單克隆抗體和抗體工程

單克隆抗體和抗體工程單克隆抗體和抗體工程第1頁第四章抗體制藥第一節(jié)概述第二節(jié)單克隆抗體第三節(jié)鼠源性單克隆抗體改造第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程第五節(jié)抗體診療試劑第六節(jié)抗體治療藥品單克隆抗體和抗體工程第2頁第一節(jié)概述一、單克隆抗體1890年：Behring和北里柴三郎等發(fā)覺了白喉抗毒素，并建立了血清療法，開抗體制藥之先河。1937年：Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（）球蛋白、乙種（）球蛋白和丙種（）球蛋白，并證實抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。20世紀60年代早期：抗原決定簇，精制單價血清。單克隆抗體和抗體工程第3頁1975年：K?hler和Milstein等，單克隆抗體，其含有高度特異性、均一性，以及起源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)等特點。1984年：人-鼠嵌合抗體1984年至今：單克隆抗體鼠源性及分子過大問題得以處理，可僅作為與抗原特異性結(jié)合試劑。單克隆抗體和抗體工程第4頁單克隆抗體和抗體工程第5頁單克隆抗體和抗體工程第6頁單克隆抗體和抗體工程第7頁單克隆抗體和抗體工程第8頁單克隆抗體和抗體工程第9頁單克隆抗體和抗體工程第10頁單克隆抗體和抗體工程第11頁單克隆抗體和抗體工程第12頁單克隆抗體和抗體工程第13頁單克隆抗體應用用于疾病診療和治療：利用單克隆抗體檢測與一些疾病相關抗原，輔助臨床診療，用放射性核素標識單克隆抗體進行腫瘤顯像，進行免疫判定。用于臨床治療--如針對T淋巴細胞共有分化抗原CD3單克隆抗體，用作免疫抑制劑。單克隆抗體還可作為載體藥品可對腫瘤進行定向治療。單克隆抗體和抗體工程第14頁免疫導向療法成功障礙：（1）鼠源性單克隆抗體免疫原性；（2）完整抗體分子分子量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效治療濃度。單克隆抗體和抗體工程第15頁基因工程技術制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等很多類型抗體或抗體單位?；A消除了單克隆抗體鼠源性，相對分子質(zhì)量只有完整抗體分子1/80~1/3，鼠源性單克隆抗體生物學活性如激活補體、促進吞噬功效（免疫調(diào)理）、抗體依賴細胞介導細胞毒作用等，只保留同抗原特異性結(jié)合活性。單克隆抗體和抗體工程第16頁抗體（antibody）：由B細胞產(chǎn)生免疫蛋白，它能識別抗原某一特定位點?？贵w分子由兩個完全相同重鏈分子以及兩個完全相同輕鏈組成。B細胞（Bcell）：由骨髓細胞分化而來能產(chǎn)生抗體淋巴細胞。單克隆抗體:是將抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞融合，經(jīng)過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一單克隆細胞系而生產(chǎn)。第二節(jié)單克隆抗體及其制備單克隆抗體和抗體工程第17頁一、抗體結(jié)構(gòu)與功效LightandheavyChain，可變區(qū)（variableregion），簡稱V區(qū)，

3個互補決定區(qū)（complementaruty-determiningregion,CDR）重鏈分子上有3個恒定區(qū)［constantregion,C區(qū)（CH1,CH2和CH3）］,

