細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞分離與純化和細(xì)胞系細(xì)胞克隆

細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞分離與純化和細(xì)胞系細(xì)胞克隆第1頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二我的細(xì)胞培養(yǎng)計劃（手寫和打印均可）注意事項：1、作業(yè)上交時間及地點：時間：校歷第13周（2011.11.25）前地點：104館三樓（組胚教研室）本課程的作業(yè)及考核依據(jù)之一2、作業(yè)必須標(biāo)明的項目：題目學(xué)號

姓名專業(yè)導(dǎo)師

……………………………第2頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二課程安排及進(jìn)度第3頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)薛慶善主編廣西醫(yī)科大學(xué)組胚教研室何少健電話0771-5358577(辦)第4頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程三、體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)四、細(xì)胞分離與純化五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆六、培養(yǎng)物的觀察檢測方法第5頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二四、細(xì)胞分離與純化從有機體組織分離得到的細(xì)胞懸液以及從動物體液獲得的細(xì)胞一般都包含多種細(xì)胞成分，為異質(zhì)性的混合物。而進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)的目的，不外乎研究特定細(xì)胞的特性、功能或其它特殊用途，故一般必須獲取分離開的和盡可能均一的細(xì)胞群體。在進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)時，不僅要將擬培養(yǎng)組織材料制備成分離（離散）的細(xì)胞（dissociatedcell），以細(xì)胞懸液的形式接種并培養(yǎng)，更重要的是從所制備的細(xì)胞懸液中分離(separationorisolation)出成分盡可能單一的細(xì)胞用于培養(yǎng)。第6頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞分離（cellseparation)指的是將組織材料分散制成細(xì)胞懸液后，從中獲取目的細(xì)胞的過程。（細(xì)胞分離是針對于細(xì)胞成分而言，而不針對生物化學(xué)成分）。細(xì)胞純化（cellpurification)強調(diào)從原代培養(yǎng)前、成分混雜的異質(zhì)性細(xì)胞懸液中或者從培養(yǎng)物中獲得單一類型細(xì)胞的過程。通過細(xì)胞分離和純化過程，使得培養(yǎng)物成為單一型培養(yǎng)物，甚至是遺傳特性完全一致的培養(yǎng)物，后者即細(xì)胞系（cellline）或細(xì)胞株。四、細(xì)胞分離與純化第7頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二分離和純化兩概念之間沒有截然的界限。許多情況下，細(xì)胞分離和純化并不是完全徹底的，培養(yǎng)物中只能達(dá)到以某種細(xì)胞為主（占絕大多數(shù)）的程度，所以也常稱為富集（enrichment）。分離和純化細(xì)胞的過程不僅僅是在原代培養(yǎng)之前進(jìn)行，有時候，分離和純化細(xì)胞的過程還貫穿在原代與繼代培養(yǎng)的過程之中，甚至主要依靠培養(yǎng)過程實現(xiàn)分離與純化細(xì)胞的目的。培養(yǎng)物中細(xì)胞成分是否單一或者目的細(xì)胞在培養(yǎng)物中的比例如何，常常是衡量某一培養(yǎng)工作是否成功的重要指標(biāo)。四、細(xì)胞分離與純化第8頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二根據(jù)所要分離純化的對象和目的不同，可以采用不同的細(xì)胞分離純化方法，從簡單的手工操作技術(shù)到使用自動控制的特別是電腦控制的尖端儀器。從成分混雜的細(xì)胞懸液中將不同的細(xì)胞區(qū)分開來達(dá)到分離純化，主要是根據(jù)不同的細(xì)胞所具有的各種各樣特性而實現(xiàn)的，或者是利用細(xì)胞的物理特性如密度、體積、電荷等，或者是利用細(xì)胞的生物學(xué)特性如特異性表面標(biāo)志和功能。四、細(xì)胞分離與純化第9頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二1.解離（散）組織制備細(xì)胞懸液過程中的細(xì)胞分離2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法3.根據(jù)細(xì)胞表面電荷的細(xì)胞分離方法4.基于不同黏附特性的細(xì)胞分離方法5.利用細(xì)胞表面標(biāo)志分離純化細(xì)胞的方法6.利用其它細(xì)胞學(xué)特性分離純化細(xì)胞的方法四、細(xì)胞分離與純化第10頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二1.解離（散）組織制備細(xì)胞懸液過程中的細(xì)胞分離將用于體外細(xì)胞培養(yǎng)的動物組織材料制備成細(xì)胞懸液，然后接種并培養(yǎng)，是原代培養(yǎng)的最常規(guī)方法。由于從體內(nèi)切取的大多數(shù)組織（少數(shù)結(jié)締組織如血液、骨髓、淋巴等除外），均是由細(xì)胞和少量的細(xì)胞間質(zhì)（后者內(nèi)一般含有纖維成分）緊密結(jié)合而成的實體組織。如果直接將所取的組織塊用來培養(yǎng)（此即為植塊培養(yǎng)），在培養(yǎng)的組織塊大于1mm3時，培養(yǎng)過程中只有位于植塊周邊的細(xì)胞容易獲得營養(yǎng)而存活和生長發(fā)育。第11頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二1.解離（散）組織制備細(xì)胞懸液過程中的細(xì)胞分離由于受組織內(nèi)部的纖維成分的束縛，能夠從植塊內(nèi)部遷移出來的細(xì)胞很少。大部分位于植塊內(nèi)部的細(xì)胞會因營養(yǎng)物質(zhì)和氣體滲透困難而缺乏營養(yǎng)和O2供應(yīng)，以致生長發(fā)育不良或者死亡，這也是植塊培養(yǎng)法難以進(jìn)行長期體外培養(yǎng)的主要原因。第12頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二為了獲得大量細(xì)胞培養(yǎng)物，必須將組織解離，將組織塊內(nèi)部細(xì)胞與細(xì)胞之間的“組織關(guān)系”解除，將細(xì)胞“解放”，使之成為分離（離散）的細(xì)胞，這個過程即為細(xì)胞分離（離散）或分散（celldissociation)。細(xì)胞分離（離散）或分散并不等于細(xì)胞純化，但是，細(xì)胞分散是細(xì)胞純化的前提。目前所建立的體外分離和純化細(xì)胞的方法，絕大多數(shù)是從細(xì)胞懸液中進(jìn)行分離和純化的。將所切取的組織制備成細(xì)胞懸液，是細(xì)胞分離和純化的基礎(chǔ)。1.解離（散）組織制備細(xì)胞懸液過程中的細(xì)胞分離第13頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二如何通過不同的機械分離與酶學(xué)解離方法實現(xiàn)對目的細(xì)胞一定程度的分離純化呢？一方面，可根據(jù)所取組織的細(xì)胞構(gòu)成，尤其是細(xì)胞的大小不同進(jìn)行分離純化；另一方面，根據(jù)不同組織的細(xì)胞間質(zhì)特性不同而實現(xiàn)。在每一次培養(yǎng)接種時，應(yīng)盡量先以各種方法使得細(xì)胞懸液中目的細(xì)胞之比例提高。為實現(xiàn)此目的，可從下列步驟的進(jìn)行中最大限度地獲得目的細(xì)胞。1.解離（散）組織制備細(xì)胞懸液過程中的細(xì)胞分離第14頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二（1）取材取材是整個體外培養(yǎng)過程的開始。準(zhǔn)確的取材是獲得某一特定培養(yǎng)對象的關(guān)鍵。在切取動物組織塊時，要盡量剔除所附帶的其它組織和殘余結(jié)構(gòu)。（2）機械分離過程在機械分離所取組織的過程中，能夠進(jìn)行初步的細(xì)胞分離純化的手段之一，就是按照組織內(nèi)不同細(xì)胞的大小差異，以一定孔徑的不銹鋼或尼龍篩網(wǎng)過濾細(xì)胞。1)網(wǎng)搓法：2）細(xì)胞懸液過濾：

