蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)第1頁(yè)/共81頁(yè)第三章蛋白質(zhì)第一節(jié)概述第二節(jié)氨基酸第三節(jié)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)第四節(jié)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能第五節(jié)蛋白質(zhì)的重要理化性質(zhì)第六節(jié)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的測(cè)定第2頁(yè)/共81頁(yè)第一節(jié)概述一、蛋白質(zhì)的概念二、蛋白質(zhì)的研究簡(jiǎn)史三、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成四、蛋白質(zhì)的分類(lèi)五、蛋白質(zhì)的分布六、蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能第3頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的概念:蛋白質(zhì)是一切生物體中普遍存在的，由天然氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成的生物大分子；其種類(lèi)繁多，各具有—定的相對(duì)分子質(zhì)量、復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)和特定的生物功能，是表達(dá)生物遺傳性狀的一類(lèi)主要物質(zhì)。第4頁(yè)/共81頁(yè)1838年Muller研究了血清、蛋清、蠶絲等物質(zhì)的元素組成后,發(fā)現(xiàn)它們均可以用C40H62N10O12

來(lái)表示,命名為“Protein”,并發(fā)展成“基團(tuán)”學(xué)說(shuō)。19世紀(jì)末從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物分離得到了13種氨基酸,基團(tuán)學(xué)說(shuō)銷(xiāo)聲匿跡。1902年

Fischer,Hofmeister同時(shí)提出肽鍵理論。1924年

Svedberg發(fā)明超離心機(jī)。1930年代Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽。1950年P(guān)auling提出蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本單位：α-螺旋和β-折疊。1953年Sanger確定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)。1958年P(guān)erutz&Kendrew用X光衍射法確定了肌紅蛋白的立體結(jié)構(gòu)1960年Anfinsen證明蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其立體結(jié)構(gòu)。1980年代蛋白質(zhì)工程的興起。1997年提出蛋白組學(xué)研究的概念。1999年蛋白質(zhì)芯片技術(shù)出現(xiàn)。第5頁(yè)/共81頁(yè)對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)有突出貢獻(xiàn)的Nobel獎(jiǎng)獲得者：1902年H.E.Fischer(德，化)肽鍵理論，多肽合成。1910年A.Kossel(德，醫(yī))組氨酸、組蛋白的發(fā)現(xiàn)，堿基的發(fā)現(xiàn)。1915年W.H.Bragg/W.L.Bragg(德，物)用X射線測(cè)定晶體物質(zhì)結(jié)構(gòu)。1926年T.Svedberg(瑞，化)用超離心手段決定蛋白質(zhì)的分子量。1946年J.B.Summer(美，化)蛋白質(zhì)酶的結(jié)晶，證明酶的本質(zhì)為Pr。1948年A.W.K.Tiselius(瑞，化)電泳裝置的開(kāi)發(fā)，血清蛋白的研究。1952年A.J.P.Martin/R.L.M.Synge(英，化)分配層析發(fā)明，氨基酸的分離。1954年L.Pauling(美，化)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，抗原抗體反應(yīng)理論。1958年F.Sanger(英，化)胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。1962年M.F.Perutz/J.C.Kendrew(英，化)

X射線確定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)。1972年G.M.Edelman/R.R.Porter(美，醫(yī))抗體的化學(xué)構(gòu)造與功能的解明。1972年W.H.Stein/S.More(美，化)

RNase的一級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的解明。1972年C.B.Anfinsen(美，化)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其立體結(jié)構(gòu)。1998年S.B.Prusiner(美，醫(yī))

Prion:蛋白立體機(jī)構(gòu)的變化導(dǎo)致疾病。第6頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成蛋白質(zhì)是一類(lèi)含氮有機(jī)化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質(zhì)還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、碘、鋅和銅等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：

碳50％氫7％氧23％氮16%硫0—3％其他微量N的含量平均為16%——?jiǎng)P氏（Kjadehl）定氮法的理論基礎(chǔ)。第7頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：

凱氏定氮法

(測(cè)定氮的經(jīng)典方法)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)原料無(wú)選擇性，儀器簡(jiǎn)單，方法也簡(jiǎn)單；缺點(diǎn)：易將無(wú)機(jī)氮(如核酸中的氮)都?xì)w入蛋白質(zhì)中,不精確。一般，樣品含氮量平均在16%，取其倒數(shù)100/16=6.25，即為蛋白質(zhì)換算系數(shù)，其含義是樣品中每存在1g元素氮，就說(shuō)明含有6.25g蛋白質(zhì)）；故：※蛋白質(zhì)含量=氮的量×100/16×6.25

第8頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的分類(lèi)1.按照分子組成分類(lèi)

單純蛋白質(zhì)：水解產(chǎn)物只有氨基酸。

結(jié)合蛋白質(zhì)：水解產(chǎn)物中除了氨基酸外，還有金屬離子和其它物質(zhì)（輔基）。結(jié)合蛋白根據(jù)其輔基的不同有好多種。一種單純蛋白質(zhì)只能與特定的一種或幾種輔基結(jié)合。2.按照分子形狀分類(lèi)

球狀蛋白：分子近似球形或卵圓形，易溶解，能結(jié)晶。

纖維狀蛋白：分子纖維狀，不對(duì)稱(chēng)。大多數(shù)不溶于水。3.按照生物功能分類(lèi)

活性蛋白質(zhì)：參與代謝反應(yīng)的蛋白質(zhì)。

非活性蛋白質(zhì)：對(duì)生物體起保護(hù)和支持作用的蛋白質(zhì)?；钚缘鞍踪|(zhì)分類(lèi)1.酶類(lèi)（占細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類(lèi)的絕大部分）;2.運(yùn)輸?shù)鞍?

