第十體細(xì)胞無性系變異及突變體篩選

第十體細(xì)胞無性系變異及突變體篩選第1頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第十章體細(xì)胞無性系變異及

突變體篩選第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選第2頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

一、體細(xì)胞無性系變異的定義二、體細(xì)胞無性系變異的普遍性三、體細(xì)胞無性變異的表現(xiàn)及類型四、體細(xì)胞無性系變異的頻率五、體細(xì)胞無性系變異的機(jī)理六、體細(xì)胞無性系變異的特點(diǎn)七、影響體細(xì)胞無性系變異的因素八、體細(xì)胞無性系變異在育種上的應(yīng)用九、體細(xì)胞無性系變異的幾個(gè)實(shí)例第3頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

一、體細(xì)胞無性系變異的定義

體細(xì)胞無性系變異（Somaclonalvariation）（我們?cè)诘谝徽碌诙?jié)“植物細(xì)胞工程常用術(shù)語”中曾敘述到）——指在組織培養(yǎng)過程中，來自體細(xì)胞的培養(yǎng)物及再生植株發(fā)生的變異。此句里面還有2層意思：第一層意思是這一變異來自組織培養(yǎng)，以區(qū)別于一般所指的自然變異、遺傳變異和理化誘變；第二層意思是這一變異發(fā)生在體細(xì)胞，而不是性細(xì)胞，以區(qū)別于花藥（花粉）培養(yǎng)。這一定義最早來自Larkin（拉金）和Swwcroftl（斯考史羅夫特）（1981），以后，Evanz（埃文斯）（1984）、Larkin（1985）和朱自清（1991）等對(duì)此作過評(píng)述。1990年又出版了Bajai（巴扎）主編的有關(guān)體細(xì)胞無性系變異的專著。

體細(xì)胞無性系變異有遺傳性的和生理性的，遺傳性的變異主要為基因和染色體發(fā)生的變異，可代代遺傳；生理性的變異主要是由于環(huán)境條件的改變，使組織或細(xì)胞的某些生理功能發(fā)生變化，一般不能遺傳。（在多種植物出現(xiàn)同種變異，在同種植物出現(xiàn)多種變異）第4頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

二、體細(xì)胞無性系變異的普遍性

大量資料表明，體細(xì)胞無性系變異是植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的普遍現(xiàn)象。已經(jīng)觀察到體細(xì)胞無性系變異的農(nóng)作物有：甘蔗（Heinz,etal,1971）、馬鈴薯（Oono,1987）、小麥（Larkin,etal,1984）玉米（Peschke,etal,1987）燕麥（Cummingsetal,1976）大麥（Deambrogio,1980）,小黑麥（Nakamura,etal，1982）、谷子（趙連元等，私人通信）、油菜（Hoffmann,etal.,1982）、大豆（Freytag,etal.,1981）、蘭花（魏亞鉥，1992）、蕃茄、茄子、瓜類，甜菜、菊苣、煙草、草莓、桃、天竺葵、倒掛金鐘、香石竹、水晶掌和錦帶花等（Bajaj,1990）。

1971年，Heinz（海因茨）和Mee（米）報(bào)道甘蔗再生植株中存在廣泛的變異，包括形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和同工酶譜。其中觀賞植物的無性系變異可利用性很廣泛，是值得注意的新動(dòng)向。組織培養(yǎng)中的這種體細(xì)胞無性系變異既不限于某種物種，也不局限于某些器官。變異所涉及的性狀也相當(dāng)廣泛。第5頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

三、體細(xì)胞無性變異的表現(xiàn)及類型

體細(xì)胞無性系變異主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（或分為幾種類型）1、植株外部形態(tài)的變異2、育性上的變異3、生長勢(shì)上的變異4、抗性變異5、某些酶或同工酶發(fā)生差異6、次生代謝物的差異7、染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)量上的變異8、某些基因組DNA的變異第6頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

三、體細(xì)胞無性變異的表現(xiàn)及類型1、植株外部形態(tài)的變異（1）株高：高于或矮于原供體植株，如水稻、小麥，煙草等；（2）葉形：1）大于或小于原供體植株；

