電泳離心的教案

電泳離心的教案第1頁/共126頁電泳的含義

帶電粒子在電場中向其所帶電荷相反的電極移動，稱為電泳。

電泳的應(yīng)用

1.分離各種有機物：如蛋白質(zhì)、酶、核酸等

2.分析某種物質(zhì)的純度及分子量第2頁/共126頁電泳原理與技術(shù)第一節(jié)電泳的基本原理第二節(jié)電泳的基本裝置第三節(jié)電泳支持物第四節(jié)電泳后的固定、染色和脫色第五節(jié)結(jié)果的記錄與定量分析第3頁/共126頁pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pIamphoteric

cationanion第一節(jié)電泳的基本原理第4頁/共126頁

不同的帶電顆粒在同一電場中的泳動速度不同，常用遷移率表示。

電泳遷移率是指特定類型的分子在電場中的移動速度。

帶電荷分子在電泳過程中的遷移率主要取決于以下幾個方面：

1.電場強度

2.顆粒本身性質(zhì)的影響

3.凈電荷

4.溶液的離子強度

第5頁/共126頁1.電場強度電場強度是指每一厘米的電位降，又稱為電位梯度或電勢梯度。電場強度越高，帶電顆粒的泳動速度越快。反之，則越慢。根據(jù)電場強度（電壓的高低）大小，將電泳分為:常壓電泳（100－500V）：電場強度2－10V/cm，多用于分離大分子物質(zhì)。高壓電泳（500－10000V）：電場強度70－200V/cm，常需冷卻裝置。高壓電泳時間短，有時僅需數(shù)分鐘，多用于分離小分子物質(zhì)。

第6頁/共126頁2.顆粒本身性質(zhì)的影響顆粒大小：摩擦阻力阻礙分子在液體中移動，分子越小，在電場中移動的速度越快；摩擦阻力的效應(yīng)也說明分子的形狀同樣影響分子的遷移。如：球蛋白與纖維狀蛋白相比；線狀DNA與環(huán)狀DNA相比。第7頁/共126頁3.凈電荷在電場中，推動帶電質(zhì)點運動的力（F）等于質(zhì)點所帶凈電荷量（Q）與電場強度（E）的乘積。F＝QE

質(zhì)點的前移同樣要受到阻力（F）的影響，對于一個球形質(zhì)點，服從Stoke定律，即：F′＝6πrην當質(zhì)點在電場中作穩(wěn)定運動時：F＝F′

即：QE＝6πrηνEQfQEghnπ6==第8頁/共126頁4.溶液的離子強度溶液的離子強度越高，顆粒泳動速度越慢，反之越快。是因為離子強度過高，在待分離分子周圍形成較強的帶相反電荷的離子擴散層（即離子氛），降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳速度減慢。一般所用離子強度為0.02～0.2之間。第9頁/共126頁第二節(jié)電泳的基本裝置第10頁/共126頁第三節(jié)電泳支持物1.惰性支持物：這些支持物提供了物理的支持，降低了對流，分離的效果只取決于分子電荷密度。2.多孔支持物：這種支持物同時利用了分子篩效應(yīng)，孔的大小與被分離分子的大小順序相對應(yīng)，大分子相對于小分子來說，在移動過程中受到的阻力較大。分離的效果取決于電荷密度和分子大小兩個因素。第11頁/共126頁負極正極－－－－－－－－表面帶負電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負極移動