3.收縮運(yùn)動(dòng)蛋白;4.激素蛋白;5.細(xì)胞激動(dòng)素;6.受體蛋白;7.毒素蛋白;

8.營(yíng)養(yǎng)貯藏蛋白;9.防御蛋白等。蛋白質(zhì)占干重人體中（中年人）人體45%水55%細(xì)菌50%~80%蛋白質(zhì)19%真菌14%~52%脂肪19%酵母菌14%~50%糖類(lèi)＜1%白地菌50%無(wú)機(jī)鹽7%植物：主要在種子中含量較高。蛋白質(zhì)的分布人體各組織器官中蛋白質(zhì)含量

（蛋白質(zhì)g/100g干組織）器官或組織蛋白質(zhì)含量器官或組織蛋白質(zhì)含量體液85心60脾84肝57肺82胰47橫紋肌80腦神經(jīng)45腎72骨骼28消化道63脂肪組織14我國(guó)一些谷物主要成分含量糧食種類(lèi)蛋白質(zhì)/％脂肪/％糖類(lèi)/％大豆36.317.526豌豆22.781.3554.7綠豆22.251.0856.02花生仁26.2039.222.0油菜籽26.3440.3517.59大米6.551.0577.50小麥9.421.4768.74玉米5.226.1372.4第10頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能1.生物體的組成成分2.催化3.運(yùn)輸4.運(yùn)動(dòng)5.抗體6.干擾素7.遺傳信息的控制8.細(xì)胞膜的通透性9.高等動(dòng)物的記憶、識(shí)別機(jī)構(gòu)酶蛋白結(jié)構(gòu)蛋白免疫球蛋白第11頁(yè)/共81頁(yè)第二節(jié)氨基酸一、氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)二、20種基本氨基酸的分類(lèi)三、氨基酸的重要理化性質(zhì)四、氨基酸的分離制備和分析鑒定第12頁(yè)/共81頁(yè)氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。氨基酸是具有氨基（-NH3+）或亞氨基和羧基（-COOH）的有機(jī)分子。氨基酸種類(lèi)多，但構(gòu)成蛋白質(zhì)具有遺傳密碼的氨基酸只有20種，其通式為：不帶電形式

H2N—C—HCOOHR+H3N—C—HCOO-R兩性離子形式氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(1).與羧基相鄰的α-碳原子上都有一個(gè)氨基，因而稱(chēng)為α-氨基酸(2).除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的α-碳原子都為不對(duì)稱(chēng)碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一種氨基酸都具有D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體。目前已知的天然蛋白質(zhì)中氨基酸都為L(zhǎng)-型。

注意：氨基酸的構(gòu)型是以距羧基最近的手性C原子為標(biāo)準(zhǔn)（除Gly外），而糖的構(gòu)型是以距羧基最遠(yuǎn)的手性C原子為標(biāo)準(zhǔn)。第13頁(yè)/共81頁(yè)氨基酸的分類(lèi)

中性AA（1）按R基團(tuán)的酸堿性分酸性AA

堿性AA（2）按R基團(tuán)的疏水性R基團(tuán)AA

電性質(zhì)分不帶電荷極性R基團(tuán)的AA

帶電荷R基團(tuán)的AA脂肪族A（3）按R基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)分芳香族AA

雜環(huán)族AA人體必需氨基酸有八種：

MetTrpLysValIleLeuPheThr

“假設(shè)來(lái)寫(xiě)一兩本書(shū)”第14頁(yè)/共81頁(yè)(一)氨基酸的一般物理性質(zhì)常見(jiàn)氨基酸均為無(wú)色結(jié)晶,其形狀因構(gòu)型而異溶解性：各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機(jī)溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。(2)熔點(diǎn)：氨基酸的熔點(diǎn)極高，一般在200℃以上。(3)味感：其味隨不同氨基酸有所不同，有的無(wú)味、有的為甜、有的味苦，谷氨酸的單鈉鹽有鮮味，是味精的主要成分。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋轉(zhuǎn)，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)光吸收：構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見(jiàn)光區(qū)都沒(méi)有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。Tyr、Trp、Phe在近紫外光區(qū)的最大吸收峰（λmax）和摩爾消光系數(shù)ε酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;第15頁(yè)/共81頁(yè)氨基酸在結(jié)晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質(zhì)子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。在不同的pH條件下，兩性離子的狀態(tài)也隨之發(fā)生變化。（二）氨基酸的離解性質(zhì)如果在某一pH值下，氨基酸所帶正電荷的數(shù)目與負(fù)電荷的數(shù)目正好相等，即凈電荷為零，則稱(chēng)該pH值為該氨基酸的等電點(diǎn)(pI)。

各種氨基酸都有其特定的等電點(diǎn)。中性氨基酸的pI在微酸性；堿性氨基酸的pI在堿性pH范圍；酸性氨基酸的pI在酸性pH范圍。氨基酸在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，易發(fā)生沉淀。工業(yè)上利用這一性質(zhì)提取氨基酸。

pH<pI,樣品帶正電荷，樣品點(diǎn)向陰極移動(dòng)

pH>pI,樣品帶負(fù)電荷，樣品點(diǎn)向陽(yáng)極移動(dòng)pH=pI,樣品不帶電荷，樣品點(diǎn)不移動(dòng)第16頁(yè)/共81頁(yè)氨基酸等電點(diǎn)的確定（1）中性氨基酸等電點(diǎn)（pI）的高低與氨基酸分子兩性解離基團(tuán)的解離平衡常數(shù)有一定關(guān)系。用K’1、K’2分別表示α-COOH和α-NH3+表觀解離平衡常數(shù)時(shí)，它們的負(fù)對(duì)數(shù)分別用pK’1、pK’2表示，則中性氨基酸的等電點(diǎn)在數(shù)值上等于兩個(gè)pK’值之和的二分之一。即：

pI=(pK1+pK2)/22.酸、堿性氨基酸在溶液中氨基酸隨pH升高而逐級(jí)解離時(shí)，總是pK＇值小的基團(tuán)先解離，pK＇值大者后解離。因此，對(duì)于具有三個(gè)解離基團(tuán)的氨基酸，只有靠近等電離子的兩個(gè)pK＇值影響等電離子的濃度。所以，只要正確寫(xiě)出解離反應(yīng)式，皆可根據(jù)等電離子兩邊的pK＇計(jì)算其pI值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R-COO-)/2鹼性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2第18頁(yè)/共81頁(yè)（三）氨基酸的重要化學(xué)反應(yīng)1.與亞硝酸反應(yīng)反應(yīng)特點(diǎn)：（1）脯氨酸不發(fā)生該反應(yīng)；（2）只有α–氨基氮可發(fā)生此反應(yīng)，R上的氮幾乎不參與反應(yīng)。（3）通過(guò)測(cè)定N2