輕鏈上有一個恒定區(qū)（CL）。重鏈輕鏈單克隆抗體和抗體工程第18頁用木瓜蛋白酶處理，將抗體分解成3個個別(2個Fab片段和1個Fc片段)；

Fab：一條完整輕鏈和重鏈可變區(qū)，輕鏈和重鏈恒定區(qū)。CL和CH1之間以二硫鍵連接；保留有抗原結(jié)合活性和特異性。保留VH和VL即可完全取得原抗體抗原結(jié)合活性，F(xiàn)vFc：兩條重鏈CH2和CH3區(qū)域，二硫鍵連接，沒有抗原接合活性，不過抗體結(jié)合上抗原后激活免疫反應主要部位。單克隆抗體和抗體工程第19頁單克隆抗體和抗體工程第20頁接收抗原刺激后，能分泌針對該抗原特異性抗體，在體液免疫中含有主要功效。B淋巴細胞本身是一個終末分化細胞，通常不再進行細胞分裂，存活一段時間后便會死亡——短命細胞一、雜交瘤技術產(chǎn)生3個技術關鍵1.B淋巴細胞與骨髓瘤細胞特征：B淋巴細胞(Blymphocytes)：二、雜交瘤細胞系生產(chǎn)單克隆抗體和抗體工程第21頁骨髓瘤細胞(myelomacells):惡性增殖轉(zhuǎn)化細胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠分裂和存活——長命細胞。經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立各種骨髓瘤細胞株——沒有抗體分泌物。單克隆抗體和抗體工程第22頁2.細胞融合技術：脾細胞(B淋巴細胞)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞長命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長命(K?hler和Milstein,Jerne)1984年Nobel生理學及醫(yī)學獎單克隆抗體和抗體工程第23頁3.雜交瘤細胞篩選脾細胞(B淋巴細胞)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞脾細胞/脾細胞骨髓瘤細胞/骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞脾細胞篩選出不能長久存活不能長久存活次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶缺點型單克隆抗體和抗體工程第24頁HAT培養(yǎng)基篩選原理(1)細胞融合選擇培養(yǎng)基中有三種關鍵成份：

◎氨甲蝶呤(Aminopterin，A):可阻斷正常DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）

◎次黃嘌呤(Hypoxanthine，H):是HGPRT底物,為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）；

◎胸腺嘧啶核苷(Thymidine，T):胸苷激酶(TK)作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料。單克隆抗體和抗體工程第25頁核苷酸合成路徑--生物合成路徑（D路徑-主要路徑）主路徑：由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，葉酸作為主要輔酶參加這一合成過程。葉酸作為主要輔酶參加這一過程。HAT培養(yǎng)液中氨基喋呤是一個葉酸拮抗物，能夠阻斷DNA合成“D路徑”。

單克隆抗體和抗體工程第26頁輔助路徑：是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化作用合成DNA，兩種酶缺一不可。核苷酸合成路徑--生物合成路徑（旁路徑-S路徑

）單克隆抗體和抗體工程第27頁篩選：HAT培養(yǎng)基篩選原理DNA內(nèi)源性路徑(D-主要路徑)

谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性路徑(旁路路徑)(HypoxanthineGuzninePhosphoribosylTransferase)次嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(Thymidinekinase,TK)B淋巴細胞：HGPRT+，TK+骨髓瘤細胞：HGPRT-，TK-存活死亡外源性路徑(S-旁路路徑)單克隆抗體和抗體工程第28頁1、未融合效應B細胞和兩個效應B細胞融合B淋巴細胞：HGPRT+，TK+在HAT培養(yǎng)液中，未融合效應B細胞和兩個效應B細胞融合“D路徑”被氨基喋呤阻斷雖“S路徑”正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖能力，普通10d左右會死亡。單克隆抗體和抗體工程第29頁骨髓瘤細胞HGPRT－，TK－在HAT培養(yǎng)液中，所以本身沒有“S路徑”“D路徑”又被氨基喋呤阻斷，所以在HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。2、骨髓瘤細胞以及本身融合細胞單克隆抗體和抗體工程第30頁骨髓瘤細胞HGPRT-，TK-既含有效應B細胞“S路徑”，又含有骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)液中長久增殖特征。在HAT培養(yǎng)液中，選擇性存活下來，并不停增殖。3、雜交瘤細胞單克隆抗體和抗體工程第31頁漿細胞自發(fā)或誘發(fā)突變脾B細胞用SRBC免疫(注射X蛋白)不能在HAT培養(yǎng)基上生長骨髓細胞(帶有X蛋白抗體)細胞融合轉(zhuǎn)到HAT培養(yǎng)基上非融合細胞死亡雜交瘤細胞生長單克隆抗體和抗體工程第32頁在多孔塑料板孔內(nèi)培養(yǎng)單個細胞(HAT培養(yǎng)液)培養(yǎng)2周雜交瘤細胞可繼續(xù)繁殖優(yōu)良雜交瘤細胞檢測單克隆抗體接種動物,大量生產(chǎn)單克隆抗體細胞大量培養(yǎng)罐大量生產(chǎn)克隆抗體冷凍保藏淘汰不合格細胞親代死亡單克隆抗體和抗體工程第33頁三、篩選陽性克隆與克隆化（1）篩選陽性克隆：產(chǎn)生特定抗原抗體產(chǎn)生細胞只占全部脾細胞5%左右。篩選技術：免疫酶技術、免疫熒光技術和放射免疫技術。免疫酶技術和放射免疫技術均適合用于可溶性抗原及顆粒性抗原抗體檢測。免疫熒光技術適合用于細胞抗原抗體檢測。單克隆抗體和抗體工程第34頁1、精制破傷風毒素抗原（）吸附（約10g/ml，4℃，3h）洗滌2、加雜交瘤培養(yǎng)上清液（）（4℃，1h）3、加辣根過氧化物酶標識羊抗鼠抗體（）（4℃，1h）洗滌洗滌4、加酶作用底物，呈色孔為陽性克隆孔ELISA用于破傷風抗體篩選單克隆抗體和抗體工程第35頁雜交瘤細胞培養(yǎng)細胞向培養(yǎng)基中分泌抗體搜集培養(yǎng)基預先包埋好目標抗原培養(yǎng)板抗原與抗體結(jié)合EEEEE加入二抗顯色說明有抗體存在在酶情況下,與二抗結(jié)合分子產(chǎn)生特殊顏色(ELISA)單克隆抗體和抗體工程第36頁單克隆抗體和抗體工程第37頁（2）克隆化——有限稀釋法和軟瓊脂法篩選出來陽性克隆中，可能含有不分泌抗體細胞或有多株分泌抗體細胞，而且剛才融合取得雜交瘤細胞不穩(wěn)定，染色體輕易丟失，所以應盡早克隆化。雜交瘤細胞要經(jīng)過大約3次克隆化，才能到達100%孔內(nèi)均為抗體陽性細胞克隆。常見克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。單克隆抗體和抗體工程第38頁有限稀釋法：是把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，使每個孔中在理論上只含有一個細胞。第一次克隆化時也要應用HT培養(yǎng)液，以后克隆化可用不含HTRPMI1640培養(yǎng)液。單個細胞難以存活，克隆化時也需加入喂養(yǎng)細胞輔助其生長。單克隆抗體和抗體工程第39頁軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%左右瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊。培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細吸管將小球吸出，團塊打壞后，移入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。這種方法能夠吸出大量克隆細胞進行培養(yǎng)，因初代細胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進行克隆化輕易成功。單克隆抗體和抗體工程第40頁三、雜交瘤細胞判定1）染色體判定:正常小鼠脾細胞染色體數(shù)目為40,而小鼠骨髓瘤細胞染色體數(shù)目標變異較大，能夠有62～68條染色體。2）特征判定:對單克隆抗體親和力判定是最主要,普通采取酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法。3）類別判定:能夠用對應抗血清及雙向免疫擴散法進行判定;4）單克隆抗體純度判定:能夠用有還原劑或者無還原劑條件下SDS-PAGE電泳進行判定。單克隆抗體和抗體工程第41頁四、單克隆抗體大量制備（1）體外培養(yǎng)法可取得10g/ml抗體；（2）動物體內(nèi)誘生法，可取得5~20mg/ml抗體。當前多采取此法生產(chǎn)制備單克隆抗體。優(yōu)點：操作簡便、比較經(jīng)濟、所得抗體量多、所得單克隆抗體量較多且效價亦高，還可有效地保留雜交瘤細胞株和分離已污染雜菌雜交瘤細胞株，缺點：小鼠腹水中混有來自小鼠各種雜蛋白，給純化帶來難度。單克隆抗體和抗體工程第42頁大量培養(yǎng)方法：利用懸浮培養(yǎng)方式可增加細胞生長空間，雜交瘤細胞生長旺盛，單克隆抗體產(chǎn)量得到提升。連續(xù)懸浮培養(yǎng)細胞密度可達2.0107細胞/ml，搜集單克隆抗體可到達400g/ml左右。微載體懸浮培養(yǎng)法，增大單位體積表面積，利于雜交瘤細胞生長，細胞密度可達108細胞/ml。并能收獲更多單抗。。單克隆抗體和抗體工程第43頁五、單克隆抗體純化動物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體詳細方法及過程1、澄清和沉淀處理小鼠腹水中含有紅細胞、細胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等，應首先用離心力1000g離心5min，去除殘留小顆粒物質(zhì)；再用0.2m微孔濾膜過濾，除掉污染細菌、支原體和脂質(zhì)；用飽和硫酸銨沉淀抗體，50%飽和硫酸銨能回收90%以上單克隆抗體。2、分離主要分離方法有凝膠過濾、陰離子交換層析、親和層析等。單克隆抗體和抗體工程第44頁2、分離（1）凝膠過濾（2）陰離子交換（3）親和層析單克隆抗體和抗體工程第45頁第三節(jié)基因工程抗體及其制備