如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋

生物化學教研室朱欣婷以紙電泳為例:第12頁/共126頁第四節(jié)電泳后的固定、染色和脫色醋酸纖維素薄膜中的蛋白質(zhì)：麗春紅S的三氯醋酸加以染色和固定凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)：三氯醋酸固定，考馬斯亮藍染色雙向電泳：銀染核酸：溴化乙錠（EB）檢測蛋白質(zhì)：32P和125I標記后放射自顯影；熒光染料標記第13頁/共126頁第五節(jié)結(jié)果的記錄與定量分析一、等電聚焦電泳（IFE)二、雙向電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）四、轉(zhuǎn)移電泳五、毛細管電泳六、脈沖場凝膠電泳七、免疫電泳第14頁/共126頁一、等電聚焦電泳（IFE)第15頁/共126頁二、雙向電泳是等電聚焦電泳和SDS的組合，根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷，以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，在一個方向上進行等電聚膠電泳（按照pI分離），然后利用樣品分子的相對分子質(zhì)量的不同（按照分子大?。?，在另一方向上進行SDS，經(jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖。第16頁/共126頁雙向電泳（2DE）示意圖提取的總蛋白溶液等電聚焦，實現(xiàn)蛋白質(zhì)按等電點進行分離SDS分離，使得蛋白質(zhì)按分子量大小排序分子量大小通過雙向電泳使得不同等電點和分子量的蛋白質(zhì)根據(jù)其自身特性分布到凝膠的不同位置從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的雙向分離第17頁/共126頁硝酸銀染色圖譜考馬斯亮藍染色圖譜第18頁/共126頁三、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）1、PAG的組成PAG是由丙烯酰胺單體（acrylamide，Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉丙烯酰胺（N，N’-methylenebixacrylamide，Bis）在催化劑過硫酸銨或核黃素作用下聚合交聯(lián)而成的多孔三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)。Acr+Bis

多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)第19頁/共126頁

2.PAG的濃度與孔徑的關(guān)系

PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定?？梢愿鶕?jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的單體濃度。Acr/Bis：20-40完全透明且有彈性；＜10很脆，易碎，不透明；＞100糊狀不成形，易破碎。第20頁/共126頁

凝膠總濃度T——100ml凝膠溶液中含有Acr和

Bis的總克數(shù)。T=（a+b）/m×100%T越大，凝膠孔徑越小，適用于分離分子量較小的物質(zhì)。

T越小，凝膠孔徑越大，適用于分離分子量較大的物質(zhì)。

第21頁/共126頁

3.分子篩效應(yīng)與電荷效應(yīng)

進入分離膠后，Gly-成為快離子分離膠只有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，根據(jù)各蛋白質(zhì)所帶電荷不同、分子大小不同而分離。第22頁/共126頁第23頁/共126頁第24頁/共126頁

4.PAGE的特點1.具有分子篩效應(yīng)，分辨率高2.樣品不易擴散，用量少，靈敏度可達10-6g3.化學性質(zhì)穩(wěn)定，分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基具有穩(wěn)定的親水基團4.凝膠不帶電荷，消除了電滲現(xiàn)象5.機械強度好，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無色透明6.網(wǎng)孔可調(diào)節(jié)第25頁/共126頁四、轉(zhuǎn)移電泳把凝膠電泳后的各種生物大分子從凝膠通過電泳方法轉(zhuǎn)移到一種固定基質(zhì)上的過程稱為印跡技術(shù)（Blotting）。

Southern在1975年首先提出了分子印漬的概念。他將瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA片段在凝膠中進行變性使其成為單鏈，然后將一張硝酸纖維素(NC)膜放在凝膠上，上面放上吸水紙巾，利用毛細管作用原理使凝膠中的DNA片段轉(zhuǎn)移到NC膜上，使之成為固相化分子。載有DNA單鏈分子的NC膜就可以在雜交液與另一種帶有標記的DNA或RNA分子(即探針)進行雜交，具有互補序列的RNA或DNA結(jié)合到存在于NC膜的DNA分子上，經(jīng)放射自顯影或其他檢測技術(shù)就可以顯現(xiàn)出雜交分子的區(qū)帶。由于這種技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。第26頁/共126頁SouthernBlotting原理第27頁/共126頁五、毛細管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)

定義：是指以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間分子量的大小、形狀和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。