的體積（摩爾數(shù)），可測(cè)定游離氨基氮。第19頁(yè)/共81頁(yè)2.與甲醛反應(yīng)反應(yīng)特點(diǎn)：反應(yīng)放出H+，可用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，是常用的測(cè)定氨基酸的反應(yīng)。第20頁(yè)/共81頁(yè)3.脫羧反應(yīng)反應(yīng)特點(diǎn)：在專(zhuān)一性酶的催化下進(jìn)行，放出CO2,工業(yè)上通過(guò)呼吸儀測(cè)定CO2的量來(lái)測(cè)定AA。第21頁(yè)/共81頁(yè)4.成鹽反應(yīng)氨基和羧基分別可與酸和堿成鹽。第22頁(yè)/共81頁(yè)5.成肽反應(yīng)一個(gè)氨基酸的α–氨基和另一個(gè)氨基酸α–羧基脫水縮合，生成的酰胺叫做肽，這種酰胺鍵叫做肽鍵。肽鍵的平面特征肽結(jié)構(gòu)第23頁(yè)/共81頁(yè)6.茚三酮反應(yīng)（鑒別反應(yīng)）在450nm處有最大吸收率，在0.5－50μg/ml范圍內(nèi)，氨基酸含量與光密度成正比。第24頁(yè)/共81頁(yè)7.羰氨反應(yīng)：氨基酸的氨基與糖類(lèi)的羰基易發(fā)生反應(yīng)，生成羰氨化合物，進(jìn)而縮合成更復(fù)雜的棕色到黑色化合物“類(lèi)黑色素”。食品加工中將這種反應(yīng)稱(chēng)為褐變。輕度的褐變可賦予食品一定的色、香、昧。但生成的黑色素則不能被細(xì)胞利用，也不能被發(fā)酵，不僅影響原料利用率，而且有毒副作用。8.個(gè)別R基團(tuán)的反應(yīng)（略）第25頁(yè)/共81頁(yè)從蛋白質(zhì)水解液中分離制備氨基酸或者分離分析氨基酸組成，需要分辯力很強(qiáng)的分離技術(shù)。層析法是近代生化中非常有效的常用分離方法。對(duì)于氨基酸混合樣品，或者其他各種性質(zhì)相近，一般化學(xué)方法難以分離的混合樣品，如核苷酸、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、維生素、抗生素、激素。等等，都能使用層析法達(dá)到分離分析的目的。第26頁(yè)/共81頁(yè)層析分離是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一個(gè)是固定相，另一個(gè)是流動(dòng)相，當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)固定相時(shí)，各組分以不同的速度移動(dòng)，而達(dá)到分離的方法。層析技術(shù)的三個(gè)基本構(gòu)成條件水不溶性惰性支持物。流動(dòng)相（能攜帶溶質(zhì)沿支持物流動(dòng)）。固定相（附著在支持物上，能對(duì)各種溶質(zhì)的流動(dòng)產(chǎn)生不同的阻滯作用）。第27頁(yè)/共81頁(yè)層析技術(shù)的分類(lèi)按流動(dòng)相的狀態(tài)分：液相層析（液相色譜）、氣相層析（氣相色譜）。按固定相的使用形式分類(lèi)：柱層析、紙層析、薄層層析、薄膜層析。按分離過(guò)程依據(jù)的理化性質(zhì)分類(lèi)：吸附層析、分配層析、離子交換層析、分子篩過(guò)濾層析、親和層析。層析技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于分子大小不等的化臺(tái)物，例如含多種蛋白質(zhì)的混合液，宜用分子篩過(guò)濾分離；對(duì)于能溶于有機(jī)溶劑，難溶于水的化食物，常用吸附層析法分離；對(duì)于既溶于水也溶于有機(jī)溶劑的化合物，宜用分配層析分離；電解質(zhì)混合物則宜用離交層析分離。第28頁(yè)/共81頁(yè)分配層析技術(shù)分配層析是利用各組分的分配系數(shù)不同而予以分離的方法。包括紙上層析、薄層層析、氣相層析。分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩相溶劑的濃度比值。在層析條件確定后，分配系數(shù)是一個(gè)常數(shù)。以K表示。第29頁(yè)/共81頁(yè)分配層析的基本原理分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅膠、纖維素粉、淀粉、硅藻等）吸附著一種溶劑作為固定相，這種溶劑在層析過(guò)程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可以沿固定相流動(dòng)，即流動(dòng)相。溶質(zhì)在流動(dòng)相的帶動(dòng)下流經(jīng)固定相時(shí)，溶質(zhì)在兩相之間連續(xù)動(dòng)態(tài)分配。由于不同溶質(zhì)的分配系數(shù)不同而分離。第30頁(yè)/共81頁(yè)紙上層析紙上層析是以濾紙為支持物的一種分配層析。