三HPLC分析方法的建立

第三講.HPLC分析方法的建立天津市倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心BaseLine?現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六一.RPC分析方法建立二.NPC分析方法建立三.GPC分析方法四.HPLC應(yīng)用實(shí)例五.HPLC的定量分析現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六一.反相HPLC（RPC）分析方法的建立現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六建立分析方法的步驟樣品信息分析目的要求樣品制備選擇檢測(cè)方法和條件選擇HPLC方法優(yōu)化分離條件定性定量分析分析方法驗(yàn)證現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六樣品中的化學(xué)成分化合物的結(jié)構(gòu)與官能團(tuán)化合物的分子量化合物的酸堿性和pKa樣品適宜的溶劑及溶解度樣品各成分的含量范圍化合物的紫外吸收光譜樣品的組成與性質(zhì)現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六樣品的制備溶劑萃取固相萃取膜分離，超濾，超臨界萃取等現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六圖1非離子樣品的反相分離過(guò)程示意圖黑點(diǎn)表示在極性流動(dòng)相和非極性固定相間分配的樣品分子RPC的保留機(jī)理現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六影響RPC的保留的因素：現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六1.流動(dòng)相的影響：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷A+B：水+有機(jī)溶劑最佳分離條件：1<k<10現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六2.%B的選擇：現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六3.流動(dòng)相強(qiáng)度：現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六4.色譜柱和柱溫的影響：

非極性、非離子化合物的RPC保留值規(guī)則：(弱）未鍵合硅膠≤氰基<C1（TMS）<C3<C4<苯基<C8≈C18（強(qiáng)）通常柱溫增加1℃，K會(huì)減少1%-2%

現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六反相色譜的選擇性：溶劑強(qiáng)度的選擇性溶劑類型的選擇性柱類型對(duì)選擇性的影響溫度對(duì)選擇性的影響現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六1.溶劑強(qiáng)度的選擇性

現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六2.溶劑類型的選擇性

現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六3.柱類型對(duì)選擇性的影響

現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六4.溫度對(duì)選擇

性的影響：

現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六反相色譜中分析方法的建立：反相方法建立的推薦步驟：1.調(diào)整%B，使0.5<k<20，（1<k<10更好）2.檢查峰拖尾或塔板數(shù)低的現(xiàn)象3.如果必要，調(diào)整選擇性a.微調(diào)%Bb.改變有機(jī)溶劑c.混合有機(jī)溶劑d.改變柱類型e.改變溫度4.優(yōu)化柱條件（柱長(zhǎng)、顆粒尺寸、流速）現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六混合溶劑的使用：現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六柱類型的影響：現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六不同溶劑與柱類型的結(jié)合使用：現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六正相色譜分析方法的建立現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六1.樣品在RPC中不保留（親水性太強(qiáng)）2.樣品在RPC中保留太強(qiáng)（疏水性太強(qiáng)）3.采用RPC分離不能獲得足夠的峰間距（α=1）4.樣品含有空間異構(gòu)體，立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體5.期望回收到大量疏水性樣品組分（制備色譜）6.樣品溶于非極性溶劑（若采用RPC柱，會(huì)對(duì)直接進(jìn)樣造成問(wèn)題）使用正相色譜（NPC）的理由：現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六正相色譜保留機(jī)理現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六正相分析方法建立的推薦方法：

1.調(diào)整%B，使0.5<K<20，（氰基柱、己烷-丙醇做流動(dòng)相）2.檢查峰拖尾現(xiàn)象3.如必要，調(diào)整選擇性a.微調(diào)%Bb.改變有機(jī)溶劑種類（MC、MTBE、EtAc）；微調(diào)%Bc.混合有機(jī)溶劑d.改變柱類型（二醇、氨基、硅膠）；微調(diào)%B4.優(yōu)化色譜柱條件（柱長(zhǎng)、顆粒大小、流速）現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六NPC溶劑選擇性實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)色譜圖15×0.46cm硅膠柱，流動(dòng)相如前，2.0ml/min，350C。樣品為取代萘混合物，取代基：12-OCH3，21-NO2，31，2-（OCH3）2，41，5-（NO2）2；51-CHO，82-CHO，91-CH2CN，101-OH，111-COCH3，122-COCH3，132-OH?，F(xiàn)在是35頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六GPC分析方法現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六SEC保留機(jī)理現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六GFC:凝膠過(guò)濾色譜水相流動(dòng)相分離水溶性大分子固定相：多糖型凝膠、多孔交聯(lián)聚甲基丙稀酸酯類樹(shù)脂、交聯(lián)聚乙稀基醇樹(shù)脂、羥基化聚醚類親水性樹(shù)脂等。GPC:凝膠滲透色譜有機(jī)相流動(dòng)相分離脂溶性高分子固定相填料：苯乙烯-二乙烯苯多孔微球系列現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六理想SEC填料的性能要求

現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六

SEC填料的色譜特征：現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六SEC應(yīng)用：分離復(fù)雜樣品，然后再以高分辨率的HPLC分離純化.分析純化高分子化合物，以確定單聚、二聚和多聚物.以校正曲線估算大分子物質(zhì)分子量.現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六實(shí)例:凝膠滲透色譜法測(cè)定羥乙基淀粉分子量色譜條件:1.色譜儀器：pharmaciaLKBHPLCpump2248KNAUERDifferental-referactometer2.色譜柱：ShodexOHpakSB-804HQ(聚羥甲基丙烯酸酯凝膠)規(guī)格：