1.解離（散）組織制備細(xì)胞懸液過程中的細(xì)胞分離第15頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二（3）用酶學(xué)方法分離純化用酶學(xué)方法達(dá)到部分分離純化的主要依據(jù)是：不同組織的細(xì)胞和間質(zhì)的構(gòu)成不同。例如，上皮組織的細(xì)胞間質(zhì)少，間質(zhì)內(nèi)的纖維成分少，最有效的蛋白酶是胰蛋白酶。而結(jié)締組織、肌肉組織的細(xì)胞間質(zhì)中纖維成分較多。要消化結(jié)締組織、肌肉組織中的間質(zhì)成分，需要使用膠原酶和其它酶，胰蛋白酶的消化作用不明顯。

（4）培養(yǎng)過程中的選擇性分離在體外分散細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物本身有一種自然純化的特性。1)機械刮除法：2）選擇性酶消化法：1.解離（散）組織制備細(xì)胞懸液過程中的細(xì)胞分離第16頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法細(xì)胞可視為一種完整的顆粒并且表現(xiàn)出與此有關(guān)的物理性狀。不同類型細(xì)胞的物理性狀可能互不相同，這些差異正是部分或完全地分離純化細(xì)胞的依據(jù)之一。基于物理性狀的細(xì)胞分離純化技術(shù)，由于無需對細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)處理，也不像多數(shù)生物學(xué)方法那樣需要抗原—抗體、受體—配體相互作用，故可避免細(xì)胞發(fā)生變化，因而這類技術(shù)具有其自身的優(yōu)越性。細(xì)胞分離純化中最常利用的物理性狀是細(xì)胞的體積（大?。⒚芏群捅砻骐姾?。第17頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的技術(shù)均基于沉降作用。不同類型細(xì)胞往往具有不同的體積和密度，可以采用沉降技術(shù)將其分離開來。其基本原理是，懸液中細(xì)胞的沉降率與細(xì)胞體積、細(xì)胞密度和其周圍介質(zhì)密度之差成正比。應(yīng)用沉降技術(shù)，使之沉降的細(xì)胞的密度應(yīng)該比介質(zhì)大，而使之漂浮的細(xì)胞的密度則應(yīng)比介質(zhì)小。因此，實施沉降技術(shù)分離純化細(xì)胞的關(guān)鍵在于選擇密度梯度形成介質(zhì)，故沉降技術(shù)也稱為密度梯度（離心）技術(shù)。2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法第18頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二選擇密度梯度形成介質(zhì)的一般原則是：①所形成溶液的密度應(yīng)包括所需要的密度范圍；②形成的溶液黏度較低；③具有某些性質(zhì)如折射率，據(jù)此可測定它的濃度（或密度）；④不損傷細(xì)胞或不改變細(xì)胞的生物學(xué)特性；⑤離心分離后易于除去；⑥不妨礙分離組分的分析。按照上述原則來選擇，分離細(xì)胞常用的密度梯度形成介質(zhì)有：（1）牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA)（2）聚蔗糖（polysucrose）（3）泛影酸鹽（Diatrizoate）（4）硅膠顆粒2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法第19頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二（1）牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA)由于BSA是血清蛋白，它對細(xì)胞活性的影響很小，是早期應(yīng)用連續(xù)或不連續(xù)密度梯度分離細(xì)胞的最常用介質(zhì)，但BSA黏度很高，分離細(xì)胞必須長時間離心，且用量大，費用高，故現(xiàn)在已經(jīng)部分被其它分離介質(zhì)取代。（2）聚蔗糖（poly-sucrose）是一種合成的蔗糖聚合物，商品名叫Ficoll,常用的是：Mr400000Pa,名為Ficoll400。Ficoll不滲入生物膜，滲透壓也很小，不影響細(xì)胞活性和酶活性，但其滲透毒性有隨濃度成指數(shù)增加的趨勢，且高濃度Ficoll溶液的黏度大，可導(dǎo)致細(xì)胞凝集，故常以低濃度Ficoll和其它物質(zhì)如泛影酸鹽合用以增加溶液的密度。Ficoll400是目前常用的細(xì)胞分離介質(zhì)之一，商品含量為40％（w／V），也可用Ficoll干粉來配制。2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法第20頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法（3）泛影酸鹽泛影酸鹽離子強度低，可配制成高密度而低滲透毒性的溶液，而且黏度比Ficoll小，很適合密度梯度分離細(xì)胞，常與Ficoll配合使用。國外常用商品Isopaque或稱Triasil(sodiummetrizoate)和Hypaque(sodiumdiatrizoate），與Ficoll配制的溶液商品名為Ficoll-Isopaque(Triosil)或Ficoll-Hypaque，泛影酸鹽價格較貴。國內(nèi)常用造影劑泛影葡胺（megluminidiatrizoici）代替，其商品名為Urografin,含量通常為60%或75%,其與Ficoll配制的溶液商品名是淋巴細(xì)胞分離液（上海試劑二廠），密度1.077士0.001，主要用于人單個核細(xì)胞的分離。第21頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法（4）硅膠顆粒用聚乙烯毗咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP)包被硅膠顆粒，商品名為Percoll。Percoll具有以下優(yōu)點：①穩(wěn)定性很好，可長期保存；②密度稀釋范圍較大，可包括大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的密度；③在溶液內(nèi)產(chǎn)生的滲透壓很小，故在全部密度范圍內(nèi)能保持等張；④黏度低，即使在最大密度時也是如此，因此用較小的離心力和較短的時間就可達(dá)良好的分離效果；⑤對細(xì)胞無毒性，且易于從細(xì)胞制劑中洗滌除去；⑥在高速離心（≥10，000r/min)時，可形成連續(xù)密度梯度；⑦價廉，分離細(xì)胞時用量少。因此，Percoll是一種很優(yōu)良的分離介質(zhì)，是現(xiàn)在用于分離多種哺乳動物細(xì)胞的最常用介質(zhì)之一。商品Percoll的密度一般為（1.13士0.005）第22頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法不同細(xì)胞的分離方法：A.一步密度梯度離心法B.等密度梯度離心法C.速度沉降法D.離心淘析分離技術(shù)血細(xì)胞的分離玫瑰花環(huán)細(xì)胞的分離連續(xù)BSA密度梯度離心法非連續(xù)BSA密度梯度離心法連續(xù)Percoll密度梯度離心法非連續(xù)Percoll密度梯度離心法低速離心速度沉降法單位重力沉降法簡單重力沉降法分離白細(xì)胞與紅細(xì)胞簡單重力沉降法分離粒細(xì)胞第23頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法A.一步密度梯度離心法：一步密度梯度離心法分離細(xì)胞的依據(jù)是細(xì)胞的密度和體積。將細(xì)胞懸液加于一種高密度介質(zhì)上，應(yīng)用低速離心，密度大于介質(zhì)的細(xì)胞通過介質(zhì)而沉淀于管底，而密度低于介質(zhì)的細(xì)胞則滯留于介質(zhì)之上，體積較大的細(xì)胞沉降較快，體積較小的細(xì)胞沉降較慢，從而將具有不同密度和大小的細(xì)胞分離開來。