濾紙能吸收22％－25％的水，其中6％－7％的水以氫鍵與濾紙纖維上的羥基結(jié)合，難以脫去。所以紙上層析是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的層析技術(shù)。由于各物質(zhì)的分配系數(shù)不同，移動(dòng)的速率也就不同，從而達(dá)到分離的目的。第31頁(yè)/共81頁(yè)紙層析的Rf值溶質(zhì)在濾紙上移動(dòng)的速率用Rf值表示：Rf值決定于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比，在同一實(shí)驗(yàn)條件下，兩相的體積比是一個(gè)常數(shù)。所以Rf值決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，Rf值也不同，由此可以根據(jù)Rf值的大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。第32頁(yè)/共81頁(yè)紙層析的操作1.樣品處理2.點(diǎn)樣3.平衡4.展開(kāi)5.顯色6.定性分析7.定量分析盡可能純化，調(diào)節(jié)pH、濃度。將樣品溶液用微量注射器點(diǎn)在原點(diǎn)。在密閉層析缸內(nèi)用溶液系統(tǒng)的蒸汽將濾紙飽和。將濾紙的一端浸入溶劑中，讓其沿濾紙移動(dòng)。為了看清斑點(diǎn)，用顯色劑顯色。計(jì)算Rf值，進(jìn)行定性。剪洗比色、直接比色、面積測(cè)量。第33頁(yè)/共81頁(yè)離子交換柱層析離子交換柱層析是用離子交換劑作為水不溶性支持物兼固定相,裝成層析柱，用不同pH和不同離子強(qiáng)度的緩沖液作流動(dòng)相(洗脫液)構(gòu)成的柱層析技術(shù)。這是目前應(yīng)用非常普遍的分離技術(shù)，無(wú)論實(shí)驗(yàn)室還是生產(chǎn)領(lǐng)域都有廣泛的實(shí)用性。第34頁(yè)/共81頁(yè)離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。即在不溶性母體上引入若干可解離基團(tuán)。不溶性母體：苯乙烯樹(shù)脂、酚醛樹(shù)脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等。引入的活性基團(tuán)，可以是酸性基團(tuán)，也可以是堿性基團(tuán)。在不溶性母體上引入酸性基團(tuán)，如磺酸基（-SO3H）、磷酸基（-PO3H2）、亞磷酸基（-PO2H）、羧基（-COOH）等時(shí)，可解離出H+，與其它陽(yáng)離子交換，這種離子交換樹(shù)脂屬于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。在不溶性母體上引入堿性基團(tuán)，如季胺〔-N+（CH3）3〕、叔胺〔-N（CH3）2〕、仲胺〔-NHCH3〕、伯胺〔-NH2〕等含氨基的基團(tuán)，可與OH-結(jié)合后，與其它陰離子交換，屬于陰離子交換樹(shù)脂。第35頁(yè)/共81頁(yè)分配系數(shù)（平衡常數(shù)）在一定條件下，離子交換劑所吸附離子濃度和在溶液中的離子濃度達(dá)到平衡時(shí)，兩者濃度之比叫做分配系數(shù)（也叫平衡常數(shù)）即：K值的大小決定樣品離子在柱內(nèi)的保留時(shí)間。如果樣品中各離子的K值差別足夠大，這些離子通過(guò)離子交換層析就可以得到分離。陰離子只能被陰離子交換劑吸附，陰離子只能被陰離子交換劑吸附；親和力大的易吸附，難洗脫；親和力小的難吸附，易洗脫。第36頁(yè)/共81頁(yè)氨基酸的離子交換層析分離當(dāng)使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱時(shí)，在pH2—3的條件下，各種氨基酸都帶正電荷，都能交換，上柱。與樹(shù)脂的靜電親和力大小依次為：堿性氨基酸（A2+）＞中性氨基酸(A+)＞酸性氨基酸(A±)。當(dāng)用緩沖液洗脫時(shí)，隨pH由低到高，氨基酸洗脫流出的次序大體上是酸性氨基酸先流出，其次是中性氨基酸，最后是堿性氨基酸。同種性質(zhì)的氨基酸，R基團(tuán)與樹(shù)脂間親和力小者先流出，大者后流出。第37頁(yè)/共81頁(yè)離子交換層析技術(shù)的自動(dòng)化返回第38頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子是蛋出質(zhì)的具有完整生物功能的最小結(jié)構(gòu)單位。1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分成四個(gè)層次: 一級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸序列

