目的基因的表達黑板

目的基因的表達黑板第1頁/共50頁第一節(jié)外源基因的表達體系第2頁/共50頁原核生物轉(zhuǎn)錄過程RNA聚合酶α亞基發(fā)現(xiàn)啟動子序列與-35區(qū)結(jié)合進一步與-10區(qū)結(jié)合解鏈（17bp)使模板暴露σ因子識別并起始啟動位點pppA/pppGσ因子解離，NusA與RNA聚合酶結(jié)合（放松）RNA聚合酶向前滑動，繼續(xù)解12bp鏈終止（依賴ρ因子、不依賴ρ因子）第3頁/共50頁第4頁/共50頁第5頁/共50頁一、基因表達的機制外源基因的起始轉(zhuǎn)錄：可調(diào)控的啟動子mRNA的延伸與穩(wěn)定性外源基因mRNA的有效翻譯（起始密碼子、SD序列、SD序列與起始密碼子之間的距離為3—9個堿基）表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定目的基因沉默(位置效應(yīng)的基因沉默、轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默、轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默）第6頁/共50頁

二、外源基因表達系統(tǒng)概念：目的基因與表達載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細胞，并在其中有效表達，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。原核生物基因表達系統(tǒng)(大腸桿菌表達系統(tǒng)、芽孢桿菌表達系統(tǒng)、鏈霉菌表達系統(tǒng)和藍藻表達系統(tǒng)）真核生物基因表達系統(tǒng)第7頁/共50頁原核基因表達系統(tǒng)生長快，可通過發(fā)酵獲得大量基因表達產(chǎn)物基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作與分析多數(shù)原核生物細胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達載體生理代謝途徑及基因表達調(diào)控機制比較清楚不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象內(nèi)源蛋白酶會降解表達的外源蛋白，造成表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定性第8頁/共50頁大腸桿菌基因表達載體復(fù)制子啟動子和終止子核糖體結(jié)合位點密碼子（簡并密碼子的選擇）選擇標記（抗生素抗性基因）第9頁/共50頁三、制約目的基因表達的因素1、外源基因是否插入在正確的閱讀框架2、目的基因的有效轉(zhuǎn)錄（如啟動子的作用）3、mRNA的有效翻譯（如SD序列等作用）4、轉(zhuǎn)錄后，翻譯后的適當?shù)男揎椇图庸み^程第10頁/共50頁四、閱讀框架

在DNA鏈上,由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開始,到終止密碼子為止的一個連續(xù)編碼序列,叫做一個開放閱讀框架（openreadingframe,ORF）五、啟動子與轉(zhuǎn)錄的影響

1、在原核細胞的轉(zhuǎn)錄過程中，決定外源基因表達的關(guān)鍵因素是外源基因必須在載體DNA的啟動子控制之下，而且啟動子又能被宿主細胞中的RNA聚合酶有效識別。第11頁/共50頁第12頁/共50頁

選擇填空第13頁/共50頁第14頁/共50頁2、啟動子DNA序列中兩個高度保守區(qū)域是必須的（-10區(qū)與-35區(qū)），沒有這兩個高度保守區(qū)域，就沒有啟動作用。但是啟動子DNA序列中保守性較差部分和兩個保守區(qū)之間的核苷酸數(shù)量也影響啟動子的功能。LacUv5trp啟動子trp-lacUv5啟動子第15頁/共50頁（1）原核生物：大約在RNA合成起點之前的10bp和35bp處，由兩個由6個核苷酸組成的共有序列

-10區(qū)：TATAAT（thepribnowbox）

-35區(qū)：TTGACA（2）真核生物

-30區(qū)：TATA盒：TATAAAA-80區(qū)：CAAT盒：GGTCAATCT第16頁/共50頁六、翻譯過程對表達的影響1、SD序列與rRNA的16s亞基3’末端序列之間的互補程度，是影響翻譯效率的主要因素。2、起始密碼AUG與SD序列之間的距離以及SD序列的核苷酸組成也影響翻譯能力。3、起始密碼之后的一個核苷酸對mRNA與核糖體的結(jié)合也有影響。4、基因末端的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的影響第17頁/共50頁第二節(jié)外源基因在原核細胞

中的表達

第18頁/共50頁一、基因工程的表達系統(tǒng)