一步密度梯度離心法常用于分離血細(xì)胞和形成玫瑰花環(huán)的淋巴細(xì)胞。一步密度梯度法常用的分離介質(zhì)是：Ficoll-Hypaque,也可用Percoll,動物血清,BSA等。第24頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法B.等密度梯度離心法等密度梯度離心法分離細(xì)胞的依據(jù)是細(xì)胞的密度。在等密度連續(xù)梯度分離中，細(xì)胞在強離心力的作用下，通過密度逐漸增高的介質(zhì)沉降，當(dāng)其到達(dá)某一沉降距離，細(xì)胞的密度恰好等于梯度介質(zhì)的密度，因此沉降速度為0。在平衡狀態(tài)下，細(xì)胞在此特定位置形成一條區(qū)帶而不再繼續(xù)沉降，所以具有不同密度的細(xì)胞群體便在梯度介質(zhì)的不同位置上形成區(qū)帶。因此，等密度梯度離心法分離細(xì)胞僅僅依賴于細(xì)胞的密度。反過來，通過測定細(xì)胞停留處梯度介質(zhì)的密度，可以確定細(xì)胞的密度。第25頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法B.等密度梯度離心法非連續(xù)密度梯度離心法分離細(xì)胞的原理與連續(xù)密度梯度離心法是相同的，但細(xì)胞集中在介質(zhì)和介質(zhì)之間的界面上。等密度梯度離心法采用強離心力，其目的僅僅是加快達(dá)到平衡的速度和減少擴散的混合效應(yīng)。雖然細(xì)胞體積的大小可影響建立平衡的速度，但不影響達(dá)到平衡時細(xì)胞在梯度上所處的位置。應(yīng)用本技術(shù)分離細(xì)胞常用的梯度介質(zhì)有BSA和Percoll。因為建立平衡的速度與介質(zhì)的黏度成反比，故采用Percoll等低黏度介質(zhì)所制備的密度梯度離心分離細(xì)胞，可在低離心力、短時間內(nèi)達(dá)到平衡。第26頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法C.速度沉降法在速度沉降中，細(xì)胞的體積和密度共同影響細(xì)胞的分級分離，但細(xì)胞體積為主要決定因素。細(xì)胞在單位重力下通過低密度介質(zhì)（約1.01g/ml）沉降，或在低離心力（通常為100g）作用下通過密度梯度層而沉降，此種細(xì)胞分離方法即速度沉降。前者稱為單位重力沉降法，后者即所謂低速離心速度沉降法。第27頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二2.利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的方法D.離心淘析分離技術(shù)離心淘析（centrifugalelutriation）分離技術(shù)是通過含細(xì)胞介質(zhì)溶液的流力和浮力與細(xì)胞所受離心力之間相互作用而分離細(xì)胞的一種技術(shù)。第28頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二3.根據(jù)細(xì)胞表面電荷的細(xì)胞分離方法細(xì)胞表面均帶有電荷，在電場中可向一定的方向泳動，此即細(xì)胞電泳。細(xì)胞在電場中的泳動速度與其所帶電荷密度有關(guān)。在生理pH條件下，絕大多數(shù)細(xì)胞帶負(fù)電荷，在電場中將向正極泳動，但不同細(xì)胞所帶負(fù)電荷密度不同，故在電場中泳動速度不同，據(jù)此可將不同類型的細(xì)胞分離開。電泳分離細(xì)胞需要特殊的儀器設(shè)備。用于細(xì)胞電泳的儀器型號很多，其操作原理也不盡相同。某些儀器僅用于分析，有些則既可用于分析，也可用于制備。用于制備目的最常用的細(xì)胞電泳技術(shù)是自由流動電泳和密度梯度電泳。第29頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二1.自由流動電泳分離技術(shù)采用自由流動電泳儀可以進(jìn)行細(xì)胞的連續(xù)分離，目前多用的儀器是EIPhorVaP細(xì)胞電泳儀。細(xì)胞電泳分離技術(shù)已用于人和動物T,B淋巴細(xì)胞及其它一些細(xì)胞的分離，尤其以分離大鼠T,B淋巴細(xì)胞比較成功。優(yōu)缺點：細(xì)胞電泳分離技術(shù)的優(yōu)點是所分離的細(xì)胞完整無損，活性較高，保持原來的生物學(xué)特性，可用于許多方面的研究。其不足之處是分離方法還不太理想，重復(fù)性較差，設(shè)備復(fù)雜且價格昂貴，故一直未能推廣應(yīng)用。2.密度梯度電泳分離技術(shù)密度梯度電泳分離法是用聚蔗糖或聚蔗糖／蔗糖制成密度梯度進(jìn)行電泳分離細(xì)胞的技術(shù)，樣品經(jīng)分離后，不同的細(xì)胞群體在此梯度上形成穩(wěn)定的區(qū)帶。常用的密度梯度電泳儀是BuchlerPoly-Prep200電泳儀。密度梯度電泳技術(shù)分離細(xì)胞方法復(fù)雜，設(shè)備價格昂貴，現(xiàn)在應(yīng)用并不廣泛。3.根據(jù)細(xì)胞表面電荷的細(xì)胞分離方法第30頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二4.基于不同黏附特性的細(xì)胞分離方法黏附于某些固相物質(zhì)如玻璃或塑料的表面，是某些類型細(xì)胞的基本生物學(xué)特性之一，但另一些細(xì)胞卻缺乏這種能力；或某些細(xì)胞的黏附能力強、黏附作用快，而另一些細(xì)胞黏附能力弱或黏附作用慢。根據(jù)這種差異，可用下列方法分離或消除某些類型的細(xì)胞。A.差速黏附處理B.葡聚糖凝膠G-10過柱法C.羰基鐵粉法D.尼龍毛分離法第31頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二4.基于不同黏附特性的細(xì)胞分離方法A.差速黏附處理根據(jù)不同細(xì)胞在玻璃或塑料培養(yǎng)瓶皿表面上黏附能力的差異，將異質(zhì)性細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)瓶皿內(nèi)，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一定時間；使細(xì)胞懸液中黏附能力較強的細(xì)胞先黏附在瓶皿的壁上，然后收集尚未黏附的細(xì)胞或者已經(jīng)黏附的細(xì)胞，再用于種植和培養(yǎng)。這種將黏附較快的細(xì)袍與黏附較慢（或無黏附能力）的細(xì)胞分開并分別收集的處理過程就稱為差速黏附處理。差速黏附處理常用于分離細(xì)胞懸液中的成纖維細(xì)胞與其它組織細(xì)胞。另外，像巨噬細(xì)胞之類的具有強黏附能力的細(xì)胞也常借此方法而與其它黏附能力較差的細(xì)胞相分離。第32頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二B.葡聚糖凝膠G-10過柱法4.基于不同黏附特性的細(xì)胞分離方法葡聚糖（sephadex）是葡萄糖的聚合物，在水中膨脹時可形成凝膠。葡聚糖G-10凝膠具有極小的微孔，常用于分離生物大分子，但也可用來分離細(xì)胞。其分離細(xì)胞的原理是：利用細(xì)胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝膠從而將異質(zhì)性細(xì)胞懸液中的具黏附能力的細(xì)胞去除。C.羰基鐵粉法用羰基鐵粉處理，能有效地去除異質(zhì)性細(xì)胞懸液中具有黏附能力的細(xì)胞。該法的基本原理是：把鐵粉加入異質(zhì)性細(xì)胞懸液中后，具有黏附活性的細(xì)胞將黏附于鐵粒子，在器皿外用磁鐵將鐵粒子連同黏附其上的細(xì)胞吸至底部，收獲細(xì)胞懸液，即為去除了黏附細(xì)胞的細(xì)胞制劑。此法通常用于去除免疫細(xì)胞懸液中的單核／巨噬細(xì)胞。在此情況下，單核／巨噬細(xì)胞可吞噬鐵粒子，這一特性也有助于將其清除。第33頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二4.基于不同黏附特性的細(xì)胞分離方法D.尼龍毛分離法