二級(jí)結(jié)構(gòu)：α-螺旋，β-折疊

三級(jí)結(jié)構(gòu)：所有原子空間位置

四級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)多聚體第39頁(yè)/共81頁(yè)一級(jí)結(jié)構(gòu)又叫初級(jí)結(jié)構(gòu)、基本化學(xué)結(jié)構(gòu)或共價(jià)結(jié)構(gòu)。1969年國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)定義為：一級(jí)結(jié)構(gòu)即肽鏈中的氨基酸順序。一級(jí)結(jié)構(gòu)是高級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)基礎(chǔ)，也是認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)分子生物功能、結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化的關(guān)系、結(jié)構(gòu)變異與分子病的關(guān)系等許多復(fù)雜問(wèn)題的重要基礎(chǔ)。研究一級(jí)結(jié)構(gòu)需要闡明的內(nèi)容包括：（1）蛋白質(zhì)分子的多肽鏈數(shù)目。（2）每條肽鏈的末端殘基種類(lèi)。（3）每條肽鏈的氨基酸順序。（4）鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的配置等。

第40頁(yè)/共81頁(yè)多肽鏈氨基酸通過(guò)肽鍵連接起來(lái)的鏈狀物根據(jù)其長(zhǎng)短稱(chēng)為寡肽、短肽、多肽和蛋白質(zhì)，很多場(chǎng)合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。研究蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，就是要將氨基酸的排列順序搞清楚。四十年代起，許多人不遺余力從事蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)研究。一級(jí)結(jié)構(gòu)研究史上的兩個(gè)第一1954年英國(guó)生化學(xué)家Sanger報(bào)道了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，是世界上第一例確定一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。Sanger由此1958年獲Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。1965年我國(guó)科學(xué)家完成了結(jié)晶牛胰島素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白質(zhì)。第41頁(yè)/共81頁(yè)多肽鏈的結(jié)構(gòu)第42頁(yè)/共81頁(yè)一級(jí)結(jié)構(gòu)中的二硫鍵第43頁(yè)/共81頁(yè)分析一級(jí)結(jié)構(gòu)的一般程序一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析是一項(xiàng)非常細(xì)致而又復(fù)雜的技術(shù)上作，基本工作程序是：（1）將蛋白質(zhì)純化，測(cè)定末端組成。（2）拆分蛋白質(zhì)分于并將多肽分離純化。（3）用酶法或化學(xué)方法進(jìn)行專(zhuān)一性切割，得到系列長(zhǎng)短不一的肽段。（4）將肽段分離，通過(guò)末端分析方法測(cè)定各肽段的氨基酸順序。（5）根據(jù)二肽段的順序重疊關(guān)系確定各個(gè)肽段的銜接順序。排出完整多肽鏈的氨基酸順序。（6）確定二硫鍵的位置。Sanger試劑(FDNB)標(biāo)記N末端ABCDE↓*ABCDE↓*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE↓*A,*A+B,……*A+B+C+D+E↓*A,*A+*B,……*A+*B+*C+*D+*E12345結(jié)論：ABCDE第44頁(yè)/共81頁(yè)一級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)功能的關(guān)系一級(jí)結(jié)構(gòu)中，有的部位保守性很強(qiáng)，既不能缺失，也不能更換，否則就會(huì)喪失活性；有的部位則可以改變，切除或更換別的殘基都不影響生物活件；還有的部位必須切除之后，蛋白質(zhì)分子才顯活性。不同部位的殘基對(duì)功能的影響，實(shí)質(zhì)是影響了蛋白質(zhì)分子特定的空間構(gòu)象的形成。許多先天性疾病是由于某一重要的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了差錯(cuò)引起的。如血紅蛋白β亞基6位Glu被Val代替（基因突變），即表現(xiàn)為鐮刀狀貧血，為世上最常見(jiàn)的血紅蛋白病。比較不同生物細(xì)胞色素C的一級(jí)結(jié)構(gòu)可以幫助了解物種間的進(jìn)化關(guān)系，物種間越接近，則細(xì)胞色素C的一級(jí)結(jié)構(gòu)越相似牛胰島素分子的激活：第45頁(yè)/共81頁(yè)天然活性肽除了蛋白質(zhì)水解可以產(chǎn)生長(zhǎng)短不等的肽段之外，生物體內(nèi)還有很多游離存在的小分子活性肽，各具有一定的生物功能。有些活性肽屬于激素類(lèi)，如催產(chǎn)素、加壓素等都是九肽。返回蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)所謂蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)是指分子的構(gòu)象而言。構(gòu)象與構(gòu)型都是立體化學(xué)結(jié)構(gòu)概念，但含義不同。構(gòu)型是由于化合物分子中某一不對(duì)稱(chēng)碳原子上四種不同的取代基團(tuán)（或原子）的空間排列所形成的一種光學(xué)活性立體結(jié)構(gòu)。一個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子只能形成兩種不同的構(gòu)型。分子從一種構(gòu)型變?yōu)榱硪环N構(gòu)型，例如從D-丙氨酸變?yōu)長(zhǎng)-丙氨酸，必須發(fā)生共價(jià)鍵的變化（斷裂和另生成）。

