)大致可分為三類：①植物細(xì)胞②原生質(zhì)體③植物組織。第4頁/共80頁三、植物基因工程的載體系統(tǒng)

作為載體使用的必須是能進(jìn)入植物寄主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的核酸分子。目前發(fā)展起來的植物基因轉(zhuǎn)移的載體系統(tǒng)分為兩大類：一是病毒載體系統(tǒng)；二是質(zhì)粒載體系統(tǒng)。第5頁/共80頁1．植物基因轉(zhuǎn)移的病毒載體

植物病毒跟其它病毒一樣，離開植物細(xì)胞后表現(xiàn)出休眠狀態(tài)。一旦感染植物并進(jìn)入植物細(xì)胞，立即就依靠寄主進(jìn)行基因的復(fù)制和表達(dá)，合成出成熟的病毒。植物病毒感染效率高，將其作為載體既可以獲得較高的基因轉(zhuǎn)化效率，又可以使感染的外源基因隨著病毒基因組的復(fù)制而擴(kuò)增，因此植物病毒可以被發(fā)展成為很有價(jià)值的克隆載體。

目前正在研究并發(fā)展作為植物基因克隆載體的病毒有三種不同的類型，即單鏈RNA植物病毒、單鏈DNA植物病毒和雙鏈DNA植物病毒。第6頁/共80頁第7頁/共80頁目前已經(jīng)建立的CaMVDNA克隆載體主要有三類：（1）由有缺陷的CaMVDNA病毒分子與另一個(gè)輔助性的病毒分子組成一個(gè)互補(bǔ)的載體系統(tǒng)。輔助性的病毒分子給缺陷性的CaMVDNA病毒分子提供所缺乏的功能。這兩種分子單獨(dú)都不表現(xiàn)出活性。（2）將CaMVDNA整合到Ti質(zhì)粒DNA分子上，組成重組的載體。

（3）構(gòu)成帶有CaMV35S啟動子的融合基因，在植物細(xì)胞中表達(dá)外源基因。CaMV35S啟動子是一種強(qiáng)啟動子。目前已經(jīng)有許多分子生物學(xué)家都熱衷于使用CaMV35S啟動子在植物細(xì)胞中表達(dá)外源目的基因。第8頁/共80頁第9頁/共80頁2．植物基因轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒載體

植物基因轉(zhuǎn)移所用的質(zhì)粒載體是在兩種特殊的植物細(xì)菌質(zhì)粒的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。這兩種質(zhì)粒是Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)，Ri質(zhì)粒在發(fā)根農(nóng)桿菌內(nèi)。

第10頁/共80頁第11頁/共80頁

發(fā)根農(nóng)桿菌是另一種植物細(xì)菌，它可以在植物感染部位誘導(dǎo)另一種腫瘤的發(fā)生，使植物的感染部位產(chǎn)生許多根狀的結(jié)構(gòu)，就象長出了許多根，故叫做發(fā)狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌內(nèi)也含有一種大質(zhì)粒，被命名為根誘導(dǎo)質(zhì)粒，簡稱為Ri質(zhì)粒。發(fā)狀根的形成就是由Ri質(zhì)粒引起的。第12頁/共80頁第13頁/共80頁Ti質(zhì)粒第14頁/共80頁

Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒在結(jié)構(gòu)上和功能上有許多相似的地方。Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒均屬于大質(zhì)粒，大小約為200—800kb。兩者都含有能夠控制腫瘤發(fā)生的兩種基因片段。這兩個(gè)基因區(qū)域分別是T-DNA區(qū)段和毒性（Vir）區(qū)段。（1）T-DNA區(qū)(12-24kb)

T-DNA區(qū)段的兩端均有相似的25bp的特殊序列。TL

GGCACGATATATTCAATTGTAAATTR

GGCACGATATATCGAGGTGTAAAAT-DNA上編碼基因主要有兩類：第一類為編碼冠癭堿合成酶及分解代謝基因，另一類為誘發(fā)腫瘤的基因。冠癭堿合成酶的基因具有真核生物的轉(zhuǎn)錄信號，T-DNA整合到植物基因組后，他們能夠在植物體內(nèi)表達(dá)。合成冠癭堿，植物不能利用，農(nóng)桿菌卻能利用。第15頁/共80頁腫瘤誘發(fā)基因主要有生長素基因和細(xì)胞分裂素基因。在T-DNA轉(zhuǎn)移過程中，只有兩個(gè)端界與其轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與其中所攜帶的基因無關(guān)。在腫瘤形成期間，整個(gè)的T-DNA區(qū)段從Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒上轉(zhuǎn)移到植物的染色體DNA上，使植物產(chǎn)生腫瘤，腫瘤的各種行為均受T-DNA區(qū)段的基因控制。第16頁/共80頁第17頁/共80頁第18頁/共80頁（2）毒性（Vir）區(qū)段(30-40kb)