1.毛細管區(qū)帶電泳

2.毛細管凝膠電泳

3.膠束電動毛細管色譜第28頁/共126頁毛細管電泳的基本裝置

基本裝置是一根充滿電泳緩沖液的毛細管和與毛細管兩端相連的兩個小瓶微量樣品從毛細管的一端通過“壓力”或“電遷移”進入毛細管。電泳時，與高壓電源連接的兩個電極分別浸人毛細管兩端小瓶的緩沖液中。樣品朝與自身所帶電荷極性相反的電極方向泳動。各組分因其分子大小、所帶電荷數(shù)、等電點等性質(zhì)的不同而遷移速率不同，依次移動至毛細管輸出端附近的光檢測器，檢測、記錄吸光度，并在屏幕上以遷移時間為橫坐標，吸光度為縱坐標將各組分以吸收峰的形式動態(tài)直觀地記錄下來。第29頁/共126頁六、脈沖場凝膠電泳原理：大分子DNA(一般超過20kb)在電場作用下通過孔徑小于分子大小的凝膠時，將會改變無規(guī)卷曲的構(gòu)象，沿電場方向伸直，與電場平行從而才能通過凝膠。此時，大分子通過凝膠的方式相同，遷移率無差別，不能分離。脈沖場凝膠電泳技術(shù)解決了這一難題，它應(yīng)用于分離純化大小在10～2000kb之間的DNA片段。這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間顯著地依賴于分子大小，DNA越大，這種構(gòu)象改變需要的時間越長，重新定向的時間也越長，于是在每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少，因而在凝膠中移動越慢。反之，較小的DNA移動較快，于是不同大小的分子被成功分離。在許多實用的PFGE方法中，倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳是最簡單最常用的方法(FIGE)。通過把一個在不同電場方向有不同脈沖方式的脈沖電場加在樣品上，倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳(FIGE)設(shè)備能把大小范圍在10～2000kb的DNA片段分開。FIGE也可通過重新確定一個對準完全固定好角度的電場，這樣會進一步擴展其分離極限達到10Mb。第30頁/共126頁七、免疫電泳把電泳技術(shù)與免疫擴散結(jié)合起來，叫做免疫電泳。免疫電泳技術(shù)是將瓊脂電泳與免疫擴散相結(jié)合的一種常用的免疫學實驗方法，由Crabar與Williams于1953年創(chuàng)立，此項技術(shù)由于具有抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，電泳分離技術(shù)的快速，靈敏和高分辨力，以及實驗設(shè)備和操作簡便等優(yōu)點，至今仍作為免疫學的一種基本技術(shù)，廣泛用于科學研究和臨床實驗診斷。數(shù)十年來，根據(jù)不同的實驗?zāi)康暮鸵?，在?jīng)典的免疫電泳技術(shù)基礎(chǔ)上，又衍生出對流免疫電泳、火箭電泳、交叉免疫電泳及免疫固定電極等許多新技術(shù)和新方法出現(xiàn)。

。第31頁/共126頁1.免疫電泳（IEP）優(yōu)點：一是加快了反應(yīng)的速度；二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細微的分析。應(yīng)用：①研究抗原抗體的相對應(yīng)性；②測定樣品的各成分及它們的電泳遷移率；③根據(jù)蛋白質(zhì)的電泳遷移率、免疫特性及其他特性，可以確定復合物中的蛋白質(zhì)；④鑒定抗原或抗體的純度七、免疫電泳第32頁/共126頁免疫電泳結(jié)果分析（1）常見的沉淀弧①交叉?。罕硎緝煽乖煞值倪w移率相近，但抗原性不同；②平行?。罕硎緝蓚€不同的抗原成分，它們的遷移率相同，但擴散率不同；③加寬?。阂话闶怯捎诳乖^量所致；④分枝?。阂话闶怯捎诳贵w過量；⑤沉淀線中間逐漸加寬并接近抗體槽，一般由于抗原過量，在白蛋白位置處形成；⑥其他還有彎曲弧、平坦弧、半弧等。第33頁/共126頁（2）沉淀弧的曲度（3）沉淀的清晰度沉淀線的清晰度與抗原抗體的特異性程度有關(guān)，也與抗體的來源有關(guān)。（4）沉淀弧的位置高分子量的物質(zhì)擴散慢，所形成的沉淀線離抗原孔較近；而分子量較小的物質(zhì)，擴散快，沉淀弧離抗體槽近一些?？乖瓭舛雀?，沉淀弧偏近抗體槽；反之，抗體濃度高，沉淀弧偏近抗原孔。第34頁/共126頁2.火箭免疫電泳（rocketimmunoelectrophoresis，RIEP）RIEP是將單向免疫擴散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測技術(shù)。電泳時，含于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動，而在電場的作用下促使樣品中的抗原向正極泳動。當抗原與抗體分子達到適當比例時，形成一個形狀如火箭的不溶性免疫復合物沉淀峰，峰的高度與樣品中的抗原濃度呈正相關(guān)。因此，當瓊脂中抗體濃度固定時，以不同稀釋度標準抗原泳動后形成的沉淀峰為縱坐標，抗原濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據(jù)樣品的沉淀峰長度即可計算出待測抗原的含量；反之，當瓊脂中抗原濃度固定時，便可測定待測抗體的含量(即反向火箭免疫電泳)。第35頁/共126頁3.對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)