尼龍毛(nylonwool)就是聚酰胺纖維。應(yīng)用尼龍毛柱可從混合白細(xì)胞懸液中獲得富含T淋巴細(xì)胞的制劑。其基本原理是：B淋巴細(xì)胞和單核／巨噬細(xì)胞易黏附于尼龍毛表面，當(dāng)白細(xì)胞懸液通過尼龍毛柱時，B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及單核／巨噬細(xì)胞將黏附于柱上，而無黏附能力的T細(xì)胞則通過柱子，收集流出的細(xì)胞即獲T淋巴細(xì)胞。此法主要用于從淋巴細(xì)胞中分離T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞或從白細(xì)胞或單個核細(xì)胞中純化或去除T淋巴細(xì)胞。第34頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二5.利用細(xì)胞表面標(biāo)志分離純化細(xì)胞的方法根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志的不同，利用相應(yīng)的抗體特別是單克隆抗體和配體，已經(jīng)建立了多種基于親和原理的細(xì)胞分離純化方法。從理論上講，根據(jù)表面標(biāo)志的細(xì)胞分離方法應(yīng)該是獲得高純度細(xì)胞群或細(xì)胞亞群的最可靠、最有發(fā)展前途的分離技術(shù)，而實踐也證明的確如此。A.免疫溶解法B.盤化法C.凝集素凝集法D.玫瑰花環(huán)分離法E.流式細(xì)胞分選術(shù)F.免疫磁珠分離技術(shù)第35頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二5.利用細(xì)胞表面標(biāo)志分離純化細(xì)胞的方法A.免疫溶解法：