毒性（Vir）區(qū)段則編碼能在細(xì)菌中表達(dá)的數(shù)個(gè)致瘤基因，表達(dá)的產(chǎn)物參與T-DNA的加工和T-DNA從細(xì)菌向植物的轉(zhuǎn)移過程。T-DNA區(qū)段和毒性（Vir）區(qū)段在質(zhì)粒上的位置是彼此相鄰的。其它結(jié)構(gòu)部分的基因能夠決定植物合成一種特殊的小分子物質(zhì)——冠癭堿，還能夠誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒在不同的細(xì)菌之間的結(jié)合轉(zhuǎn)移等。Vir區(qū)共有6個(gè)基因操縱元，各帶有不等的編碼區(qū)。第19頁/共80頁VirA:組成型表達(dá)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，是一種信號分子；VirB:調(diào)控表達(dá)，膜結(jié)合蛋白，由多個(gè)亞基可能組成細(xì)胞膜上的通道；VirG:低水平組成型表達(dá)，被VirA磷酸化后作為轉(zhuǎn)錄因子，啟動Vir基因包括自身的表達(dá)；VirC:結(jié)合于右端界相鄰的區(qū)域（Overdrive序列），缺乏VirC和Overdrive序列時(shí)轉(zhuǎn)移效率下降，可能幫助VirD1、D2發(fā)揮作用。VirD:VirD1和VirD2在25bp的端界序列起作用，產(chǎn)生缺口和形成單鏈DNA。VirD3和VirD4功能未知；VirE:單連結(jié)合蛋白，保護(hù)單鏈T-DNA的轉(zhuǎn)移；第20頁/共80頁第21頁/共80頁

農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程示意圖第22頁/共80頁第23頁/共80頁第24頁/共80頁（3）T-DNA的轉(zhuǎn)移T-DNA的轉(zhuǎn)移與T-DNA上僅僅左右25bp的端界序列有關(guān)，與T-DNA上攜帶的基因無關(guān)，只有根癌農(nóng)桿菌中有Vir基因表達(dá)的蛋白，將外源基因克隆在25bp的端界序列間，外源基因就可以轉(zhuǎn)到植物基因組中。第25頁/共80頁根據(jù)基因克隆載體構(gòu)建的一般原則，通過引入克隆位點(diǎn)，引入選擇標(biāo)記以及去掉不必要的區(qū)段，現(xiàn)已將Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒發(fā)展為植物基因工程中用途廣泛的質(zhì)粒載體系統(tǒng)，并構(gòu)建了一系列的Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒的派生載體。

Ti質(zhì)粒的派生載體，典型的是采用一元載體系統(tǒng)和二元載體系統(tǒng)。

第26頁/共80頁一類是一元載體系統(tǒng)（整合載體系統(tǒng)），一類載體系統(tǒng)由一個(gè)共整合系統(tǒng)中間表達(dá)載體與受體卸甲Ti質(zhì)粒載體組成。中間表達(dá)載體是一種穿梭質(zhì)粒。同時(shí)與大腸桿菌質(zhì)粒pBR322結(jié)合起來組成既可以在大腸桿菌中復(fù)制又能在根癌農(nóng)桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒。卸甲（disarmed）載體：是指刪除了T-DNA上的ONC基因和冠癭堿合成酶等序列，而使之失去了侵染能力的Ti質(zhì)粒。

第27頁/共80頁第28頁/共80頁第29頁/共80頁

另一類轉(zhuǎn)化體系是雙元載體系統(tǒng)，由兩個(gè)分別含T-DNA和Vir區(qū)的兼容性突變質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)稱為雙元載體系統(tǒng)。二元載體系統(tǒng)是使用無毒的（disarmed）Ti質(zhì)粒為載體。這種Ti質(zhì)粒去掉了T-DNA區(qū)段中產(chǎn)生生長激素及生物堿的相關(guān)基因。因T-DNA核心基因的致瘤能力已經(jīng)被缺失掉，所以進(jìn)入植物細(xì)胞后，可以保證植物細(xì)胞能夠正常分化，即能長出正常的植株來。它由兩個(gè)分別含有T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒即：微型Ti質(zhì)粒（mini-Tiplasmid）和輔助Ti質(zhì)粒（helperTiplasmid）構(gòu)成，T-DNA和Vir基因在兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒上，通過反式激活T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞基因組內(nèi)。第30頁/共80頁第31頁/共80頁