CIEP是將雙向免疫擴散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。在pH8.6的緩沖液中，蛋白質(zhì)抗原帶負電荷向正極泳動；而抗體大部分屬Ig，由于分子量大，暴露的極性基團較少，在離子瓊脂中泳動緩慢，同時受電滲作用的影響向負極泳動。在抗原抗體相遇的最適比例處形成乳白色沉淀線。由于電場的作用，限制了抗原、抗體的自由擴散，而使其定向泳動，因而增加了試驗的靈敏度，并縮短反應(yīng)時間。此法操作簡便，僅需30～60分鐘，靈敏度比雙向擴散高10～15倍；但缺點是特異性不如雙向瓊脂擴散高。第36頁/共126頁4.免疫固定電泳

該法原理類似免疫電泳，不同之處是將血清直接加于電泳后蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，或?qū)⒔锌寡宓臑V紙貼于其上，抗原與對應(yīng)抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，形成的復合物嵌于固相支持物中。將未結(jié)合的游離抗原或抗體洗去，則出現(xiàn)被結(jié)合固定的某種蛋白。第37頁/共126頁名詞解釋1.遷移率2.電滲3.電泳問答題1.影響電泳遷移率的因素有哪些？2.試述瓊脂糖凝膠電泳分離脂蛋白的原理。復習思考題第38頁/共126頁參考書目《臨床生物化學及生物化學檢驗》第三版人民衛(wèi)生出版社周新主編《電泳》科學出版社何忠效張樹政主編《蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)》科學出版社郭堯君《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》科學出版社汪家政范敏主編第39頁/共126頁離心原理與技術(shù)第40頁/共126頁

離心技術(shù)是利用旋轉(zhuǎn)運動產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差別進行物質(zhì)的分析、分離、濃縮和提純的一種技術(shù)。主要用于分離、純化樣品及對已純化的樣品進行結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析。第41頁/共126頁

離心機（centrifuge）是實施離心技術(shù)的裝置。它主要用于將懸浮液中的固體顆粒與液體分開；或?qū)⑷闈嵋褐袃煞N密度不同，又互不相溶的液體分開（例如從牛奶中分離出奶油）；它也可用于排除濕固體中的液體，例如用洗衣機甩干濕衣服；特殊的超速管式分離機還可分離不同密度的氣體混合物；利用不同密度或粒度的固體顆粒在液體中沉降速度不同的特點，有的沉降離心機還可對固體顆粒按密度或粒度進行分級。第42頁/共126頁

離心技術(shù)的應(yīng)用

1.用于工業(yè)生產(chǎn)的，如化工、制藥、食品等

工業(yè)大型制備用的離心技術(shù)，轉(zhuǎn)速都在

每分鐘5000轉(zhuǎn)以下。

2.用于生物、醫(yī)學、化學等實驗室分析研究

的，轉(zhuǎn)速從每分鐘幾千到幾萬轉(zhuǎn)以上，此

類技術(shù)的使用目的在于分離和純化樣品，

以及對純化的樣品有關(guān)性能進行研究。第43頁/共126頁內(nèi)容：第一節(jié)離心技術(shù)的基本原理第二節(jié)離心設(shè)備第三節(jié)常用離心方法及應(yīng)用第44頁/共126頁第一節(jié)離心技術(shù)的基本原理一、離心的一般原理二、離心力和相對離心力三、沉降速度四、沉降系數(shù)五、沉降時間六、測定相對分子量第45頁/共126頁1.離心力（Centrifugalforce，F(xiàn)）：是指懸浮顆粒在離心過程中所受的離開旋轉(zhuǎn)中心軸的作用力。

F=ma=mω2r

F:離心力（g.cm/s2或達因）

m:顆粒質(zhì)量

a:加速度

ω:旋轉(zhuǎn)角速度

r：旋轉(zhuǎn)體離旋轉(zhuǎn)軸的距離

n:每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)