(Geneticengineeringantibody)基因工程抗體：依據(jù)研究者意圖，采取基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表示，產(chǎn)生新型抗體。主要包含：嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。單克隆抗體和抗體工程第46頁一、單克隆抗體靶向制劑纖溶酶原纖溶酶原激活劑(tPA)纖溶酶血纖維蛋白原血纖維蛋白降解產(chǎn)物降解產(chǎn)物單克隆抗體和抗體工程第47頁2、耦聯(lián)了tPA血纖維蛋白單克隆抗體纖溶酶原纖溶酶抗血纖維蛋白抗體血塊單克隆抗體和抗體工程第48頁(1)藥品與單抗直接偶聯(lián)

經(jīng)過化學反應在藥品分子氨基和抗體分子羧基之間形成酰胺鍵,但因為酰胺鍵很穩(wěn)定,藥品與抗體分子結(jié)合后無法釋放出來,所以其藥用活性幾乎完全無法發(fā)揮出來。用氧化劑把藥品分子上糖基氧化成羰基,然后利用羰基與抗體分子氨基反應形成西佛氏堿,最終還原。這么制成靶向制劑能夠保留一定藥品活性,同時體外試驗證實,藥品顯示出一定選擇性。單克隆抗體和抗體工程第49頁(2)藥品經(jīng)過小分子與單抗連接經(jīng)過一些小分子交聯(lián)劑,把藥品分子上一些基團與抗體分子上一些基團連接起來。(3)藥品經(jīng)過大分子與抗體相連

將較多藥品分子接連在一個大分子聚合物上,然后再與單克隆抗體交聯(lián)。單克隆抗體和抗體工程第50頁二、雜交人-鼠單克隆抗體鼠源單克隆抗體在臨床上應用前景很廣,鼠源抗體有其不足:被去除出人循環(huán)系統(tǒng);鼠源抗體普通無法有效地激發(fā)宿主免疫防衛(wèi)系統(tǒng),在大多數(shù)情況下,還會引發(fā)人對于鼠源抗體本身免疫反應,

人抗鼠反應

(humanantimouseresmse),

也就是產(chǎn)生人抗鼠抗體

(humanantimouseantibody,簡稱HAMA)。單克隆抗體和抗體工程第51頁ChimericAntibodiesHumanFcregionsMouseVregions單克隆抗體和抗體工程第52頁三、人源化抗體(humanizedantibody)1.將小鼠CDR序列移植到人抗體可變區(qū)框架中，產(chǎn)生抗體稱為CDR移植抗體。2.將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術，產(chǎn)生大量完全人源化抗體單克隆抗體和抗體工程第53頁人源單克隆抗體化學偶聯(lián)單抗靶向制劑產(chǎn)率很低;偶聯(lián)分子其連接位置也是隨機;藥品分子酶活性和其它生物活性個別、甚至全部喪失。嵌合抗體可變區(qū)100%都是鼠源，對人體依然有一定免疫原性。單克隆抗體和抗體工程第54頁傳統(tǒng)雜交瘤技術是極難取得人源單克隆抗體主要原因:人一鼠淋巴細胞融合細胞中人源染色體不穩(wěn)定,得到人源單克隆抗體極少;沒有能有效代替鼠骨髓瘤細胞人骨髓瘤細胞;倫理上,無法對人進行各種抗原免疫。