由于克隆質(zhì)粒既可以在大腸桿菌中復(fù)制又可以在根癌農(nóng)桿菌中復(fù)制，可以很方便進(jìn)行基因的克隆。

例如pBI121可以在大腸桿菌中大量擴(kuò)增后，按質(zhì)粒分離的方法進(jìn)行分離和克隆操作。經(jīng)對重組子的篩選分析，重組基因的質(zhì)粒在大腸桿菌中制備出來，而后轉(zhuǎn)入帶有輔助質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌，如LBA4404（pAL4404），再以根癌農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，外源基因?qū)⒃趐AL4404

的Vir基因的幫助下，隨著T-DNA從載體上轉(zhuǎn)移到植物染色體。根據(jù)載體提供的選擇記號的表型特征，就可選擇出被外源基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。

第32頁/共80頁第33頁/共80頁第34頁/共80頁第35頁/共80頁（4）工程化Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌

a.直接轉(zhuǎn)化從大腸桿菌中分離重組的質(zhì)粒，以質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。對數(shù)生長期的根癌農(nóng)桿菌離心收集后以CaCl2懸浮，置液氮中冷凍5min，加入1μg的質(zhì)粒DNA，再凍5min，迅速37攝氏度熔化，促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞。b.三親交配法利用細(xì)菌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移特性進(jìn)行三親交配的轉(zhuǎn)移

三親交配由含微型Ti質(zhì)粒的E．Coli、含有助動質(zhì)粒pRK2013的E.Coli和含有輔助Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌組成。三細(xì)菌混合后產(chǎn)生菌間的接合轉(zhuǎn)導(dǎo)。pRK2013可移入農(nóng)桿菌，但由于不能自主復(fù)制而被丟失，其進(jìn)入含有微型Ti質(zhì)粒的E．Coli后，可促進(jìn)微型Ti質(zhì)粒一起或分別轉(zhuǎn)移入農(nóng)桿菌中。第36頁/共80頁第37頁/共80頁第38頁/共80頁第39頁/共80頁四、植物基因工程中常用的選擇標(biāo)記和報(bào)告基因第40頁/共80頁1.標(biāo)記基因：潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因雙氫葉酸脫氫酶基因(DHFR)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（簡稱為NPTⅡ基因）2.報(bào)告基因：GUS基因熒光素酶基因（luciferase,LUC）第41頁/共80頁

1．選擇標(biāo)記

選擇標(biāo)記，必須符合兩點(diǎn)要求：①選擇標(biāo)記最好能夠抑制非轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的正常生長，但并不殺死細(xì)胞；②選擇標(biāo)記最好有一種簡便的方法可以檢測其在轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株中的表達(dá)。（1）新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（簡稱為NPTⅡ基因）NPTⅡ基因是植物基因工程中運(yùn)用很廣泛的選擇標(biāo)記基因。它編碼的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因使抗生素被磷酸化而失活。因此NPTⅡ基因的表達(dá)可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞對氨基葡萄糖苷類的抗生素如卡那霉素、慶大霉素和G418等產(chǎn)生抗性。第42頁/共80頁（2）雙氫葉酸脫氫酶基因(DHFR)

雙氫葉酸脫氫酶基因與CaMV35S啟動子拼接后轉(zhuǎn)入植物，可使矮牽牛、煙草、油菜等多種植物對氨甲喋呤產(chǎn)生抗性。氨甲喋呤對植物具有很強(qiáng)的毒性。（3）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建成能在植物細(xì)胞中表達(dá)的嵌合基因后，導(dǎo)入植物，可使植物對潮霉素具有抗性。潮霉素B是對大多數(shù)植物有毒性的抗生素。（4）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（簡稱為Cat基因）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（Cat基因）編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。這種酶能催化氯霉素形成3-乙酰氯霉素、1-乙酰氯霉素和1，3-二乙酰氯霉素，使氯霉素失活。所以將Cat基因構(gòu)成可在植物中表達(dá)的嵌合基因，然后導(dǎo)入植物，可使通過放射性乙?；鶎β让顾匾阴；?，定量檢測轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。第43頁/共80頁2．報(bào)告基因