免疫溶解法也稱免疫消除法。當(dāng)補體存在時，用抗細(xì)胞某一表面標(biāo)志的特異性抗體與異質(zhì)性細(xì)胞一起孵育，可以使具有該特異性表面標(biāo)志的細(xì)胞溶解。利用這一原理，將待消除細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志的抗體和補體加入細(xì)胞懸液或細(xì)胞培養(yǎng)物中，使抗體及補體作用于具相應(yīng)抗原的細(xì)胞并溶解之。B.盤化法（panning）：

是一種在固相表面進(jìn)行親和分離細(xì)胞的技術(shù)，它利用蛋白質(zhì)分子可吸附于聚苯乙烯塑料表面和抗原一抗體或配體一受體特異性結(jié)合的原理，以聚苯乙烯塑料作為親和劑的不溶性基質(zhì)，將抗體（或抗原）、配體（或受體）蛋白吸附于其表面，加上異質(zhì)性細(xì)胞懸液，帶有相應(yīng)表面抗原或表面受體（或配體）的細(xì)胞將結(jié)合于塑料表面，從而將其從異質(zhì)性細(xì)胞懸液中分離出來（陽性選擇）或除去（陰性選擇）。第36頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二5.利用細(xì)胞表面標(biāo)志分離純化細(xì)胞的方法C.凝集素凝集法：

凝集素(lectin)是一類以兩價或多價與糖結(jié)合的非酶非抗體蛋白質(zhì)，能凝集具有一個以上相應(yīng)互補性糖類的細(xì)胞或其它物質(zhì)。細(xì)胞表面能與凝集素結(jié)合的結(jié)構(gòu)稱為該凝集素的受體，通常為膜蛋白，但凝集素是對糖特異的，一般只與糖蛋白或多糖的末端非還原糖基反應(yīng)。幾乎所有的細(xì)胞都存在一到幾種凝集素的受體，而不同類型細(xì)胞往往具有不同凝集素受體。根據(jù)細(xì)胞表面凝集素受體的不同，可采用不同的凝集素使之凝集而與其它細(xì)胞分離開來。原則上講，所有細(xì)胞，包括細(xì)菌細(xì)胞及單細(xì)胞原生動物，都可以采用不同的凝集素來進(jìn)行分離純化。D.玫瑰花環(huán)分離法：

某些細(xì)胞如人T淋巴細(xì)胞具有異種紅細(xì)胞的受體，在一定的條件下，T淋巴細(xì)胞可與紅細(xì)胞相互識別而結(jié)合，形成一個T淋巴細(xì)胞被數(shù)個紅細(xì)胞圍繞的現(xiàn)象，在顯微鏡下觀察宛如一支玫瑰花，故形象地稱為玫瑰花環(huán)(rosette)。第37頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二E.流式細(xì)胞分選術(shù)：流式細(xì)胞儀（flowcytometer,FCM）是一種將流體噴射技術(shù)、激光技術(shù)、空氣計數(shù)、γ射線能譜術(shù)及電子計算機等技術(shù)與顯微熒光光度計密切結(jié)合的儀器，流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry）就是應(yīng)用FCM檢測、分析生物顆粒（包括細(xì)胞）的物理和／或化學(xué)特性或借這些特性進(jìn)行分離純化的技術(shù)。

FCM是隨著計算機科學(xué)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、單克隆抗體制備、定量細(xì)胞化學(xué)和定量熒光細(xì)胞化學(xué)等方法和技術(shù)的應(yīng)用而日益完善的，其檢測分析對象范圍越來越大，如大的免疫復(fù)合物、病毒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞以及某些簡單的多細(xì)胞生物，而且對所有生物都普遍適用，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的幾乎所有分支學(xué)科，特別是細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、藥物學(xué)等的研究。