構(gòu)象是分子內(nèi)所有原子或原子團(tuán)的空間排布所形成的—種立體結(jié)構(gòu)。這類(lèi)立體結(jié)構(gòu)不需要共價(jià)鍵斷開(kāi)，只要分產(chǎn)中發(fā)生C－C單鍵的轉(zhuǎn)動(dòng)就能從一種構(gòu)象變?yōu)榱怼N構(gòu)象。如此說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)分子該有無(wú)數(shù)構(gòu)象了，其實(shí)不然。研究證明，天然蛋白質(zhì)分子都有與其生物活性相關(guān)的一種或少數(shù)幾種特定的構(gòu)象，這種天然構(gòu)象相當(dāng)穩(wěn)定?！l件下，將蛋白質(zhì)分子從細(xì)胞中分離出來(lái)，仍能保持其天然構(gòu)象和生物活性。第47頁(yè)/共81頁(yè)維系蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵第48頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈中各原子在局部空間或一段肽鏈的氨基酸殘基的空間排布方式。為主鏈構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈構(gòu)象。包括α-螺旋、β-折疊以及β-轉(zhuǎn)角，這些主鏈基本構(gòu)象都是以酰胺平面（或稱(chēng)肽鍵平面、肽單元）為基本結(jié)構(gòu)單位，有規(guī)則的盤(pán)曲而成的。也存在部分無(wú)規(guī)則卷曲。肽鍵平面肽鍵平面肽鏈中的肽鍵平面兩個(gè)肽平面以一個(gè)Cα為中心發(fā)生旋轉(zhuǎn)第49頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)-α螺旋結(jié)構(gòu)右手螺旋(順時(shí)針)。肽鏈的主鏈形成緊密的螺旋,側(cè)鏈伸向外側(cè)，每一圈包含3.6個(gè)氨基酸殘基,每個(gè)殘基跨距為0.15nm,螺旋上升一圈的距離(螺距)為3.6×0.15=0.54nm，環(huán)內(nèi)原子數(shù)13。螺旋通過(guò)氫鍵維持穩(wěn)定。第一個(gè)肽鍵的NH和第四個(gè)肽鍵的CO形成氫鍵,第n個(gè)肽鍵的NH和第n+3個(gè)肽鍵的CO形成氫鍵。氫鍵取向與主軸基本平行。α-螺旋結(jié)構(gòu)形成的限制因素凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽鍵N原子上沒(méi)有H,不能形成氫鍵。靜電斥力。若一段肽鏈有多個(gè)Glu或Asp相鄰,則因pH=7.0時(shí)都帶負(fù)電荷,防礙α螺旋的形成;同樣多個(gè)堿性氨基酸殘基在一段肽段內(nèi),正電荷相斥,也防礙α螺旋的形成。位阻。如Asn、Leu側(cè)鏈很大，防礙α螺旋的形成。第50頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)β—折疊結(jié)構(gòu)β-折迭又叫β-折迭片或β-片層結(jié)構(gòu)，也是蛋白質(zhì)分子中常見(jiàn)的主鏈構(gòu)象之一。所謂β-折迭是兩條或兩條以上充分伸展成鋸齒狀折迭構(gòu)象的膚鏈側(cè)向聚集，按肽鏈的長(zhǎng)軸方向平行并列，形成的折扇狀構(gòu)象。β-折迭構(gòu)象靠相鄰肽鏈主鏈亞氨基（NH）和羰基氧原子之間形成有規(guī)律的氫鍵聯(lián)結(jié)維系。平行式N端N端平行式與反平行式第51頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)又叫U型回折、β-轉(zhuǎn)彎或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。是近年來(lái)在球狀蛋白質(zhì)分子中發(fā)現(xiàn)的一種主鏈構(gòu)象。球狀蛋白質(zhì)分子主鏈在盤(pán)曲折迭運(yùn)行中往往發(fā)生180°的急轉(zhuǎn)彎，這種回折部位的構(gòu)象即所謂β-轉(zhuǎn)角。β-轉(zhuǎn)角是由4個(gè)連續(xù)的殘基組成的，第一個(gè)殘基的羰基與第四個(gè)殘基的亞氨基間形成氫鍵聯(lián)結(jié)，穩(wěn)定構(gòu)象。第52頁(yè)/共81頁(yè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的多元性球狀蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)一般都不是單一構(gòu)象。主鏈的不同段落構(gòu)象不同，多種構(gòu)象單元交替連接組成整條肽鏈的二級(jí)構(gòu)象。第53頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子在一、二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，再進(jìn)行三維空間的多向性盤(pán)曲折迭。形成特定的近似球狀的構(gòu)象，稱(chēng)為步白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)l969年IUPAC的定義，三級(jí)結(jié)構(gòu)包括蛋白質(zhì)分子主鏈和側(cè)鏈所有原子或原子團(tuán)的空間排布關(guān)系。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象特點(diǎn)（1）三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象近似球形。（2）分子中的親水基團(tuán)相對(duì)集中在球形分子的表面，疏水基團(tuán)相對(duì)集中在分子內(nèi)部，形成所謂“親水表面，疏水核”。（3）三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的穩(wěn)定性主要靠疏水相互作用維系。親水表面能吸附形成厚厚的水化膜和雙電層，對(duì)蛋出質(zhì)分子構(gòu)象起很好的保護(hù)作用。（4）三級(jí)結(jié)構(gòu)形成之后，蛋白質(zhì)分子的生物活性部位就形成了。第54頁(yè)/共81頁(yè)結(jié)構(gòu)域有些較大的球狀蛋白質(zhì)分子或亞基，常常先由幾個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組合在一起形成超二級(jí)結(jié)構(gòu)，以此作為形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)體，這些超二級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)體稱(chēng)為結(jié)構(gòu)域，又叫轄區(qū)。結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步締合則形成近似球形的三級(jí)結(jié)構(gòu)。第55頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)有些球狀蛋白質(zhì)分子是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的三級(jí)結(jié)構(gòu)單位締合而織成的，通常稱(chēng)為寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中的每個(gè)三級(jí)結(jié)構(gòu)單位稱(chēng)為一個(gè)亞基（或亞單位）。所謂蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)就是指寡聚蛋白質(zhì)分子中亞基與亞基間的立體排布及相互作用關(guān)系，亞基的數(shù)目和類(lèi)型也屬四級(jí)結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)容，但不涉及亞基本身的構(gòu)象。兩個(gè)亞基的結(jié)構(gòu)血紅蛋白第56頁(yè)/共81頁(yè)寡聚蛋白質(zhì)分子的亞基組成據(jù)統(tǒng)計(jì)，已經(jīng)研究過(guò)的寡聚蛋白質(zhì)分子達(dá)700多種。它們的亞基數(shù)目差別很大，少則幾個(gè)，多則十幾個(gè)，數(shù)十個(gè)。大多數(shù)寡聚蛋白質(zhì)是由偶數(shù)亞基組成的。其中，兩個(gè)或四個(gè)亞基者最多。奇數(shù)亞基的分子很少見(jiàn)。亞基類(lèi)別組成有兩種類(lèi)型。一種是由相同亞基組成的均一寡聚蛋白，如過(guò)氧化氫酶，是由四個(gè)相同亞其組成的四聚體，每個(gè)亞基的一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)都相同，功能也相同。另一種是由結(jié)構(gòu)不同的亞基組成的非均—寡聚蛋白，如血紅蛋白（α2β2）。維持四級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素為各亞基之間的作用力如氫鍵、離子鍵、疏水鍵。含有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，單獨(dú)的亞基一般沒(méi)有生物學(xué)功能，只有完整的四級(jí)結(jié)構(gòu)才有生物學(xué)功能。第57頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)第58頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象并不是固定不變的。許多蛋白質(zhì)在表現(xiàn)其生物學(xué)功能時(shí)，構(gòu)象發(fā)生變化，從而改變了整個(gè)分子的性質(zhì)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為變構(gòu)現(xiàn)象。血紅蛋白在表現(xiàn)其輸氧功能時(shí)的變構(gòu)現(xiàn)象就是一個(gè)典型的例子。1.血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