2）形狀不同于原供體植株，如煙草；（3）葉色：1）有葉片條紋，如燕麥；

2）葉片缺綠（白化苗），如玉米（4）莖色：莖有條紋，如甘蔗，莖有黃色條紋（呈黃綠相間），像一種竹（斑竹）。（5）穗型：1）大于或小于原供體植株；

2）密于或疏于原供體植株。（6）粒型：1）大于或小于原供體植株；

2）大于或短于原供體植株。（7）粒色：不同于原供體植株。（8）芒性：1）芒有無；2）芒長短。第7頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

三、體細(xì)胞無性變異的表現(xiàn)及類型2、育性上的變異變異表現(xiàn)為全不育或半不育，如水稻、番茄等。3、生長勢(shì)上的變異（1）抽穗期：早于或遲于原供體植株，如水稻，玉米。（2）花期：早于或遲于原供體植株（3）成熟期：早于或遲于原供體植株（4）雜種優(yōu)勢(shì)：生長勢(shì)強(qiáng)于原供體植株，如玉米。第8頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

三、體細(xì)胞無性變異的表現(xiàn)及類型4、抗性變異（1）抗病性：強(qiáng)于原供體植株。

①抗玉米小斑病毒；

②抗甘蔗斐濟(jì)病毒，霜病毒；

③抗水稻白葉枯?。?/p>

④抗馬鈴薯晚疫病、枯萎病。（2）抗代謝物：（3）抗鋁毒性：如水稻（國際水稻研究所，Swwcroft,1986）（4）耐鹽性：比原供體植株耐鹽。第9頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

三、體細(xì)胞無性變異的表現(xiàn)及類型5、某些酶或同工酶發(fā)生差異（1）α—淀粉酶，如小麥（2）酯酶同工酶，如甘蔗6、次生代謝物的差異第10頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

三、體細(xì)胞無性變異的表現(xiàn)及類型7、染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)量上的變異（1）染色體結(jié)構(gòu)：1）染色體橋：如胡蘿卜、單冠毛菊、煙草等2）染色體X、2X、3X、4X、8X……3）落后染色體：如柳杉（2）染色體數(shù)量：1）非整倍體：如柳杉、常春藤、龍葵、小麥等；2）多倍體：如五針?biāo)?、西藏長葉松、煙草、大麥等；3）混倍體：如玉米、茄子等。第11頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

三、體細(xì)胞無性變異的表現(xiàn)及類型8、某些基因組DNA的變異（1）核基因突變：

①單基因突變（隱性或顯性）；

②多基因突變。（2）細(xì)胞質(zhì)基因突變：

①線粒體基因變異；

②細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因突變，不育→可育第12頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

四、體細(xì)胞無性系變異的頻率體細(xì)胞無性系變異的頻率在一些作物上是非常高的，可達(dá)10%以上。表14-4：一些植物的體細(xì)胞無性系變異（表型）出現(xiàn)的頻率第13頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二植物種再生植株來源表型變異頻度（%）研究者菠蘿幼果愈傷組織100Wakasa(1979)裔芽愈傷組織98Wakasa(1979)腋芽愈傷組織34Wakasa(1979)冠芽愈傷組織7Wakasa(1979)煙草體細(xì)胞愈傷組織10Popchristov和Zaganska(1977)水稻胚愈傷組織71.9Oono(1978)幼穗愈傷組織97.3趙成章等（1982）甘蔗幼葉愈傷組織>18Heinz(1971,1976)馬鈴薯幼葉愈傷組織100Shepard(1980)玉米體細(xì)胞愈傷組織14Green(1977)表14-4：一些植物的體細(xì)胞無性系變異（表型）出現(xiàn)的頻率第14頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