1、克隆原核基因在原核細胞中表達2、克隆真核基因在原核細胞中表達3、克隆原核基因在真核細胞中表達4、克隆真核基因在真核細胞中表達第19頁/共50頁原核表達系統(tǒng)：大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)：低等真核細胞（酵母）系統(tǒng)哺乳動物細胞系統(tǒng)昆蟲細胞系統(tǒng)第20頁/共50頁真核基因在原核細胞中表達的困難1、細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。2、從真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列，不能結(jié)合到核糖體蛋白上。3、真核基因一般含有內(nèi)含子，而原核細胞缺乏真核細胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，mRNA中的內(nèi)含子不能切除，成熟的mRNA不能形成，不能表達真核蛋白質(zhì)。4、表達的真核蛋白質(zhì)在原核細胞中不穩(wěn)定，容易被細菌蛋白酶破壞第21頁/共50頁2．起始密碼子的正確選讀

噬菌體蛋白A：

5`mRNAGUGAGUAUAAGAGGACAUAUGCCU3`rRNA5`ACCUCCUA3`

Qβ噬菌體復(fù)制酶：

5`mRNAUUACUAAGGAUGAAAUGCAUGUCU3`rRNA5`ACCUCCUA3`第22頁/共50頁二、原核系統(tǒng)高效表達外源真核基因

的措施

1、將真核基因克隆到一個強大的原核啟動子和SD序列的下游2、從真核細胞中分離mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA3、將真核基因插在幾個原核密碼之后，通過翻譯，通過翻譯得到原核多肽和真核基因產(chǎn)物連在一起的融合蛋白。牛的凝血因子Xa能識別特異的4肽順序：Ile（異亮）-Glu（谷）-Gly（甘）-Ary（精）原核多肽-Ile-Glu-Gly-Arg-真核蛋白。用Xa水解，分離出真核蛋白第23頁/共50頁4、減輕宿主細胞的代謝負荷，提高外源基因的表達水平將細胞的生長和外源基因的表達分開成為兩個階段，以便減低宿主細胞的代謝負荷第24頁/共50頁三、基因表達產(chǎn)物的檢測與分離純化1、基因表達產(chǎn)物的檢測1.1外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測

Northern印跡雜交、RT—PCR1.2報告基因的酶法檢測氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)

β—葡萄糖苷酸酶基因等(GUS)1.3表達產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測第25頁/共50頁2、基因表達產(chǎn)物的分離純化細胞破碎離心沉淀法、超濾濃縮法分離特異表達蛋白進一步分離柱層析聚丙烯凝膠電泳第26頁/共50頁mRNA差異顯示技術(shù)及其應(yīng)用第27頁/共50頁一、mRNA差別顯示技術(shù)概述高等生物大約有3萬—5萬個基因在任一細胞表達的基因約占總數(shù)的15%哪些基因在何生長發(fā)育階段以及在何種生理狀態(tài)下表達，決定了整個生命過程。比較同一類細胞在不同生長發(fā)育階段的基因表達的差異，是克隆特異表達基因的方法。第28頁/共50頁第29頁/共50頁一、mRNA差別顯示技術(shù)概述1992年Liang、PardeemRNA差異顯示技術(shù)（differentialdisplayreversetranscripionPCR，DDRT—PCR）動物、人類的癌癥、心臟病、糖尿病植物胚胎發(fā)育、無融合生殖、植物抗逆與抗病性第30頁/共50頁二、DDRT技術(shù)的原理（一）錨定PCR錨定PCR（anchoredPCR）是PCR技術(shù)的一種改進，一般的PCR實驗中需要知道目的基因兩端的序列，而錨定PCR技術(shù)不需要。所謂的“錨定”就是指一端已經(jīng)定死了，另一端通過人工合成引物來定，這就為許多我們對不清楚其5’端區(qū)域或是3’端區(qū)域的RNA的分析找到了一條良好的途徑。第31頁/共50頁第32頁/共50頁（二）DDRT技術(shù)路線

提取B組織RNA提取A組織RNA錨定引物（GT15A,GT15G,GT15C）反轉(zhuǎn)錄錨定引物（GT15A,GT15G,GT15C）反轉(zhuǎn)錄總RNA完整性鑒定總RNA完整性鑒定獲得cDNA第一鏈獲得cDNA第一鏈隨機引物擴增獲得cDNA第二鏈隨機引物擴增獲得cDNA第二鏈第33頁/共50頁采用隨即引物和錨定引物進行PCR擴增采用隨即引物和錨定引物進行PCR擴增擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析處理對照將差異條帶切出并進行回收第34頁/共50頁重新用相同的錨定引物和隨即引物進行PCR擴增Northern雜交，Southern雜交確定差異條帶的真實性克隆進入質(zhì)粒載體測序、進入GeneBank序列分析第35頁/共50頁三、mRNA差別顯示技術(shù)的優(yōu)缺點1、優(yōu)點具有簡便、靈敏、RNA用量少、效率高可同時比較多種給定生理狀態(tài)或不同發(fā)育階段的細胞內(nèi)mRNA2、缺點