血紅蛋白是由兩個(gè)α-亞基和兩個(gè)β-亞基組合而成的四聚體。血紅蛋白的亞基中分子各有一個(gè)血紅素，能結(jié)合一分子O2。血紅蛋白的亞基之間相互作用形成了穩(wěn)定的四級(jí)結(jié)構(gòu)，使其中的血紅素與O2的親和力變得很弱。當(dāng)血紅蛋白分子中一個(gè)亞基的血紅素與O2結(jié)合，立即引起該亞基的構(gòu)象發(fā)生改變，這種構(gòu)象變化隨即通過(guò)亞基間的次級(jí)鍵引起另外3個(gè)亞基的構(gòu)象相繼改變，結(jié)果改變了整個(gè)分子的構(gòu)象，使所有尚未與O2結(jié)合的亞基都變成適宜于與O2結(jié)合的構(gòu)象，從而使血紅蛋白的氧合速度大大加快。O2HbHb-O2O2血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線活動(dòng)肌肉毛細(xì)血管中的PO2020406080100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin2.核糖核酸酶S的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系核糖核酸酶S三維結(jié)構(gòu)的形成與維系也有賴(lài)于多肽鏈內(nèi)部的4個(gè)二硫鍵，60年代初，有人在含有巰基乙醇的8mol／L尿素溶液中還原二硫鍵，使核糖核酸酶S變性失活，然后透析除去尿素和巰基乙醇。在含有氧和痕量巰基乙醇的水溶液中，變性的核糖核酸酶S結(jié)構(gòu)由伸展的肽鏈自動(dòng)折疊，重新形成的二硫鍵配對(duì)完全正確，酶活性幾乎恢復(fù)到原有的水平。這個(gè)實(shí)驗(yàn)充分證明了蛋白質(zhì)的功能取決于其特定的天然構(gòu)象，而規(guī)定其構(gòu)象所需要的信息包含在它的氨基酸序列之中。返回第59頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的重要理化性質(zhì)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是氨基酸組成的，所以，氨基酸的許多理化性質(zhì)必然反映到蛋白質(zhì)上。如兩性解離和等電點(diǎn)、成酯反應(yīng)、成鹽反應(yīng)、一些顯色反應(yīng)、光吸收性質(zhì)等在蛋白質(zhì)上都有所表現(xiàn)。不僅如此，從氨基酸小分子到蛋白質(zhì)大分子已經(jīng)發(fā)生了質(zhì)的變化，所以，蛋白質(zhì)又具有氨基酸所不具備的許多性質(zhì)。第60頁(yè)/共81頁(yè)1.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)是生物大分子，相對(duì)分子質(zhì)量一般都在1－100萬(wàn)之間，其顆粒大小屬于膠體粒子的范圍。蛋白質(zhì)水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團(tuán)（親水基團(tuán)向外翻，疏水基團(tuán)向內(nèi)鉆），在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水膜（水化層）；另外蛋白質(zhì)顆粒在非等電點(diǎn)狀態(tài)時(shí)帶的相同電荷，使蛋白質(zhì)顆粒間相互排斥，不致相互凝聚沉淀。第61頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用透析法:利用蛋白質(zhì)不能透過(guò)半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達(dá)到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱(chēng)為透析（dialysis）。第62頁(yè)/共81頁(yè)膜分離與超濾技術(shù)：透析是一種膜過(guò)濾技術(shù)，曾為生物大分子的分離純化起過(guò)重要作用。70年代以來(lái)．隨著合成濾膜的發(fā)展，膜過(guò)濾技術(shù)發(fā)展很快，其中，超濾技術(shù)已經(jīng)于蛋白質(zhì)溶液的濃縮、純化及分級(jí)分離。超濾是一種加壓膜過(guò)濾技術(shù)，它是利用具有選擇透過(guò)性的微孔濾膜，在液壓作用下迫使小分子水和無(wú)機(jī)鹽等透過(guò)膜，大分則被阻留在膜的內(nèi)側(cè)，從而達(dá)到分離純化的目的。

第63頁(yè)/共81頁(yè)2.蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)第64頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的應(yīng)用等電沉淀技術(shù)：在等電點(diǎn)pH條件下，蛋白質(zhì)為電中性，比較穩(wěn)定。其物理性質(zhì)如導(dǎo)電性、溶解度、粘度、滲透壓等都表現(xiàn)為最低值，易發(fā)生絮結(jié)沉淀。因此，等電點(diǎn)性質(zhì)常被用于蛋白質(zhì)的分離制備，被稱(chēng)為等電沉淀技術(shù)。電泳技術(shù)：在溶液pH值不等于等電點(diǎn)的條件下，蛋白質(zhì)分子顯電性，在直流電場(chǎng)中向其所帶電荷相反的電極泳動(dòng)。根據(jù)這一原理建立了將帶電性質(zhì)不同的蛋白質(zhì)混合物，在直流電場(chǎng)中進(jìn)行電泳分離的技術(shù)，稱(chēng)力蛋白電泳。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)也是蛋白質(zhì)分離制備、分析鑒定中常用的一種實(shí)驗(yàn)手段。第65頁(yè)/共81頁(yè)3.蛋白質(zhì)的變性作用在某些物理化學(xué)因素作用下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的次級(jí)鍵斷裂，二、三級(jí)空間結(jié)構(gòu)被破壞，分子的緊密構(gòu)象變成了松散的無(wú)序狀態(tài)。天然構(gòu)象破壞，從而引起理化性質(zhì)改變，生物活性喪失。叫做蛋白質(zhì)的變性作用。注意：蛋白質(zhì)變性后一級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化。只是空間構(gòu)象發(fā)生變化。造成蛋白質(zhì)變性的因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、重金屬鹽、乙醇、加熱、紫外線、X線等。變性復(fù)性注意：并不是所有變性蛋白都可以復(fù)性的！第66頁(yè)/共81頁(yè)變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)理化性質(zhì)發(fā)生了變化，旋光性改變，粘度增加，光吸收性質(zhì)增，強(qiáng)失去了結(jié)晶能力，溶解度降低，易發(fā)生凝集、沉淀。由于側(cè)鏈基團(tuán)外露，顏色反應(yīng)增強(qiáng)。生化性質(zhì)發(fā)生了變化，變性蛋白質(zhì)比天然蛋白質(zhì)易被蛋白酶水解。生物活性喪失，這是蛋白質(zhì)變性的最重要的明顯標(biāo)志之一。第67頁(yè)/共81頁(yè)4.蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的。假若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和表面電荷，蛋白質(zhì)親水膠體使失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮結(jié)沉淀現(xiàn)象。這即所謂蛋白質(zhì)沉淀作用。第68頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)的沉淀性質(zhì)的應(yīng)用鹽溶與鹽析：在蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽（如NaCl、（NH4）2SO4等）時(shí)，可產(chǎn)生以下兩種現(xiàn)象：在鹽濃度很稀的范圍內(nèi)，隨著鹽濃度增加，蛋白質(zhì)的溶解度亦隨之增加，這種現(xiàn)象稱(chēng)鹽溶。鹽溶作用的發(fā)生是由于蛋白質(zhì)表面電荷吸附鹽離子之后，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)和水的親和力，促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解。與鹽溶作用相反，當(dāng)溶液中鹽濃度提高到一定的飽和度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度逐漸降低，蛋白質(zhì)分子發(fā)生絮結(jié)，成沉淀析出，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。

鹽析作用的發(fā)生機(jī)理很復(fù)雜，一般認(rèn)為中性鹽與水的親和力大，又是強(qiáng)電解質(zhì)，當(dāng)一定高濃度的中性鹽加到蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，一方面結(jié)合大量自由水，降低水分活度；一方面又奪取蛋白質(zhì)表面的水化膜，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子之間互相作用的機(jī)會(huì)，促其聚集絮結(jié)成沉淀析出。