目前，流式細(xì)胞術(shù)主要用于細(xì)胞的定性、定量研究。5.利用細(xì)胞表面標(biāo)志分離純化細(xì)胞的方法第38頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二F.免疫磁珠分離技術(shù)：

免疫磁性微珠（簡稱免疫磁珠）是以直徑幾個微米的磁性微珠作為載體，將抗體或抗原結(jié)合在此載體上，即成為帶有免疫配基的磁性微珠。磁性微珠是一種人工合成的、含金屬的小顆粒，由三部分組成：核心是金屬小顆粒，核心的外層均勻包裹一層高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯等），最外層是功能基團，如氨基（—NH2）、羧基（—COOH2）、羥基（—OH）等，以便與生物大分子偶聯(lián)。免疫磁珠分離技術(shù)的基本原理是：磁珠既可結(jié)合蛋白質(zhì)，又可被磁鐵所吸附，經(jīng)過一定處理將抗體（或抗原）結(jié)合在磁珠上，使之成為抗體（或抗原）的載體；磁珠上抗體（或抗原）與特異性抗原（或抗體）物質(zhì)結(jié)合后，形成抗原一抗體磁珠免疫復(fù)合物；這種復(fù)合物在磁力作用下，發(fā)生力學(xué)移動，使復(fù)合物與其它物質(zhì)分離，從而達(dá)到分離特異性抗原（或抗體）的目的。磁珠與抗體的結(jié)合可能只與抗體蛋白的通性和磁珠的特性有關(guān)，而與不同個體的個性關(guān)系不大，因此磁珠對抗體蛋白的結(jié)合具有普遍意義，從而保證其廣泛的應(yīng)用。5.利用細(xì)胞表面標(biāo)志分離純化細(xì)胞的方法第39頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二6.利用其它細(xì)胞學(xué)特性分離純化細(xì)胞的方法A.反復(fù)植塊法：

反復(fù)植塊法(repeatedexplantation)主要是利用不同細(xì)胞的遷移能力不同，在植塊培養(yǎng)不同時間后，待遷移能力強的細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）從植塊遷移出來以后，而將植塊重新種植，使目的細(xì)胞再遷移出來，收獲并用于進(jìn)一步培養(yǎng)。目前，這種處理方法主要是針對植塊內(nèi)成纖維細(xì)胞與目的細(xì)胞向外遷移的速度有較大差別而應(yīng)用的。反復(fù)植塊法的優(yōu)點在于以動物組織植塊為材料，細(xì)胞在取材過程中受損傷的程度低。但缺點是純化周期長，細(xì)胞產(chǎn)量低，細(xì)胞純度難以保證。B.有絲分裂抑制劑處理：

有絲分裂抑制劑是一類能通過影響DNA復(fù)制而抑制細(xì)胞分裂的化合物。常用的有阿糖胞苷（arabinosylcytosine,Ara-C）、氟尿嘧啶（fluorouracil,FU）等。在體外培養(yǎng)時，給培養(yǎng)液中加入一定量有絲分裂抑制劑，可以抑制所有細(xì)胞的分裂活動但不影響細(xì)胞的生存和生長。繼續(xù)培養(yǎng)一定時間，不能進(jìn)行分裂活動的可分裂細(xì)胞將逐漸死亡。于是，培養(yǎng)物中留下相對較純的有絲分裂后細(xì)胞。第40頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程三、體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)四、細(xì)胞分離與純化五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆六、培養(yǎng)物的觀察檢測方法第41頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆從有機體取得組織、細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，原代培養(yǎng)物中一般都包含多種細(xì)胞成分。針對不同的研究目的，需要對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行純化，以獲得成分相對單純的培養(yǎng)物。建立細(xì)胞系、細(xì)胞株和細(xì)胞克隆以及細(xì)胞周期同步化處理就是不同層次上的細(xì)胞純化過程。原則上，傳代（繼代）培養(yǎng)的過程就是細(xì)胞系的建立過程。但僅僅經(jīng)過傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)物的細(xì)胞組成還不能達(dá)到完全單一。對某些研究來講，必須在細(xì)胞系的基礎(chǔ)上進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，以篩選細(xì)胞成分單一的細(xì)胞株。第42頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二

（一）細(xì)胞系（株）的建立與鑒定1、基本概念將從有機體得到的細(xì)胞在體外進(jìn)行第一次培養(yǎng)，稱之為原代培養(yǎng)，也叫初代培養(yǎng)。如果對原代培養(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此時的培養(yǎng)物就稱為細(xì)胞系（cellline）。所以，細(xì)胞系就是指從原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代培養(yǎng)后得來的一群不均一的細(xì)胞，可以長期連續(xù)傳代。細(xì)胞系是由原先組成原代培養(yǎng)物的所有細(xì)胞類型所組成。細(xì)胞系雖然并不強調(diào)單一的細(xì)胞類型，可以包含來自所取組織中的多種細(xì)胞成分，但一般認(rèn)為應(yīng)以某種細(xì)胞為主，即主類細(xì)胞應(yīng)占絕大多數(shù)。根據(jù)細(xì)胞系在體外能否持續(xù)傳代，可將細(xì)胞系分為有限細(xì)胞系與無限細(xì)胞系。

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克?。?）細(xì)胞系（cellline）第43頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二在體外的生存期有限的細(xì)胞系，稱之為有限細(xì)胞系（finitecellline）。大多數(shù)二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。在體外可以持續(xù)生存，具有無限繁殖能力的細(xì)胞系，則稱之為連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系（infinitecellline）。連續(xù)細(xì)胞系多為異倍體細(xì)胞。有的無限細(xì)胞系（如NIH3T3,RAT-1等）有持久性增殖能力，即永生性或不死性（immortality），但仍保留接觸抑制，異體接種無致瘤性。有的無限細(xì)胞系不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明其已惡性化，可稱之為惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(malignanttransformedcellline）。