五、體細(xì)胞無性系變異的機(jī)理對(duì)體細(xì)胞無性變異現(xiàn)象，由于是在上世紀(jì)七十年代末期才開始系統(tǒng)研究，所以迄今對(duì)其起因尚未完全清楚。總的來說不外乎兩方面的原因：一是供體組織的細(xì)胞中原已發(fā)生變異，當(dāng)它們?cè)偕赏暾仓陼r(shí)，這種變異便表現(xiàn)出來。但對(duì)這種看法目前尚無足夠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。二是組織培養(yǎng)循環(huán)過程誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生變異，這點(diǎn)已為許多試驗(yàn)所證實(shí)。第15頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

六、體細(xì)胞無性系變異的特點(diǎn)主要有4點(diǎn)：1、變異廣泛：2、后代穩(wěn)定性：3、能基本保持原品種特性4、潛在隱性性狀活化第16頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

六、體細(xì)胞無性系變異的特點(diǎn)1、變異廣泛：如前所述，植物體細(xì)胞無性系變異現(xiàn)象相當(dāng)普遍，變異所涉及到的性狀也相當(dāng)廣泛，包括數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀的變化，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化、DNA擴(kuò)增或減少，生化特性的變化等。2、后代穩(wěn)定性：雖然體細(xì)胞無性系再生植物的絕大部分性狀變異是生理效應(yīng)，不能遺傳，但也有少數(shù)性狀變異是可以遺傳的，如水稻的粒型、叢生型、抗病性等。這些可遺傳的變異通常在再生植株二代便可穩(wěn)定下來，成為穩(wěn)定株系。但也有部分株系是雜合體繼續(xù)產(chǎn)生分離。不過這種分離多屬簡(jiǎn)單分離，分離的程度與供體植株的遺傳背景有關(guān)，一般小麥穩(wěn)定株系為30~50%，水稻為90%左右。第17頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

六、體細(xì)胞無性系變異的特點(diǎn)3、能基本保持原品種特性因?yàn)轶w細(xì)胞無性系變異大部為單一性狀變異，做能基本保持原品種的特性。4、潛在隱性性狀活化在體細(xì)胞無性系后代中，常見一些原供體植株所沒有的隱性性狀變異，象雄性不育性、矮桿、葉綠體突變等，有些隱性特性對(duì)育種實(shí)踐具有重大利用價(jià)值。由于體細(xì)胞無性系變異具有上述4個(gè)特點(diǎn)，因此，在育種上的應(yīng)用日益受到重視。第18頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

七、影響體細(xì)胞無性系變異的因素影響體細(xì)胞無性系變異頻率的因素很多，主要有：1、植物的繁殖類型：2、外植體的來源部位：3、植物再生的方式：4、繼代培養(yǎng)次數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間：5、生長調(diào)節(jié)劑濃度的影響：第19頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

七、影響體細(xì)胞無性系變異的因素1、植物的繁殖類型：一般認(rèn)為長期營養(yǎng)繁殖的植物變異率較高，有人認(rèn)為這是由于外植體的體細(xì)胞中已積累著遺傳差異。自然條件下，如一些果樹的芽變（在無性繁殖、扦插、嫁接等）。2、外植體的來源部位：不同來源部位的外植體，無性系變異頻率有較大的差異。如菠蘿，來源于頂芽組織（冠芽）的較低，而其它來源的較高。3、植物再生的方式：通過愈傷組織分化不定芽的方式再生的植株變異多，通過胚狀體途徑再生的植株變異較少。通過莖尖或分生組織培養(yǎng)增殖側(cè)芽，可以保持基因型基本不變。第20頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

七、影響體細(xì)胞無性系變異的因素4、繼代培養(yǎng)次數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間：隨著愈傷組織繼代培養(yǎng)次數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間的增加，變異率不斷增高，（實(shí)為激素累積影響，“激素累積效應(yīng)”）年齡幼小的培養(yǎng)物再生的植株變異率低，年齡偏老的培養(yǎng)物再生的植物變異率較高。5、生長調(diào)節(jié)劑濃度的影響：在高濃度生長調(diào)節(jié)劑作用下，細(xì)胞分裂和生長均加快，但不正常分裂頻率增高，再生植株的變異也增多。第21頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