單克隆抗體和抗體工程第55頁取得人源抗體方法I先分離出正在活躍產(chǎn)生抗體人B細胞,經(jīng)過熒光標識選擇能產(chǎn)生特殊抗體Bcell,病毒轉(zhuǎn)化,使之能在培養(yǎng)條件下正常生長。其中一些轉(zhuǎn)化B細胞就能夠分泌出能與特異性抗原結(jié)合單抗。產(chǎn)率很低,抗體對于抗原結(jié)合能力也較差。單克隆抗體和抗體工程第56頁取得人源抗體方法II將人源免疫干細胞導人缺失大個別免疫細胞小鼠體內(nèi),這種小鼠碰到抗原時,會產(chǎn)生人源抗體。取得人源抗體方法III將改造過人抗體基因?qū)耸笈咛ハ抵?以得到能在免疫后產(chǎn)生人抗體轉(zhuǎn)基因鼠。改造過抗體，除了組成抗原結(jié)合部位輕重鏈各3個CDR區(qū)是鼠源外,其余均為人源。單克隆抗體和抗體工程第57頁HumanizedAntibodiesClonedhumangeneInsertsequencesfrommousemonoclonalantibodyforCDR1-3segmentsPCRamplifiedsegments單克隆抗體和抗體工程第58頁IsolationofCDRSegmentsPCRamplificationofCDRsegmentsfrommousemonoclonalantibodytodesiredtargetInsertintocDNAcloneofhumanantibodyProducehumanantibodywithdesiredCDRsandantigenspecificity單克隆抗體和抗體工程第59頁四、抗體融合蛋白一個是將抗體可變區(qū)域與一非抗體蛋白融合，使融合蛋白繼承有抗體分子結(jié)合特異性。另一個是用非免疫球蛋白序列替換抗體可變區(qū)，如用CD4、白細胞介素3和腫瘤壞死因子等。單克隆抗體和抗體工程第60頁五、抗體酶

抗體酶(abzyme)：應用于單克隆技術生產(chǎn)兼具抗體及酶催活性工程蛋白質(zhì)。也就是說，其行為如同蛋白酶一樣，能夠催化化學反應一類新型抗體?？贵w酶制備(自學)單克隆抗體和抗體工程第61頁ImmunotoxinsProteintoxinconnectedtoFvregionSingle-chainorS-SlinkedFvregionToxinlocalizedtoantigen-expressingcells單克隆抗體和抗體工程第62頁六、單鏈抗體(singlechainantibody)