柱名

排阻限(Pullulan)

粒徑(μm)

尺寸(mm)

SB-804

HQ

1,000,000

10

8.0

x

3003.流動(dòng)相：0.7%硫酸鈉+0.02%疊氮化鈉4.流速：0.5ml/min5.柱溫：35℃現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六實(shí)驗(yàn)步驟：1.選用分子量為2000000和180的兩種淀粉確定該色譜柱的檢測(cè)窗口,見(jiàn)圖一。

圖一：分子量為180的淀粉的色譜圖tR1:19.673min分子量為2000000的淀粉的譜圖tR0:12.902min現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六2.分別以分子量為11800、22800、47300、112000、212000淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，其相應(yīng)的GPC譜圖，見(jiàn)圖二。圖二：分子量為11800淀粉譜圖tR2：16.965分子量為22800淀粉譜圖tR2：16.230分子量為47300淀粉譜圖tR2：15.445分子量為112000淀粉譜圖tR2：14.930分子量為2000000淀粉譜圖tR2：13.720現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六3.標(biāo)定曲線的確定現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六4.未知淀粉譜圖

y=-2.692x+5.6637R2=0.9989X=(VR-VR1)/(VR0-VR1)tR1:19.673mintR0:12.902mintR1:14.530計(jì)算得：未知淀粉M=29046現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六銀杏內(nèi)酯色譜條件：色譜柱：BaselineC184.6×150mm,5μm流動(dòng)相：甲醇：水：四氫呋喃=25：65：10流速：1ml/min檢測(cè)：ELSD,蒸發(fā)管溫度85℃，氣體流速4.0Bar現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六系統(tǒng)評(píng)價(jià)峰號(hào)峰名保留時(shí)間/min峰面積mAUs塔板數(shù)(N)分離度(Rs)拖尾因子USPTf1銀杏內(nèi)酯A6.247158814.3445146.719/1.1742銀杏內(nèi)酯B7.615402280.1886086.1683.1611.1443白果內(nèi)酯8.870418603.3446992.2792.6221.0914銀杏內(nèi)酯C11.713330196.2507052.8474.8990.981現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六

五種二氫吡啶類藥物色譜條件：色譜柱：BaselineC184.6×250mm,5μm流動(dòng)相：甲醇：水=75:25流速：1ml/min檢測(cè)：UV237nm現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六系統(tǒng)評(píng)價(jià)峰號(hào)峰名保留時(shí)間/min峰面積mAUs塔板數(shù)(N)分離度(Rs)拖尾因子USPTf1雜質(zhì)12.74567928.125/1.8181/2硝苯地平4.927294767.2507041.1491.4751.4153尼群地平8.078648196.7508204.8964.0431.2834尼莫地平9.060810590.8758377.0292.2371.2605非洛地平14.5971114624.25010027.2095.3661.2556拉西地平25.787691817.81310525.8752.9571.229現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六酚咖片色譜條件：色譜柱：BaselineC18,4.6×250mm,5μm流動(dòng)相：甲醇：水：冰醋酸=32：65：3流速：1ml/min檢測(cè)：UV275nm現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六酚咖片色譜圖（d/qhq/酚咖片/B0029,5.0μl）系統(tǒng)評(píng)價(jià)峰號(hào)峰名保留時(shí)間/min峰面積MAUs塔板數(shù)(N)分離度(Rs)拖尾因子USPTf1撲熱息痛3.812285765.188///2咖啡因6.008183115.5476073.3806.2261.4383阿司匹林14.447180600.40612993.96617.5691.2174苯甲酸20.563475402.96916084.1758.9951.172現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六五.HPLC定量分析方法現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六

1.歸一化法：以峰面積為基礎(chǔ)的歸一化法加校正因子的歸一化法2.外標(biāo)法：外標(biāo)曲線法外標(biāo)一點(diǎn)法3.內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)曲線法內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)加校正因子法4.標(biāo)準(zhǔn)加入法現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六1.歸一化法：1.1以峰面積為基礎(chǔ)的歸一化法1.2加校正因子的歸一化法

相對(duì)校正因子：現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六2.外標(biāo)法

2.1外標(biāo)曲線法現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六2.2外標(biāo)一點(diǎn)法：現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六內(nèi)標(biāo)法現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六3.1內(nèi)標(biāo)曲線法現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六3.2內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法：現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六3.3內(nèi)標(biāo)加校正因子法：相對(duì)校正因子：現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有78頁(yè)\編輯于星期六例2校正因子法的測(cè)定復(fù)方炔諾酮片中炔諾酮的含量ODS色譜柱、甲醇－水（60：40）流動(dòng)相、監(jiān)測(cè)器UV280nm、對(duì)硝基甲苯為內(nèi)標(biāo)物。（1）校正因子的測(cè)定：取對(duì)硝基甲苯（內(nèi)標(biāo)物）、炔諾酮和炔雌醇對(duì)照品適量，用甲醇制成10ml容量，進(jìn)樣10ul，記錄色譜圖。重復(fù)3次。測(cè)得含0.0733ml/ml內(nèi)標(biāo)物、0.600mg/ml炔諾酮和0.03