八、體細(xì)胞無性系變異在育種上的應(yīng)用

體細(xì)胞無性系變異在育種上應(yīng)用的時(shí)間雖然不長（從1971年開始系統(tǒng)研究甘蔗無性系算起，這方面工作僅有20多年歷史），但一些育種學(xué)家已利用它有效地進(jìn)行品種改良，并已育出一些新品種。如臺(tái)灣從甘蔗再生植株中選育高糖量的品種；中國水稻研究所（趙成章）從水稻無性系中選出高產(chǎn)新品種；美國的DNA植物技術(shù)研究所從番茄無性系中選出了新品種；Shepard等和Matern等也分別從馬鈴薯原生質(zhì)體細(xì)胞系中選育出了一些新的高產(chǎn)或抗病新類型，等等。第22頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

八、體細(xì)胞無性系變異在育種上的應(yīng)用利用體細(xì)胞無性系變異育種有如下主要優(yōu)點(diǎn)：（6點(diǎn)）１、變異率較高；（前已講，高于自發(fā)變異和理化誘變）

如水稻，經(jīng)組培獲得的突變率可達(dá)16.7%，經(jīng)理、化處理的誘變率一般為7~8%，比高2倍。2、致死和半致死突變率低于常規(guī)誘發(fā)突變；用常規(guī)物理誘變，如CO60照射，致死和半致死突變率較高3、單基因變異頻率高；利用此種變異可改變作物的個(gè)別性狀而不使其它優(yōu)良性狀發(fā)生重組及分離。4、可在試管中篩選特定的變異體；5、如采用單倍體細(xì)胞作為培養(yǎng)物，隱性變異可在當(dāng)代（Ro）表現(xiàn)，利于選擇；6、育種周期較短。第23頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

八、體細(xì)胞無性系變異在育種上的應(yīng)用體細(xì)胞無性系變異用于育種的主要程序（2種）第24頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二待改良的品種組織或細(xì)胞培養(yǎng)物變異R0R1群體選擇（決選）改良了的無性系性狀穩(wěn)定性評(píng)價(jià)田間試驗(yàn)多點(diǎn)試驗(yàn)區(qū)域試驗(yàn)品系新品種測(cè)定變異的遺傳基礎(chǔ)回交圖：孢子體體細(xì)胞[二倍體]無性系變異選育品種程序再次組織培養(yǎng)第25頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二待改良的品種單倍體花粉愈傷組織單倍體植株純合二倍體植株（H1）人工加倍變異花藥（粉）培養(yǎng)H2選擇變異株H3選擇變異株或株系H4測(cè)定變異的遺傳基礎(chǔ)品系多點(diǎn)試驗(yàn)回交穩(wěn)定性評(píng)價(jià)區(qū)域試驗(yàn)品種二倍體愈傷組織雜合二倍體植株（H1）變異變異前自然加倍二倍體愈傷組織變異后自然加倍圖：配子體（花粉）細(xì)胞無性系變異選育品種程序第26頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體細(xì)胞無性系變異

九、體細(xì)胞無性系變異的幾個(gè)實(shí)例（一）水稻：1、Oono（1981）種胚→愈傷組織→再生植株→變異后代2、趙成章等（1982），幼穗→再生植株→高產(chǎn)、抗?。ò兹~枯?。ǘ滎悾?、Larkin和Scowcroft(1984),未成熟胚→再生植株（三）玉米：（四）其它作物：1、甘蔗：2、煙草：3、五針?biāo)桑旱?7頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

一、細(xì)胞突變體的有關(guān)概念

二、植物細(xì)胞突變體篩選的發(fā)展由來三、利用培養(yǎng)的細(xì)胞誘變與篩選突變體的優(yōu)

缺點(diǎn)四、離體培養(yǎng)細(xì)胞突變的判斷標(biāo)準(zhǔn)和分類五、細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選第28頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