（一）細(xì)胞系（株）的建立與鑒定1、基本概念

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克?。?）細(xì)胞系（cellline）第44頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二（2）細(xì)胞株（cellstrain）通過選擇或克隆化培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞群稱為細(xì)胞株（cellstrain)。這些特性包括：具有一定標(biāo)記染色體、對某種病毒的敏感性或抗性以及具有特殊的抗原性等，在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限的細(xì)胞株，可稱為有限細(xì)胞株(finitecellstrain)；可以連續(xù)傳代的細(xì)胞株則稱為連續(xù)細(xì)胞株（continuouscellstrain),體外培養(yǎng)的細(xì)胞在自然條件或人工誘導(dǎo)下，會在遺傳性狀上發(fā)生變異，形成亞株。由原細(xì)胞株再次克隆形成的與原株性狀有部分不同的細(xì)胞群，稱之為亞株(substrain)

。

（一）細(xì)胞系（株）的建立與鑒定1、基本概念

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆第45頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二在實際運用中，細(xì)胞系與細(xì)胞株的概念常常被混為一談。其實，這兩個概念有明顯的區(qū)別，細(xì)胞株（cellstrain）強調(diào)培養(yǎng)物細(xì)胞成分的單一性，所有細(xì)胞的遺傳、生化等特性完全相同；細(xì)胞系（cellline）雖然并不強調(diào)細(xì)胞的純度，可以包含多種細(xì)胞成分，但主類細(xì)胞應(yīng)占絕大多數(shù)。

（一）細(xì)胞系（株）的建立與鑒定1、基本概念

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆（2）細(xì)胞株（cellstrain）第46頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二（二）細(xì)胞克?。╟ellcloning）細(xì)胞系中的細(xì)胞類型是不均一的，通過細(xì)胞克?。╟ellcloning），能使培養(yǎng)物從不均一轉(zhuǎn)變?yōu)榫唬古囵B(yǎng)物的遺傳可變性減少?？寺∽鳛槊~使用，是指從一個單一母細(xì)胞繁殖出來的細(xì)胞群體。細(xì)胞克隆作為動詞，是指分離單一細(xì)胞并使其繁殖為單一細(xì)胞群體的過程。細(xì)胞克隆又稱單細(xì)胞克?。╯inglecellcloning），即把單個細(xì)胞從群體內(nèi)分離出來單獨培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆第47頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二原代培養(yǎng)的細(xì)胞和其它未經(jīng)克隆化的細(xì)胞系都具有異質(zhì)性。由單一細(xì)胞克隆化形成的細(xì)胞群體，細(xì)胞遺傳性狀差異減少，生物學(xué)性狀均一，利于實驗研究。理論上，各種培養(yǎng)細(xì)胞都可用來進(jìn)行克隆培養(yǎng)（cloningculture）。但實際上，原代培養(yǎng)細(xì)胞和有限細(xì)胞系（二倍體細(xì)胞）比較困難，無限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞則比較容易。

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克?。ǘ┘?xì)胞克?。╟ellcloning）第48頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二克隆細(xì)胞時，要把細(xì)胞先制備成單細(xì)胞懸液，再接種在培養(yǎng)瓶上，讓細(xì)胞呈單個分布獨立生長。適應(yīng)性和活力較強的細(xì)胞能增殖形成細(xì)胞小群落。再取單個細(xì)胞群落進(jìn)行再培養(yǎng)。1、克隆培養(yǎng)技術(shù)單細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)有很多種方法。根據(jù)生長基質(zhì)或培養(yǎng)物的性質(zhì)或類型不同，常用的細(xì)胞克隆技術(shù)分為：

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克?。ǘ┘?xì)胞克?。╟ellcloning）第49頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二（1）稀釋鋪板法（2）飼養(yǎng)層克隆法（3）膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法（4）瓊脂克隆法

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆1、克隆培養(yǎng)技術(shù)（二）細(xì)胞克?。╟ellcloning）第50頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二此方法使用稀釋后的低密度細(xì)胞懸液，在多孔塑料培養(yǎng)板各孔中分別接種細(xì)胞懸液，使每孔平均含1個細(xì)胞。經(jīng)鏡下檢測，標(biāo)記下含單細(xì)胞的孔，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。數(shù)日后，凡在已標(biāo)記的孔中有生長增殖的細(xì)胞即為克隆細(xì)胞。（1）稀釋鋪板法

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆1、克隆培養(yǎng)技術(shù)（二）細(xì)胞克?。╟ellcloning）第51頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二1）主要實驗材料：①培養(yǎng)用液：培養(yǎng)液、消化酶溶液、平衡鹽溶液。②培養(yǎng)用品：包括培養(yǎng)瓶皿、培養(yǎng)板（96孔）、吸管、加樣器等。③待克隆細(xì)胞：經(jīng)過原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。2）具體操作過程：①消化：②低密度細(xì)胞懸液的制備：③接種：④標(biāo)記與培養(yǎng)：⑤分離擴大培養(yǎng)：（1）稀釋鋪板法