單鏈抗體：用基因工程方法，將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)經(jīng)過一個連接肽連接而成重組蛋白。特點：能保持與抗原結(jié)合性能，分子量小，穿透性強，體內(nèi)循環(huán)半衰期短，免疫原性低。單克隆抗體和抗體工程第63頁單鏈抗體Fv片段抗體(singlechainFvfragment,scFv)要取得正確抗原結(jié)合構(gòu)象,VL—銜接物—VH;單鏈抗體應用前景體積小,免疫原性較低,不易引發(fā)人體免疫排斥,滲透性好,能有效地穿透致密腫瘤屏障,有利于基因治療。構(gòu)建雙功效分子—生物導彈單克隆抗體和抗體工程第64頁單鏈抗體應用：用于腫瘤導向治療腫瘤影像分布基因治療細胞內(nèi)抗體：在細胞內(nèi)表示特異性識別某一基因產(chǎn)物抗體，可干擾該基因產(chǎn)物生物活性。研究基因結(jié)構(gòu)與功效關系單克隆抗體和抗體工程第65頁七、嵌合抗體(chimericantibody)嵌合抗體：從雜交瘤細胞分離出功效性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當表示載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，表示人-鼠嵌合抗體。特點：降低了鼠源性抗體免疫原性，同時保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原能力。單克隆抗體和抗體工程第66頁八、雙價抗體與雙特異性抗體(bispecificantibody)許多抗原抗體反應要求雙價抗原結(jié)合位點，使抗原分子上兩個表位交聯(lián)或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞表面分子抗體連結(jié)在一起，可使效應細胞更輕易與腫瘤細胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細胞作用。單克隆抗體和抗體工程第67頁九、單克隆抗體改造和應用單克隆抗體與殺傷性藥品耦聯(lián)—破壞特定目標細胞;單克隆抗體與藥品前體耦聯(lián)—在酶作用下,可轉(zhuǎn)化為具殺傷活性藥品,殺傷靶細胞單克隆抗體和抗體工程第68頁轉(zhuǎn)基因方法在雜交瘤細胞中生產(chǎn)完全人源單克隆抗體輕鏈和重鏈各由位于兩條染色體上兩組基因分別編碼。經(jīng)過重排產(chǎn)生大量各不相同輕鏈和重鏈分子。再經(jīng)過輕鏈和重鏈分子之間排列組合而形成幾乎無限多抗體分子。單克隆抗體和抗體工程第69頁1234512345939495282930123456μδνεαVHDHJHCHVH(1/95)DH(1/30)JH(1/6)CH(1/5)基因重排后得到重鏈A74757612345VKJk12345CkCkVk(1/76)Jk(1/5)CkB基因重排后得到輕鏈單克隆抗體和抗體工程第70頁ES細胞人重鏈基因YAC人輕鏈基因YACHκ抗體基因敲除小鼠抗體基因敲除小鼠××hHhκ×只表示人重鏈純合轉(zhuǎn)基因鼠只表示人輕鏈純合轉(zhuǎn)基因鼠hAb只表示人源抗體純合轉(zhuǎn)基因鼠單克隆抗體和抗體工程第71頁第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程一、噬菌體抗體庫技術基礎方法1、取得目標基因2、抗體庫技術載體：現(xiàn)在普遍使用噬菌粒（phagemid）載體，其中pHEN1為新一代載體，轉(zhuǎn)化效率高，有利于提升庫容量。單克隆抗體和抗體工程第72頁3、淘篩：抗原固定化后，對噬菌粒群吸附、洗滌和洗脫后再感染擴增，與輔助噬菌體超感染取得大容量次級文庫，再重復與抗原吸附，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目標克隆，且使目標克隆大量擴增。四、表示與判定：目標克隆經(jīng)過判定后，再導入感受態(tài)菌株，進行可溶性表示，其產(chǎn)物用westernblot分析確定后，就完成了全過程。單克隆抗體和抗體工程第73頁二、噬菌體抗體庫技術特點1、模擬天然全套抗體庫抗體文庫1011庫容，能包含B細胞全部克隆。建庫外源基因來自人外周血、骨髓或脾臟淋巴細胞提取mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA擴增，使用通用引物采自多個人體，含有些人種屬普遍性。VH和VL隨機重組增加抗體多樣性。單克隆抗體和抗體工程第74頁2、避開了人工免疫和雜交瘤技術3、可取得高親和力人源化抗體在噬菌體抗體庫中，VH和VL基因隨機重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟過程，所用抗體基因又都是來自人體，所以產(chǎn)生抗體必定都是高親和力。單克隆抗體和抗體工程第75頁三、基因工程抗體表示1、原核細胞表示2、真核細胞表示3、轉(zhuǎn)基因植物表示4、轉(zhuǎn)基因動物表示單克隆抗體和抗體工程第76頁第五節(jié)抗體診療試劑一、血清學判定用抗體類試劑1、判定病原菌抗體試劑：診療血清制備步驟：（1）制備細菌抗原，O（菌體）抗原，H（鞭毛）抗原；（2）免疫動物和制備抗體血清2、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）反向被動血凝診療試劑3、妊娠診療試劑4、抗ABO血型系統(tǒng)血清單克隆抗體和抗體工程第77頁二、免疫標識技術用抗體類試劑1、熒光抗體診療試劑熒光色素如異硫氰酸熒光素（FITC）等標識抗體球蛋白，即成為熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)組織切片或細胞，熒光抗體與抗原集合，在熒光顯微鏡下成為可發(fā)光可視物，從而到達診療或定位目標。（1）熒光抗體制備（2）免疫熒光測定法有直接