一、細(xì)胞突變體的有關(guān)概念

1、突變（mutation）指的是遺傳物質(zhì)（DNA）一級(jí)結(jié)構(gòu)上發(fā)生的一種永久而能遺傳的變化，這種變化在有性繁殖時(shí)可傳給后代，在無性繁殖時(shí)，可在細(xì)胞中測(cè)出變化了的基因產(chǎn)物。2、突變體（mutant）：指具有某一突變基因，從而表現(xiàn)某一表型的細(xì)胞或個(gè)體稱之。（另意：變異的表型能有性傳遞給后代，此表型稱之。）3、變異體（Variant）：指在表型變化的原因（突變或后成遺傳）未明之前的變異細(xì)胞或個(gè)體稱之。第29頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

一、細(xì)胞突變體的有關(guān)概念4、突變體篩選指用分子生物學(xué)的知識(shí)，微生物學(xué)的研究方法，以植物細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)體系，大量篩選擬定目標(biāo)的突變體，來改變植物遺傳性狀的一種方法。也就是說把植物細(xì)胞培養(yǎng)在附加一定化學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)基上，用生物化學(xué)的方法，從細(xì)胞水平上大量篩選似定目標(biāo)的突變體。第30頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

二、植物細(xì)胞突變體篩選的發(fā)展由來以細(xì)胞培養(yǎng)物作為操作對(duì)象進(jìn)行突變體篩選研究是和組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展密切關(guān)聯(lián)的。上世紀(jì)五十年代末期，揭示植物細(xì)胞全能性的技術(shù)完成后，使突變體的篩選工作可以在細(xì)胞水平上進(jìn)行。以培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行突變體篩選研究工作始于1964年，由Tulecke(培萊克)首先從銀杏花粉培養(yǎng)物中分離出需要精氨酸的細(xì)胞突變體。

1970年，Carlson（卡爾森）、Heimer（海曼）和Binding（賓迪）等人分別從煙草和矮牽牛的細(xì)胞中分離出幾種營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞及抗蘇氨酸和抗鏈霉素的細(xì)胞突變體，才逐漸拉開了篩選和利用細(xì)胞突變體研究之惟幕。第31頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

二、植物細(xì)胞突變體篩選的發(fā)展由來此后二十余年來，不斷報(bào)道了具有各種明確目的性的細(xì)胞突變體的篩選研究，主要是各種抗性細(xì)胞突變體的篩選，如抗病、抗除草劑、抗（鹽堿、酸壤、重金屬離子、干旱、低溫等）逆境的各種細(xì)胞突變體、營養(yǎng)缺陷型以及為提高細(xì)胞氨基酸的含量而進(jìn)行抗氨基酸及其類似物的細(xì)胞突變體的篩選等等。至80年代，由于對(duì)篩選技術(shù)及表型變異傳遞規(guī)律和機(jī)理均有較深入的研究。因此，細(xì)胞突變體的研究獲得幾百個(gè)抗性變異株，分別屬于14個(gè)科的44個(gè)種選擇出來的211種表型（表14-5），其中各個(gè)種總共90個(gè)變異系表型能再生植株。第32頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

二、植物細(xì)胞突變體篩選的發(fā)展由來可以認(rèn)為，高等植物細(xì)胞突變體的篩選與利用的研究，是離體培養(yǎng)技術(shù)高度發(fā)展與細(xì)胞工程和分子遺傳學(xué)高度結(jié)合的產(chǎn)物，是植物生物工程中創(chuàng)建新種質(zhì)資源的一個(gè)組成部分。第33頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

三、利用培養(yǎng)的細(xì)胞誘變與篩選突變體的優(yōu)缺點(diǎn)1、優(yōu)越性：（3點(diǎn)）（1）該系統(tǒng)提供大量可供選擇各種變異類型的群體，篩選方便。例如，在一個(gè)培養(yǎng)皿中可以也容易培養(yǎng)與處理5×105個(gè)細(xì)胞并從中篩選突變體，倘若在大田中種植相同數(shù)量的植株則需要0.6公頃的土地。（Scoworoft,1978）（2）誘變效率高，篩選的時(shí)間短。用植物細(xì)胞，特別是單倍體細(xì)胞，在細(xì)胞水平上直接誘發(fā)與篩選植物細(xì)胞突然襲擊變體，不僅能應(yīng)用微生物誘變與篩選的技術(shù)快速獲得突變體，還能防止與限制形成嵌合體。有時(shí)可達(dá)到幾乎是同質(zhì)的水平。第34頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