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆1、克隆培養(yǎng)技術(shù)（二）細(xì)胞克?。╟ellcloning）第52頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二在體外培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長增殖除了取決于細(xì)胞特性、培養(yǎng)體系和培養(yǎng)條件外，還需要有一定的細(xì)胞密度。單個細(xì)胞和密度極低的分散細(xì)胞很難存活和增殖。為了促使剛剛克隆化的極少量細(xì)胞生長、增殖，在培養(yǎng)皿中加入能貼壁生長的其它細(xì)胞，稱之為“飼養(yǎng)細(xì)胞(feedercell)”,常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆1、克隆培養(yǎng)技術(shù)（2）飼養(yǎng)層克隆法（二）細(xì)胞克?。╟ellcloning）第53頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二巨噬細(xì)胞不僅能起飼養(yǎng)作用，還能清除培養(yǎng)體系中的死、傷細(xì)胞及其碎片。因飼養(yǎng)細(xì)胞制備繁瑣，在應(yīng)用稀釋鋪板法克隆細(xì)胞后，已很少有人再用飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行克隆細(xì)胞。但作為生長基質(zhì)，用以培養(yǎng)某些難培養(yǎng)的細(xì)胞尚有應(yīng)用價值。

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆1、克隆培養(yǎng)技術(shù)（2）飼養(yǎng)層克隆法（二）細(xì)胞克?。╟ellcloning）第54頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二原代培養(yǎng)細(xì)胞容易黏附于膠原膜層或血纖維膜層等生長基質(zhì)成分之上。在細(xì)胞克隆中，用膠原膜層或血纖維膜層代替飼養(yǎng)細(xì)胞，可幫助單個細(xì)胞和密度極低的分散細(xì)胞黏附和貼壁、存活并逐漸繁殖。

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆1、克隆培養(yǎng)技術(shù)（3）膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法（二）細(xì)胞克隆（cellcloning）第55頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二1）血纖維蛋白膜層的制備：①取0.2μg凝血酶溶于100ml

克隆培養(yǎng)液中，制成A液。②取250mg牛血纖維蛋白原,800mgNaCl,25mg檸檬酸鈉溶于1000ml雙蒸水中，制成B液。③取B液1ml和A液4ml放入培養(yǎng)皿內(nèi)盡快混合，幾分鐘后即形成透明膠層。2）消化、接種和培養(yǎng)待克隆細(xì)胞：①取處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)物，用胰蛋白酶溶液消化后制備細(xì)胞懸液。②用克隆培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，一般以每一培養(yǎng)器皿內(nèi)生長1～10個克隆的細(xì)胞濃度為最適。③將細(xì)胞懸液按所需數(shù)目種入鋪有生物基質(zhì)層的培養(yǎng)器皿內(nèi)，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換培養(yǎng)液1次。④觀察并計數(shù)克隆之?dāng)?shù)目。

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆1、克隆培養(yǎng)技術(shù)（3）膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法（二）細(xì)胞克?。╟ellcloning）第56頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二瓊脂層是一種簡單的生長基質(zhì)層，可幫助細(xì)胞貼附生長。瓊脂中含有酸性硫酸多糖，對大多數(shù)細(xì)胞有一定的抑制作用。然而，對于有些細(xì)胞，特別是病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞卻無大影響。由于這些細(xì)胞易于懸浮培養(yǎng)，從而逐步發(fā)展了半固體培養(yǎng)基用來克隆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法。

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆1、克隆培養(yǎng)技術(shù)（4）瓊脂克隆法（二）細(xì)胞克隆（cellcloning）第57頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二1）瓊脂培養(yǎng)液的制備：①用Difco瓊脂配成2％瓊脂母液，經(jīng)高壓蒸汽消毒后貯存?zhèn)溆?。②?zhǔn)備進(jìn)行培養(yǎng)時，將2％瓊脂母液加熱融化后，在室溫下降溫，然后浸人45℃水浴中。③將完全培養(yǎng)液也浸于45℃水浴中溫育。④取完全培養(yǎng)液和2%瓊脂液配成含有0.33%

瓊脂的培養(yǎng)液。分裝試管內(nèi)，每管加

2.5ml瓊脂培養(yǎng)液，仍浸于45℃水浴中，以保持瓊脂呈液化狀態(tài)。2）消化、接種和培養(yǎng)待克隆細(xì)胞：①將待克隆細(xì)胞用胰蛋白酶溶液消化，用克隆培養(yǎng)液逐級稀釋細(xì)胞懸液。②將稀釋后的細(xì)胞懸液浸于冰浴中。在瓊脂試管內(nèi)各加入含有不同細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液0.5ml?；旌虾罅⒓磧A入培養(yǎng)皿內(nèi)鋪平。③放置于4℃條件下使其凝固。然后置于CO２培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。④培養(yǎng)1～2d觀察結(jié)果，計克隆數(shù)。

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆1、克隆培養(yǎng)技術(shù)（4）瓊脂克隆法（二）細(xì)胞克?。╟ellcloning）第58頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二

２、影響克隆形成率的因素接種眾多單個分散細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后能夠增生形成克隆的百分?jǐn)?shù)稱克隆率或接種率(cloningefficiency)，其高低與多種因素有關(guān)。（1）接種的細(xì)胞密度克隆形成率與接種細(xì)胞的密度有一定的相關(guān)性(見下表)，細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度越大，接種時每平方厘米培養(yǎng)皿上接種的細(xì)胞越多，克隆的形成率就越低。為提高克隆形成率，須將細(xì)胞懸液稀釋成密度為10個／ml，甚至更低，接種的密度也要小。

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克?。ǘ┘?xì)胞克隆（cellcloning）第59頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二

２、影響克隆形成率的因素（1）接種的細(xì)胞密度

五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克?。ǘ┘?xì)胞克?。╟ellcloning）第60頁，共68頁，2023年，2月20日，星期二（2）培養(yǎng)基可用于克隆化的基礎(chǔ)培養(yǎng)液（見下表）。通過選擇性培養(yǎng)，選定群落形成效率比較高的培養(yǎng)液作