ω=(rad/sec)

2πn60一.基本原理第46頁/共126頁2.相對離心力

Relativecentrifugalforce(RCF)

RCF就是在離心場中顆粒所受的離心力相當于它受到的地球重力的倍數(shù)，稱為重力加速度。

RCF=F離心力/F重力

=mω2r/mg=ω2r/g

g為重力加速度（980cm/sec2)

第47頁/共126頁

若用

2πn

ω=(rad/sec)

60

(2πn/60)2

RCF=xr

980

=1.119×10-5n2r

n：轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)(rpm)

第48頁/共126頁RCF=1.119×10-5n2rRCF=1.119×10-5×(12000)2×3.8=6123gRCF=1.119×10-5×(12000)2×8.1=13052g第49頁/共126頁Dole&Cotzias制作了轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應(yīng)的離心力列線圖。第50頁/共126頁dx2r2(ρp-ρm)

V==.ω2X

dt9η

d2(ρp-ρm)

=.ω2X

18η

r：球形粒子的半徑d：球形粒子的直徑

η：流體介質(zhì)的粘度數(shù)ρp：粒子的密度

ρm：介質(zhì)的密度

(1)定義：指在強大離心作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。3.沉降速度Sedimentationvelocity第51頁/共126頁ρp-ρm=0即ρp=ρmV=0S=0

粒子平衡

ρp-ρm>0即ρp>ρmV>0S>0

粒子達到某一位置后就達到平衡

ρp-ρm<0即ρp<ρm1V<0S<0

粒子逆著離心方向上浮

第52頁/共126頁4.沉降系數(shù)Sedimentationcoefficient(S)

樣品沉降率

樣品顆粒的大小

形狀

密度

溶劑的粘度、密度

離心加速度

第53頁/共126頁

在一般情況下，樣品的沉降特征可以用沉降系數(shù)來表示:

S是指單位離心場中粒子移動的速度。

沉降速度V

S===

單位離心力ω2rdx/dtω2rS在實際應(yīng)用時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。第54頁/共126頁

5.沉降時間(SedimentationTime,Ts)

dx/dt

S=

2X

1dx

dt=

2SX

1lnX2/X1

積分得t2-t1=·

S2

第55頁/共126頁X2為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離;

X1為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離,

樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時間(t2-t1)用Ts表示則式可改為

1lnXmax-lnXmin

Ts=·

S2

Ts以小時為單位,S以Svedberg為單位。

第56頁/共126頁第二節(jié)離心設(shè)備一、離心機二、離心機的基本構(gòu)造三、離心轉(zhuǎn)頭四、離心管五、離心機使用注意事項第57頁/共126頁一、離心機第58頁/共126頁離心機的基本構(gòu)造驅(qū)動電機、制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、顯示系統(tǒng)、自動保護系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、光學檢測系統(tǒng)（分析型）必要配件：轉(zhuǎn)頭和離心管第59頁/共126頁

1.低速離心機

轉(zhuǎn)子

電動機

轉(zhuǎn)子帶有放置離心管的孔

轉(zhuǎn)子的中央位于離心機的驅(qū)動軸上

離心機的轉(zhuǎn)速和溫度控制不夠準確

一般最高轉(zhuǎn)速在6,000rpm以下

實驗室中常用于分離制備。第60頁/共126頁

2.高速離心機

制冷設(shè)備溫度控制在0-4℃范圍內(nèi)

制動器

實際速度和溫度可通過儀表顯示

配有一定類型及規(guī)格的轉(zhuǎn)子

最高轉(zhuǎn)速在25,000rpm以下

常用于生物大分子的分離制備第61頁/共126頁

第62頁/共126頁第63頁/共126頁3.超速離心機

驅(qū)動和速度控制

溫度控制

真空系統(tǒng)

轉(zhuǎn)子

1)測定生物大分子和高聚化合物的沉降系數(shù)和相對分子量

2）研究生物大分子的大小、形狀及締合、離解和降解等

3）追蹤生物大分子的提純過程，鑒定其均一程度、組成和濃度等。

4）選擇合適的溶液密度超速上浮血漿脂蛋白，以分離提純血漿脂蛋白，并測定其上浮速率Sf值

5）發(fā)現(xiàn)異常的血漿脂蛋白成分第64頁/共126頁第65頁/共126頁第66頁/共126頁（二）.轉(zhuǎn)子(Rotor)