三、利用培養(yǎng)的細(xì)胞誘變與篩選突變體的優(yōu)缺點(diǎn)

例如，WEBER和Lark(1979)僅7天就從大豆培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出抗8-氮鳥嘌呤的突變體，而且從單倍體細(xì)胞還能較容易地篩選出隱性的突變。（3）整體植物各種突變體是以觀察可見特征為手段而鑒別。當(dāng)突變是某些特異性無化功能改變時(shí)，一般不能進(jìn)行有目的選擇，因此在植株水平上研究突變的分子基礎(chǔ)難以實(shí)現(xiàn)，只有在培養(yǎng)的細(xì)胞中選擇突變體才有利于研究突變的分子基礎(chǔ)。還可以從細(xì)胞突變體的細(xì)胞學(xué)與生物化學(xué)變化一直研究到再生植株性狀的遺傳與變異。第35頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

三、利用培養(yǎng)的細(xì)胞誘變與篩選突變體的優(yōu)缺點(diǎn)2、不利處：（3點(diǎn)）（1）在細(xì)胞水平上篩選的突變不一定都能在植物水平上表達(dá)；（2）與微生物相比，植物細(xì)胞群體增殖速率慢得多，需時(shí)長；（3）除原生質(zhì)體和花粉粒外，難以得到完全是單細(xì)胞的材料?？梢哉J(rèn)為，高等植物細(xì)胞突變體的篩選與利用之研究，是離體培養(yǎng)技術(shù)高度發(fā)展與細(xì)胞工程和分子遺傳學(xué)高度結(jié)合的產(chǎn)物，是植物生物工程中創(chuàng)建新種質(zhì)資源的一個(gè)組成部分。第36頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

四、離體培養(yǎng)細(xì)胞突變體的判斷標(biāo)準(zhǔn)和分類

篩選出來的變異是能遺傳的變異，抑或是性狀不穩(wěn)定的后生改變（epigenetixchanges），這是突變性篩選方面必須搞清楚的問題。1、判斷標(biāo)準(zhǔn)：以Widholm(1977)和Maliga(1976)提出的判斷標(biāo)準(zhǔn)綜合為4點(diǎn)：（1）遺傳方式：變異性狀能通過再生植株有性傳遞給后代，這是突變最有力的證據(jù)。通常核DNA突變會(huì)產(chǎn)生孟德爾式分離，而葉綠體和線粒體DNA的突變則是母體遺傳方式。第37頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

四、離體培養(yǎng)細(xì)胞突變體的判斷標(biāo)準(zhǔn)和分類（2）變異的頻率：突變的頻率一般都低于10-5（多位點(diǎn)的突變除外）。（3）培養(yǎng)細(xì)胞在離開選擇劑后的穩(wěn)定性：在無選擇壓力的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2~3代后原有變異仍不消失者，否則不是突變。（4）具有與基因產(chǎn)物改變密切相關(guān)的生化機(jī)理：

例如：通過一種酶的氨基酸順序的改變，或是一種氨基酸生物合成控制酶改變了對(duì)有關(guān)氨基酸類似物的反饋敏感性等等，均可作為基因突變的證明。第38頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

四、離體培養(yǎng)細(xì)胞突變體的判斷標(biāo)準(zhǔn)和分類2、分類標(biāo)準(zhǔn)：（1）Jacobs等（1987）根據(jù)生化和遺傳基礎(chǔ)以及在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)獲得突變體進(jìn)行分類（表14-6，）第39頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二

標(biāo)準(zhǔn)

觀察到的類型

生化損傷代謝酶活力降低成失活酶調(diào)節(jié)性質(zhì)的改變酶活力提高核糖體的蛋白質(zhì)改變新蛋白質(zhì)合成

遺傳基礎(chǔ)核的變化基因突變（顯隱性的；單、二或多基因的基因擴(kuò)增轉(zhuǎn)位活動(dòng)染色體重排細(xì)胞質(zhì)的變化細(xì)胞器基因組改變

