WB過程中常見問題及處理方法

（優(yōu)選）WB過程中常見問題及處理方法現(xiàn)在是1頁\一共有31頁\編輯于星期一

基本原理通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息?，F(xiàn)在是2頁\一共有31頁\編輯于星期一

應(yīng)用1.目的蛋白的表達(dá)特性分析2.目的蛋白與其它蛋白的互作3.目的蛋白的組織定位4.目的蛋白的表達(dá)量分析現(xiàn)在是3頁\一共有31頁\編輯于星期一現(xiàn)在是4頁\一共有31頁\編輯于星期一現(xiàn)在是5頁\一共有31頁\編輯于星期一現(xiàn)在是6頁\一共有31頁\編輯于星期一三、WB的影響因素步驟較多，任何一步都可能影響結(jié)果1、電泳分離蛋白蛋白抽提；蛋白定量；樣品制備變性；上樣量；電泳（電壓、電流的大小，膠濃度、制膠）現(xiàn)在是7頁\一共有31頁\編輯于星期一2、轉(zhuǎn)膜膜的選擇；膜的確認(rèn)；特殊處理；……現(xiàn)在是8頁\一共有31頁\編輯于星期一3、封閉封閉液的選擇；封閉條件優(yōu)化；……現(xiàn)在是9頁\一共有31頁\編輯于星期一4、漂洗漂洗液的配制與選擇漂洗時(shí)間及次數(shù)現(xiàn)在是10頁\一共有31頁\編輯于星期一5、抗體孵育抗體及稀釋液選擇；抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化；抗體孵育時(shí)間；……現(xiàn)在是11頁\一共有31頁\編輯于星期一6、曝光曝光時(shí)間的掌控現(xiàn)在是12頁\一共有31頁\編輯于星期一四、注意事項(xiàng)1.蛋白樣品的提取盡可能新鮮組織或蛋白避免反復(fù)凍融對于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF）盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）

選擇合適的裂解液準(zhǔn)確定量（BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白）

現(xiàn)在是13頁\一共有31頁\編輯于星期一現(xiàn)在是14頁\一共有31頁\編輯于星期一2、制膠根據(jù)不同的蛋白大小，選擇不同的濃度制膠。現(xiàn)在是15頁\一共有31頁\編輯于星期一制膠的時(shí)候一定要注意玻璃板一定要干凈，不能有殘留的膠。玻璃板底部放平，盡量不能漏膠灌膠的時(shí)候，不能太快，容易產(chǎn)生旋窩水或異丙醇壓的時(shí)候，不能太久現(xiàn)在是16頁\一共有31頁\編輯于星期一

3、轉(zhuǎn)膜a泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移液浸泡20min；

凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會(huì)在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化現(xiàn)在是17頁\一共有31頁\編輯于星期一c膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板，不能放反d轉(zhuǎn)膜過程產(chǎn)生大量的熱，注意冷卻e具體轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，反之則短f避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因?yàn)槭稚系牡鞍缀陀椭瑫?huì)影響轉(zhuǎn)膜效率并會(huì)使膜臟掉。現(xiàn)在是18頁\一共有31頁\編輯于星期一g夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全h保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過大和過小都會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效率i一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景現(xiàn)在是19頁\一共有31頁\編輯于星期一4、封閉a脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用，因?yàn)槊撝谭酆刑堑鞍缀蜕锼豣如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因?yàn)榱姿崦概c印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化c檢測磷酸化抗體時(shí)，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑現(xiàn)在是20頁\一共有31頁\編輯于星期一5、孵育a洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；b注意一抗二抗的匹配c一抗二抗的效價(jià)問題現(xiàn)在是21頁\一共有31頁\編輯于星期一五、常見問題及解決電泳中的問題︶條帶呈笑臉狀——凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好;——電泳系統(tǒng)溫度偏高現(xiàn)在是22頁\一共有31頁\編輯于星期一︵條帶呈皺眉狀

可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全現(xiàn)在是23頁\一共有31頁\編輯于星期一拖尾樣品溶解不好現(xiàn)在是24頁\一共有31頁\編輯于星期一紋理（縱向條紋）樣品中含有不溶性顆?，F(xiàn)在是25頁\一共有31頁\編輯于星期一條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜現(xiàn)在是26頁\一共有31頁\編輯于星期一條帶兩邊擴(kuò)散加樣量過多現(xiàn)在是27頁\一共有31頁\編輯于星期一

Westernblot結(jié)果曝光問題

背景過高且不均勻1、封閉不充分——延長封閉時(shí)間；——更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）2、一抗?jié)舛冗^高——增加一抗稀釋倍數(shù)；3、抗體孵育溫度過高——4℃孵育現(xiàn)在是28頁\一共有31頁\編輯于星期一4、二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)——設(shè)置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?、洗膜不充分——增加洗滌次數(shù)，增加洗膜次數(shù)現(xiàn)在是29頁\一共有31頁\編輯于星期一沒有陽性條帶或很弱1、一抗、二抗等不匹配訂購試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體