1）所得特異性cDNA片段假陽性的比例高，75%

原因：總RNA有DNA污染凝膠中有重疊帶特異cDNA片段太短，得不到雜交信號第36頁/共50頁三、mRNA差別顯示技術(shù)的優(yōu)缺點2、缺點

2）cDNA產(chǎn)物的質(zhì)量往往較低，在凝膠上呈現(xiàn)smear狀態(tài)

3）得到的特異性的cDNA片段非翻譯序列利用GeneBank進行數(shù)據(jù)分析不利第37頁/共50頁四、mRNA差別顯示技術(shù)的應(yīng)用1、研究植物不同分化發(fā)育階段的基因表達差異2、基因的鑒定與克隆3、研究激素對植物發(fā)育的影響4、植物抗逆性機理的研究5、在營養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用6、在腫瘤研究中的應(yīng)用

第38頁/共50頁四、mRNA差別顯示技術(shù)的應(yīng)用研究植物不同分化發(fā)育階段的基因表達差異VilleCalzada和Nuccio狼尾草的基因表達有性生殖和無融合生殖的子房2個錨定引物和20個10堿基隨即引物共顯示出2268個cDNA片段，其中有3個基因片段能在有性生殖的子房中特異表達。第39頁/共50頁四、mRNA差別顯示技術(shù)的應(yīng)用在營養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用營養(yǎng)物質(zhì)的作用與基因調(diào)空有關(guān)，當某種營養(yǎng)缺乏或過多時，在分子水平上就表現(xiàn)為某個或某些基因的開啟、關(guān)閉或表達量的變化第40頁/共50頁銅在營養(yǎng)學(xué)中的作用缺銅6周的大鼠肝臟mRNA正常大鼠肝臟mRNA10個cDNA片段的差異表達量是對照的1.2倍新的未知基因第41頁/共50頁五、mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用被子植物無融合生殖使其子代繼承了母本所有的遺傳特性，并形成遺傳上穩(wěn)定的，可由種子繁殖的無性系。由此可以保存優(yōu)異的基因型，固定雜種優(yōu)勢，并可能使一些重要的作物實現(xiàn)“一系法”育種；如果無融合生殖被很好地利用，它將是二十世紀六十年代“綠色革命”之后的又一次農(nóng)業(yè)革命—無性生殖革命。第42頁/共50頁五、mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用

植物界中，無融合生殖廣泛存在。我們通過栽培甜菜（BetavulgarisL.）與白花甜菜（B.corolliforaZoss）遠緣雜交獲得了真實雜種，經(jīng)遺傳回交獲得了帶有白花甜菜染色體的完整單體附加系系列，并且通過單體附加系傳遞研究，篩選出近100%高頻率傳遞的單體附加系M14品系。經(jīng)過標記基因雜交、傳遞遺傳形態(tài)觀察、胚胎學(xué)及分子生物學(xué)鑒定它們是兼性無融合生殖的,1999年3月經(jīng)專家鑒定為無融合生殖品系；同時無融合生殖基因已經(jīng)定位在這條附加的白花甜菜染色體上，因此M14品系是克隆無融合生殖基因的極為難得的材料。第43頁/共50頁甜菜單體附加系M14品系(VV+1C,2n=19=18+1,箭頭所指為附加的白花甜菜染色體)第44頁/共50頁五、mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用采用mRNA差異顯示技術(shù)比較甜菜無融合生殖系及正常進行有性生殖的二倍體栽培植株在無融合生殖基因表達的三個關(guān)鍵時期，即大孢子母細胞減數(shù)分裂期、助細胞提前退化期、次生核自行分裂期mRNA的差異，是進行克隆無融合生殖相關(guān)基因的比較有效的方法第45頁/共50頁五、mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。PCR反應(yīng)擴增：

cDNA第一鏈1ul2.5mMdNTP1.2μl25mMMgcl21.2μlExTaq酶（5U/μl）0.2μl50μm錨定引物0.5μl

隨機引物1.0μl