固定角式轉(zhuǎn)子(fixed-anglerotor)

水平轉(zhuǎn)子(swing-outrotor)

垂直轉(zhuǎn)子(verticalrotor)

帶狀轉(zhuǎn)子(zonalrotor)

連續(xù)轉(zhuǎn)子(continuousrotor)

第67頁/共126頁轉(zhuǎn)子的材質(zhì)：

鋁質(zhì)較輕,耐受強度較弱,適合在較低

的轉(zhuǎn)速下使用;

不銹鋼耐受強度最好,但材質(zhì)本身太重；

鈦合金耐受強度不錯,重量也比不銹鋼輕。

第68頁/共126頁1.水平轉(zhuǎn)子

（1）轉(zhuǎn)子靜止時,處在轉(zhuǎn)子中的離心管中

心線與旋轉(zhuǎn)軸平行,

（2）轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時,離心管中心線由

行位置逐漸過渡到垂直位置,即與旋

轉(zhuǎn)軸成90°角,

（3）粒子的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基本

一致有少量的“管壁效應(yīng)”

第69頁/共126頁第70頁/共126頁第71頁/共126頁第72頁/共126頁

水平轉(zhuǎn)子的特點：

（1）轉(zhuǎn)子的重心位置較高

（2）樣品粒子沉降穿過溶劑層的距離大于

直徑

（3）對于多種成分樣品分離特別有效

（4）常用于速率區(qū)帶離心和等密度離心第73頁/共126頁

2.固定角式轉(zhuǎn)子

離心管在離心機中放置的位置與旋轉(zhuǎn)軸心形成一個固定的角度,角度變化在14-40°之間。

常見的角度

20°

28°

34°

40第74頁/共126頁第75頁/共126頁第76頁/共126頁第77頁/共126頁角式轉(zhuǎn)子的特點：

（1）重心低,轉(zhuǎn)速可較高

（2）樣品粒子穿過溶劑層的距離略大于

離心管的直徑;

（3）“管壁效應(yīng)”：

有一定的角度,在離心過程中撞到

離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形

成沉淀,此效應(yīng)使最后在管底聚成的沉

淀較緊密。

第78頁/共126頁

設(shè)40000rpm時R1最小、3.8cmR2平均、5.9cmR3最大、8.1cmRCF值分別67,910g、105,400g、144,700gR1R2R3

在離心管的不同部位距旋轉(zhuǎn)中心軸的距離也不同,那么在一定的轉(zhuǎn)速下其RCF值也各不相同第79頁/共126頁3.垂直轉(zhuǎn)子

離心管垂直插入轉(zhuǎn)子孔內(nèi),在離心過程中始終與旋轉(zhuǎn)軸平行,而離心時液層發(fā)生90°角的變化,從開始的水平方向改成垂直方向,當轉(zhuǎn)子降速時,垂直分布的液層又逐漸趨向水平,待旋轉(zhuǎn)停止后,液面又完全恢復成水平方向。

第80頁/共126頁四、離心管材料：玻璃（低速）、塑料、不銹鋼（高速、超速）第81頁/共126頁五、離心機使用注意事項1、離心要平穩(wěn)2、平衡3、低檔啟動4、合適的轉(zhuǎn)頭和轉(zhuǎn)速5、干燥清潔6、按需選用離心管7、低溫離心樣品需預冷8、異常情況，停機檢查9、校正第82頁/共126頁第三節(jié)常用離心方法及應(yīng)用第83頁/共126頁(一).差速離心法

1、原理

利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別,在同一離心條件下,沉降速度不同,通過不斷增加相對離心力,使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。

操作過程中一般是在離心后傾倒的辦法把上清液與沉淀分開,然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心,分離出第二部分沉淀,如此往復加高轉(zhuǎn)速,逐級分離出所需要的物質(zhì)。

第84頁/共126頁

差速離心的分辨率不高,沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開,常用于其他分離手段之前的粗制品提取。2.注意點：