有農(nóng)業(yè)價(jià)值的改變性狀營養(yǎng)質(zhì)量抗脅（溫度、干旱、水澇、鹽、有毒金屬和污染物、除草劑、病原體和害蟲）碳的有效利用營養(yǎng)物的有效攝取和利用表培養(yǎng)細(xì)胞突變體分類標(biāo)準(zhǔn)（引自Jacobs等，1987）

第40頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

四、離體培養(yǎng)細(xì)胞突變體的判斷標(biāo)準(zhǔn)和分類（2）繆樹華（1990）根據(jù)分離突變體的程序（或方法）對(duì)突變體進(jìn)行分類（表14-7）按分離突變體的程序（或方法）對(duì)突變體的分類（引自繆樹華，1990）第41頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二抗性突變體

氨基酸和氨基酸類似物抗性突變體

除草劑抗性突變體

鹽或不同金屬離子抗性突變體植物病毒素抗性突變體

抗菌素抗性突變體

氯酸鹽和烯丙醇抗性突變體抗激素、冷凍和紫外光抑制作用的突變體抗嘌呤和嘧啶類似物的突變體

條件致死突變體營養(yǎng)突變體需要含氮堿基的突變體

氨基酸營養(yǎng)缺陷型需要維生素和其它生長因子的營養(yǎng)突變體

溫度敏感和不能利用某種糖作唯一碳源的突變體表按分離突變體的程序（或方法）對(duì)突變體的分類

（引自繆樹華，1990）第42頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

五、細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選（一）細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選的基本程序1、預(yù)處理（制備單細(xì)胞）2、預(yù)培養(yǎng)3、反饋誘發(fā)突變4、高抗、高產(chǎn)細(xì)胞株的選擇5、細(xì)胞增殖與器官建成6、突變株系的鑒定和遺傳分析第43頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二預(yù)處理

預(yù)培養(yǎng)（懸浮或平板培養(yǎng)）反饋誘發(fā)突變（平板培養(yǎng)）高抗高產(chǎn)細(xì)胞株選擇（平板培養(yǎng)）

愈傷組織增殖或再生植株突變株鑒定（1）材料選擇：?jiǎn)渭?xì)胞、原生質(zhì)體、愈傷組織（2）預(yù)處理：篩選誘變劑、濃度和預(yù)處理時(shí)間（1）方式：平板培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)（2）細(xì)胞密度因作物而定（3）預(yù)培養(yǎng)時(shí)間2周，恢復(fù)細(xì)胞活力（1）采用平板法（2）加入選擇因子反復(fù)培養(yǎng)數(shù)代（3）脫除選擇因子培養(yǎng)（一、兩代）（1）加入選擇因子再培養(yǎng)數(shù)周（2）按目的（品質(zhì)、抗性、高產(chǎn)）測(cè)定進(jìn)行選擇（1）采用花粉培養(yǎng)需染色體加倍（0.2%~0.4%秋水仙素）（2）原生質(zhì)體需胞壁再生（3）調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分采用固體培養(yǎng)（1）初步鑒定：細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)鑒定（2）植株進(jìn)行抗性測(cè)定和遺傳分析圖：植物細(xì)胞突變體誘發(fā)和篩選程序示意圖第44頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

五、細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選（一）細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選的基本程序1、預(yù)處理（制備單細(xì)胞）（1）材料選擇：用于突變體篩選的最理想的材料為單細(xì)胞，或原生質(zhì)體。也可用莖尖、腋芽等，但容易誘發(fā)嵌合體。但由單細(xì)胞成原生質(zhì)體再生成植株的植物種類僅限于少數(shù)，因而在廣泛使用上受到限制。為此目前用得最多的材料是愈傷組織。因?yàn)椋孩儆鷤M織介于單細(xì)胞和具有一定結(jié)構(gòu)的組織之間的組織；②愈傷組織是分生細(xì)胞容易誘發(fā)突變。③愈傷組織分散性好，借助酶處理分散性更好。第45頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