許多抗生素抗性基因都可以作為報(bào)告基因。除此以外，常用的報(bào)告基因還有：

第44頁/共80頁（1）GUS基因GUS基因的全名是β-葡萄糖苷酸酶基因。這是目前應(yīng)用最廣的報(bào)告基因之一。GUS基因產(chǎn)物是β-葡萄糖苷酸酶，它可以將5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Glu）分解為藍(lán)色的物質(zhì)，也可以將4-甲基-傘形花酮-β-D-葡萄糖苷酸酯（4-MUG）分解為4-甲基-傘形花酮（4-MU），4-MU可以在365nm的光下激發(fā)產(chǎn)生熒光。因此通過組織化學(xué)染色定位，可觀察到組織器官中GUS基因的活性；或通過熒光分光光度計(jì)定量測定GUS基因的活性。

第45頁/共80頁第46頁/共80頁（2）熒光素酶基因（luciferase,LUC）

熒光素酶在Mg2+和ATP存在的條件下可以氧化熒光素，并產(chǎn)生熒光?？梢酝ㄟ^熒光計(jì)測定，也可以在暗處直接觀察。目前用作報(bào)告基因的熒光素酶基因多來自于細(xì)菌或螢火蟲。（3）冠癭堿合成酶基因冠癭堿合成酶基因是Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒上的一個(gè)基因，位于T-DNA區(qū)段。它編碼與冠癭堿（包括章魚堿，胭脂堿，農(nóng)桿堿）合成有關(guān)的酶。由于大多數(shù)植物中并不存在這一類酶，故轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中出現(xiàn)冠癭堿就意味著外源基因已經(jīng)進(jìn)入了，用菲醌做熒光染料可以進(jìn)行檢測。（4）綠色熒光蛋白基因水母中分離的綠色熒光蛋白基因（GFP）是當(dāng)前在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常用的標(biāo)記基因。該蛋白可以在紫外激發(fā)下發(fā)出綠色的熒光。既可以方便進(jìn)行定性檢測，也可以進(jìn)行定量分析。第47頁/共80頁第48頁/共80頁第49頁/共80頁五.啟動子及終止子

植物基因工程常用的啟動子包括組成型表達(dá)啟動子和誘導(dǎo)型表達(dá)啟動子。來自于植物病毒CaMV35S啟動子是一種組成型高效表達(dá)的啟動子，在植物基因工程中最常采用。pNos啟動子是T-DNA上編碼胭脂堿合成酶基因的啟動子，也是一種組成型高效表達(dá)啟動子，其表達(dá)活性比35S稍低。CaMV19S啟動子Wax啟動子誘導(dǎo)型啟動子：MT-II啟動子

rd29A啟動子

終止子：tNOS；t35S；t16S

第50頁/共80頁六、外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞

外源基因?qū)氲街参锏闹饕康氖琴x予植物新的產(chǎn)物或性狀，使之成為新品種，其次是為了研究基因表達(dá)或用于基因作圖和基因克隆。其中第一點(diǎn)對我們來說尤為重要。

外源基因?qū)氲街参镉腥齻€(gè)關(guān)鍵因素是必需考慮的。首先要有適宜的基因（包括目的基因、選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因）和合適的選擇條件；其次是組織培養(yǎng)體系，要求植物細(xì)胞必需有效的再生成株，頻率高，周期短；第三是外源基因?qū)氲街参锏耐緩胶头椒ǎ髶p失小、頻率高且外源基因能穩(wěn)定的整合到基因組，并且具有正常的時(shí)空表達(dá)能力。

第51頁/共80頁第52頁/共80頁1．農(nóng)桿菌參與的植物轉(zhuǎn)化法

目的基因通過這種方法進(jìn)入植物細(xì)胞要分幾個(gè)步驟走。

第一，將目的基因重組到適當(dāng)?shù)腡i質(zhì)粒載體或Ri質(zhì)粒載體或其它類型的載體上。根據(jù)所選用的載體系統(tǒng)進(jìn)行重組。重組方法就是基因工程中常用的一些基本方法。

第二，目的基因隨載體進(jìn)入農(nóng)桿菌（即轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌）。1)直接轉(zhuǎn)化法2）三親交配法。第53頁/共80頁第三，目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，即植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。根癌農(nóng)桿菌獲得了外源目的基因后，接下來的工作就是要轉(zhuǎn)化給植物細(xì)胞。目前常用的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的方法主要有三種：（1）創(chuàng)傷植株感染法（又叫做整株感染）創(chuàng)傷植株感染法是指把新培養(yǎng)的根癌農(nóng)桿菌接種在植株的新鮮傷口部位，或把其注射到植物體內(nèi)，再將感染部位的薄壁組織切下來訪如選擇培養(yǎng)基上篩選，最后再轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織再生成完整的植株。這種方法又叫做體內(nèi)轉(zhuǎn)化法。