可用角式、水平式轉(zhuǎn)頭

可用剎車

難以獲得高純度

第85頁/共126頁

例用差速離心法分離已破碎的細胞各組份

已破碎的細胞

500g,10分鐘

沉淀上清液

(細胞核）10,000g,10分鐘

沉淀上清液

(細胞膜碎片,線粒體,)100,000g,3小時

溶酶體

沉淀上清液

(核糖核蛋白體）(可溶性成份)

第86頁/共126頁1.原理

離心前離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì),待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間,同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處(X1)的介質(zhì)密度最小,離旋轉(zhuǎn)軸最遠處(X2)介質(zhì)的密度最大,但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度,即ρp>ρm。這種方法是根據(jù)分離的粒子其在梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶,達到彼此分離的目的。(二).速率區(qū)帶離心法第87頁/共126頁

梯度液在離心過程中以及離心完畢后,取樣時起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用,避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。

由于ρp>ρm則S>0,該離心法的離心時間要嚴格控制,即有足夠的時間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶,又要控制在任一粒子達到沉淀前。

此法是一種不完全的沉降,沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大,一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。

第88頁/共126頁2.注意點：

嚴格控制離心時間

ρp>ρm

事先配成較平緩的連續(xù)密度的梯度溶液

不能用角式轉(zhuǎn)頭、只能用水平式轉(zhuǎn)頭

不能用剎車

第89頁/共126頁1原理

預先配制介質(zhì)的密度梯度（包含了被分離樣品中所有粒子的密度），樣品鋪在梯度液頂上或混合,離心開始后,梯度液受離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度,與此同時原來分布均勻的樣品粒子也發(fā)生重新分布。最后粒子進入到ρp=ρm,此時dx/dt為零粒子不再移動，粒子形成純組分的區(qū)帶。(三).等密度離心法第90頁/共126頁特點：

（1）與樣品粒子的密度有關(guān)

（2）與樣品粒子的大小和其他參數(shù)無關(guān)（3）轉(zhuǎn)速、溫度不變,則延長離心時間也

不能改變這些粒子的成帶位置。

第91頁/共126頁2.注意點：

離心時間要長

可用角式轉(zhuǎn)頭或水平式轉(zhuǎn)頭

粒子密度相近或相等時不宜用

密度梯度溶液中要包含所有粒子密度

不能用剎車

第92頁/共126頁四.

梯度溶液的制備

(一).梯度材料的選擇原則:

1、與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)。

2、可達到要求的密度范圍,且在所要求的密

度范圍內(nèi),粘度低,滲透壓低,離子強度和

pH變化較小。

3、不會對離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。

4、容易純化,價格便宜或容易回收。

5、濃度便于測定,如具有折光率。

6、對于分析超速離心工作來說,它的物理性

質(zhì),熱力學性質(zhì)應(yīng)該是已知的。

第93頁/共126頁常用的梯度材料：

.糖類:蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右

旋糖酐、糖原

無機鹽類:CsCl(氯化銫)、RbCl(氯化銣)、

NaCl、KBr等

有機碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等

硅溶膠:如Percoll。

蛋白質(zhì):如牛血清白蛋白

重水

非水溶性有機物:如氟代碳等

第94頁/共126頁(二).梯度材料的應(yīng)用范圍

1.蔗糖:

水溶性大

性質(zhì)穩(wěn)定

滲透壓較高

最高密度可達1.33g/ml,

價格低

容易制備,

常用于細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料

有較大的滲透壓,不宜用于細胞的分離。

第95頁/共126頁2.聚蔗糖:

商品名Ficoll,

滲透壓低

粘度卻特別高,為此常與泛影葡胺混合使用

以降低粘度

用于分離各種細胞包括血細胞、成纖維細

胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞

第96頁/共126頁3.氯化銫:

離子性介質(zhì)

水溶性大

最高密度可達1.91g/ml

重金屬鹽類,在離心時形成的梯度有較

好的分辨率

被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋

白的分離

價格較貴

第97頁/共126頁4.鹵化鹽類:

KBr和NaCl可用于脂蛋白分離

KI和NaI可用于RNA分離,其分辨率高于銫鹽NaCl梯度可用于分離脂蛋白

NaI梯度可分離天然或變性的DNA。

第98頁/共126頁5.Percoll:

SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮

滲透壓低

對生物材料的影響小

顆粒穩(wěn)定

在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的

粘度高

在酸性pH和高離子強度下不穩(wěn)定

用于細胞、細胞器和病毒的分離

第99頁/共126頁五.分析性超速離心

為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu),而不是專門收集某一特定組分。

它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測手段,以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程。

第100頁/共126頁(一).分析性超速離心的工作原理

橢圓形的轉(zhuǎn)子

一套真空系統(tǒng)

一套光學系統(tǒng)

轉(zhuǎn)子通過一個柔性的軸聯(lián)接成一個高速的驅(qū)動裝置,這軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時形成自己的軸。第101頁/共126頁轉(zhuǎn)子容納二個小室:

分析室

配衡室：經(jīng)過精密加工的金屬塊,作為分析

室的平衡用。

分析室：容量為1毫升,呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中。其有上下二個平面的石英窗,離心機中裝有的光學系統(tǒng)可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì),通過對紫外光的吸收或折射率的不同對沉降物進行監(jiān)視。第102頁/共126頁折射率原理:

當光線通過一個具有不同密度區(qū)的透明液時,在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。

在分析室中物質(zhì)沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個折射的透鏡,結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)生一“峰”。由于沉降不斷進行,界面向前推進,故“峰”也在移動,從峰移動的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標。

第103頁/共126頁(二).分析性超速離心的應(yīng)用

1.測定生物大分子的相對分子重量

沉降速度

沉降平衡

接近沉降平衡

沉降速度：超速離心在高速中進行,使得任意分布的粒子通過溶劑從旋轉(zhuǎn)的中心輻射地向外移動,在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個明顯的界面,該界面隨時間移動而移動,這就是粒子沉降速度的一個指標,然后用照像記錄,即可求出粒子的沉降系數(shù)。第104頁/共126頁

dx/dt

S=

2X

RTS

M=

D(1-)

M--該分子不含水的相對分子重量;

R--氣體常數(shù);

T--絕對溫度;

S--分子的沉降系數(shù);

--分子的微分比容(當一克溶質(zhì)加到一個大體積的溶液中所占有的體積;

--溶劑的密度。

第105頁/共126頁2.生物大分子的純度估計

3.分析生物大分子中的構(gòu)象變化

第106頁/共126頁第107頁/共126頁一、制備離心技術(shù)定義：指以分離純化生化物質(zhì)、細胞、亞細胞粒子為目的的離心技術(shù)。分類：一般制備離心技術(shù)：是指在分離、濃縮和純化樣品時，不必制備密度梯度的一次完成的離心操作技術(shù)。常用低速或高速離心機來完成，此法主要用于分離血清和沉淀細胞等。制備超速離心技術(shù)：是指在強大的離心力場作用下，依據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量和形狀不同，將混合物樣品中各組分分離提純的一種技術(shù)。

——差速沉降離心法密度梯度離心法第108頁/共126頁差速沉降離心法定義：是指在離心管內(nèi)液體密度均一的介質(zhì)中，對含兩種以上大小不同的待分離物質(zhì)的混合液采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分步驟離心沉淀，使之互相分離的離心方法。應(yīng)用：一般用于分離沉降系數(shù)相差較大（相差10倍以上）的顆粒，沉降系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種顆粒不易分開。

第109頁/共126頁此法主要由于組織勻漿液中分離細胞器和病毒，其優(yōu)點是：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。第110頁/共126頁密度梯度離心法（簡稱區(qū)帶離心法）：

定義：區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。第111頁/共126頁密度梯度離心法（簡稱區(qū)帶離心法）：

優(yōu)點：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚裕⒎乐挂研纬傻膮^(qū)帶由于對流而引起混合。缺點：①離心時間較長；②需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液；③操作嚴格，不易掌握。第112頁/共126頁（1）差速區(qū)帶離心法：當不同的顆粒間存在沉降速度差時（不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差）。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱為差速區(qū)帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒（20%

的沉降系數(shù)差或更少）或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)，與顆粒的密度無關(guān)，大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。第113頁/共126頁（1）差速區(qū)帶離心法：離心管先裝好密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上，離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達管