五、細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選（2）預(yù)處理：采用誘變劑進(jìn)行化學(xué)誘變處理，根據(jù)植物種類需對(duì)誘變劑的濃度、時(shí)間進(jìn)行篩選，選用最適濃度、最適處理時(shí)間方可收到良好的效果。

例如：煙草高蛋氨酸突變體篩選，以EMS（甲基磺酸乙酯）為誘變劑，濃度為0.25%，預(yù)處理時(shí)間為1h；水稻高賴氨酸突變體篩選以EMS為誘變劑，濃度為1%，預(yù)處理時(shí)間為1h。（3）制備細(xì)胞懸浮液：經(jīng)預(yù)處理的材料用糖液洗凈備用。如材料是愈傷組織，需借取酶處理。同樣經(jīng)過過濾、離心沉降，最后獲得純凈的細(xì)胞懸浮液。第46頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

五、細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選2、預(yù)培養(yǎng)單細(xì)胞或愈傷組織經(jīng)誘變劑處理和酶處理后活力下降，為恢復(fù)細(xì)胞活力必須進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)可采用平板培養(yǎng)法，亦可采用懸浮培養(yǎng)法，無法哪種方法均需考慮細(xì)胞起始密度。

預(yù)培養(yǎng)時(shí)間因植物種類而異。煙草平板培養(yǎng)法，預(yù)培養(yǎng)2周。水稻懸浮培養(yǎng)法，預(yù)培養(yǎng)10d。第47頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

五、細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選3、反饋誘發(fā)突變

誘發(fā)突變一般采用平板培養(yǎng)法，并在培養(yǎng)基中加入某種選擇因子，長時(shí)間飼喂培養(yǎng)植物細(xì)胞，使其發(fā)生擬定目標(biāo)的突變，反復(fù)飼喂需數(shù)月時(shí)間。4、高抗、高產(chǎn)細(xì)胞株的選擇將在具有選擇因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)月的細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)入不加選擇因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，脫除選擇因子。經(jīng)數(shù)周后再轉(zhuǎn)入具有選擇因子的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)數(shù)周后選擇能旺盛分裂的細(xì)胞團(tuán)（細(xì)胞株），說明該細(xì)胞團(tuán)具有抗某種選擇因子的突變細(xì)胞株。第48頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

五、細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選5、細(xì)胞增殖與器官建成如果采用的材料是單倍體細(xì)胞，則可在分化培養(yǎng)基中，加入秋水仙素，誘發(fā)染色體加倍。分化出來的植株是正常可育二倍體。如果采用的材料是原生質(zhì)體，尚需按原生質(zhì)體培養(yǎng)程序，誘導(dǎo)細(xì)胞壁再生，然后器官分化，植株再生。如果采用的是體細(xì)胞愈傷組織，則按正常的方法誘導(dǎo)愈傷組織分化，植株再生。第49頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

五、細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選6、突變株系的鑒定和遺傳分析（1）根據(jù)誘發(fā)突變目標(biāo)進(jìn)行生化分析（2）細(xì)胞學(xué)觀察（3）性狀分析（田間性狀觀察）分析突變是屬于遺傳的變異（基因突變），還是屬于非遺傳的變異（表型變異）。第50頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選

五、細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選（二）誘變劑及其作用1、常用的誘變劑種類因誘發(fā)突變包括物理誘變和化學(xué)誘變。所以誘變劑也包括物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。（1）常用的物理誘變劑：主要為各種射線，包括：x射線、r射線、中子（快、慢、熱中子）、a粒子、β粒子、紫外線等。

紫外線是使用最廣泛、最有效的誘變劑，在無菌條件下（超凈工作臺(tái)）用紫外燈照射處理即可。但應(yīng)注意為避免DNA的光修復(fù)、降低誘變頻率，紫外線處理后必須在黑暗條件下培養(yǎng)。第51頁，共58頁，2023年，2月20日，星期二

種類

發(fā)生源

能量誘入組織能力x射線x光發(fā)生機(jī)50-300千伏幾毫米至幾厘米r射線放射性同位素60Co，137Cs幾百萬電子伏很多厘米中子加速器或核反應(yīng)堆小于1電子伏至幾百萬電子伏