（2）原生質(zhì)體和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞共培養(yǎng)法是指將毒性的農(nóng)桿菌與正處于再生壁時(shí)期的原生質(zhì)體一起培養(yǎng)，以促使植物細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。然后將處理的原生質(zhì)體培養(yǎng)成愈傷組織，在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織，最后再生成轉(zhuǎn)基因植株。第54頁/共80頁第55頁/共80頁（3）葉盤法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞先將實(shí)驗(yàn)植物的葉片進(jìn)行表面消毒，用經(jīng)過消毒的無菌不銹鋼打孔器從葉片上取下圓形葉片，即葉盤。然后接種上含有帶外源基因的重組Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌，置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)2—3天，再轉(zhuǎn)移到含有抗生素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，將篩選出的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株。葉盤法轉(zhuǎn)化適用性很廣，操作簡單方便，獲得轉(zhuǎn)基因植株的周期短而且重復(fù)性很好，能滿足大工作量的要求，是一種很受歡迎的方法。2．其他轉(zhuǎn)化方法

可分為化學(xué)的和物理的方法兩大類。

第56頁/共80頁第57頁/共80頁（1）化學(xué)法化學(xué)轉(zhuǎn)化法是用特殊的化學(xué)藥品處理細(xì)胞，促使原生質(zhì)體攝取DNA。植物細(xì)胞的原生質(zhì)體經(jīng)過化學(xué)試劑（聚乙二醇PEG、聚-L-鳥苷酸、磷酸鈣及氯化鈣等）處理，便能夠捕獲外源DNA。在用過的化學(xué)轉(zhuǎn)化法中，最常用的是聚乙二醇法（簡稱為PEG法）。PEG法主要是將原生質(zhì)體懸浮于含有DNA的介質(zhì)中，用PEG促使原生質(zhì)體吸收DNA。PEG是一種高分子的多聚物，粘性較強(qiáng)，能維持DNA附著在原生質(zhì)體表面上的時(shí)間。

（2）物理法物理轉(zhuǎn)化方法的原理是基于許多物理因素可以影響細(xì)胞膜，有利于外源DNA分子進(jìn)入細(xì)胞，或者是造成細(xì)胞膜的機(jī)械損傷，促使外源DNA直接進(jìn)入細(xì)胞。常用的物理轉(zhuǎn)化法有：第58頁/共80頁

1）電穿孔法

電穿孔法的基本原理是在高壓電脈沖作用下使新分離的原生質(zhì)體的質(zhì)膜上形成可逆性的瞬間通道，從而使外源DNA順利進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi)。這有兩種不同的處理方式，一種是采用較低的電壓處理原生質(zhì)體較長的時(shí)間，另外一種是采用高電壓處理很短的時(shí)間。為了提高轉(zhuǎn)化效率，通常把電穿孔法和PEG法兩者結(jié)合起來。電穿孔法簡單方便，對細(xì)胞毒性低，轉(zhuǎn)化效率高。缺點(diǎn)是容易造成原生質(zhì)體有較大的損傷，使植物再生率降低，要有較昂貴的專門儀器。提供500-1200V1ms-5s的脈沖。將植物細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性的穿孔。第59頁/共80頁第60頁/共80頁第61頁/共80頁2）直接注射法（又叫微注射法）

用此法進(jìn)行基因?qū)霑r(shí)，通常先將原生質(zhì)體或培養(yǎng)的細(xì)胞固定在瓊脂或低熔點(diǎn)的瓊脂糖中，或者用聚賴氨酸處理原生質(zhì)體使之附著在玻璃平板上，也可以通過一固定的毛細(xì)管將原生質(zhì)體吸著在管口，然后在顯微鏡下，將外源基因直接注射到細(xì)胞中去。采用該法已在煙草、油菜、苜蓿原生質(zhì)體上獲得了成功。顯為注射裝置由顯微鏡、顯微操作儀和微注射儀組成。顯微操作儀提供玻璃毛細(xì)管精確的位移，顯微注射儀可以將pl的液體注入細(xì)胞。第62頁/共80頁第63頁/共80頁第64頁/共80頁3）基因槍法（又叫微射轟擊法）

這是由桑弗德（1987年）建立的，基本原理是將DNA包裹于微小的金屬鎢或金顆粒表面，在高壓下使金屬顆粒噴射，高速穿透受體細(xì)胞或組織，使外源基因進(jìn)入細(xì)胞的核中進(jìn)行整合并表達(dá)。該法已使煙草、大豆、棉花、玉米等多種植物細(xì)胞得到轉(zhuǎn)化，缺點(diǎn)是儀器昂貴。第65頁/共80頁第66頁/共80頁第67頁/共80頁第68頁/