利用鹽析的原理，加中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀的方法叫做鹽析沉淀法。不同蛋白質(zhì)表面電荷量不同，水化膜的厚度不一樣，鹽析所需要的中性鹽濃度也不一樣，一般而言，相對(duì)分子質(zhì)量大的容易鹽析，相對(duì)分子質(zhì)量越小，所需鹽濃度越高。根據(jù)這種性質(zhì)，同一溶液中不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，可通過(guò)逐步提高鹽濃度的方法逐一沉淀分離出來(lái)，這種方法稱(chēng)為分級(jí)鹽析。第69頁(yè)/共81頁(yè)等電點(diǎn)鹽析沉淀：鹽析與等電點(diǎn)結(jié)合沉淀效果更好。一般是先將蛋白質(zhì)溶液的pH調(diào)至目的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。然后再加固體(NH4)2SO4或其飽和溶液，使達(dá)到一定濃度后，蛋白質(zhì)即可沉淀析出。第70頁(yè)/共81頁(yè)有機(jī)溶劑沉淀：

水溶性有機(jī)溶劑如丙酮、乙醇等，具有介電常數(shù)比較小，與水的親和力大，能以任何比例與水相溶等特點(diǎn)。當(dāng)向蛋白質(zhì)水溶液中加入適量這類(lèi)溶劑時(shí)，它能奪取蛋白質(zhì)顆粒表面的水化膜，同時(shí)，還能降低水的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)顆粒間的靜電相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集絮結(jié)沉淀。與鹽析法類(lèi)似，沉淀所需有機(jī)溶劑的濃度也與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)，相對(duì)分子質(zhì)量大的要求濃度低，相對(duì)分子質(zhì)量小的要求濃度高。不同相對(duì)分子質(zhì)量的混合溶液，可以通過(guò)調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑的濃度達(dá)到分級(jí)沉淀的目的。等電點(diǎn)有機(jī)溶劑沉淀：

有機(jī)密劑沉淀法若與等電點(diǎn)結(jié)合，沉淀更易發(fā)生，而且徹底。先將提取液pH調(diào)至目的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、再加有機(jī)溶劑到所得要的濃度，蛋白質(zhì)會(huì)很快沉淀析出。注意：在對(duì)蛋白質(zhì)的影響方面，與鹽析法不同。有機(jī)溶劑長(zhǎng)時(shí)間作用于蛋白質(zhì)會(huì)引起變性，因此，用這種方法進(jìn)行操作時(shí)需要注意：（1）低溫操作。（2）有機(jī)溶劑與蛋日質(zhì)接觸時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，在沉淀完全的前提下，時(shí)間越短越好。第71頁(yè)/共81頁(yè)失活沉淀：

重金屬鹽沉淀：當(dāng)溶液pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，易與重金屬離子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等）結(jié)合，生成不溶性鹽類(lèi)，沉淀析出。誤服重金屬鹽的病人，大量口服牛奶、豆?jié){或蛋清能夠解毒，就是因?yàn)檫@些食物中的蛋白質(zhì)與重金屬離子形成不溶性鹽，經(jīng)催吐劑嘔吐排出體外。達(dá)到解毒的目的。生物堿試劑沉淀：當(dāng)溶液的pH低于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分產(chǎn)是陽(yáng)離子形式存在。易與生物堿試劑（如苦味酸、鞣酸、磷鎢酸、磷鉬酸及三氯醋酸等）作用。生成不溶性鹽沉淀，并伴隨發(fā)生蛋白質(zhì)分子變性。實(shí)驗(yàn)室中常用這些試劑定性檢驗(yàn)蛋白質(zhì)或去除蛋白。在啤酒生產(chǎn)工藝中借酒花中的單寧類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)成鹽沉淀，使麥汁得以澄清，防止成品啤酒混濁。熱凝固沉淀：蛋白質(zhì)受熱變性后，將pH調(diào)至等電點(diǎn)，則很容易發(fā)生凝固沉淀。其原因是：由于變性蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)解體，疏水基團(tuán)外露，水化膜破壞，同時(shí)由于等電點(diǎn)破壞了帶電狀態(tài)等而發(fā)生絮結(jié)沉淀。我國(guó)傳統(tǒng)的做豆腐工藝是將豆?jié){煮沸，點(diǎn)入少量鹽鹵（含MgCl2）或石膏（含CaSO4），或者點(diǎn)入酸漿或葡萄糖酸內(nèi)酯將pH調(diào)至等電點(diǎn)，熱變性的大豆蛋白使很快絮結(jié)凝固，經(jīng)過(guò)濾成型則成豆腐。第72頁(yè)/共81頁(yè)5.蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)（1）雙縮脲反應(yīng)雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物。將尿素加熱到180℃，則兩分子尿素縮合成一分子雙縮脲，并放出一分子氨氣。雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物，該反應(yīng)稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮腺反應(yīng)，形成紅紫色絡(luò)合物。通常可用此反應(yīng)定性蛋白質(zhì)，也可根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的顏色在540nm處比色，定量測(cè)定蛋白質(zhì)。（2）Millon（米倫）：反應(yīng)米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合液。蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試劑后立即產(chǎn)生白色沉淀，再加熱后，沉淀變成紅色。酚類(lèi)化合物有此反應(yīng)，酪氨酸含有酚基，故含有酪氨酸的蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)。（3）黃色反應(yīng)：這是含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸所特有的反應(yīng)。蛋白質(zhì)溶液遇硝酸后，先產(chǎn)生白色沉淀，加熱則白色沉淀變成黃色，再加堿，顏色加深成桔黃色。這是因?yàn)橄跛釋⒌鞍踪|(zhì)分子中的苯環(huán)硝化，產(chǎn)生了黃色硝基苯衍生物。例如皮膚、指甲和毛發(fā)等遇濃硝酸會(huì)變成黃色。（4）乙醛酸反應(yīng)：在含有蛋白質(zhì)的溶液中加人乙醛酸，并沿試管壁慢慢注人濃硫酸，在兩液層之間會(huì)出現(xiàn)紫色環(huán)，凡含有吲哚基的化合物都有這一反應(yīng)。色氨酸及含有色氨酸的蛋白質(zhì)有此反應(yīng)，但不含色氨酸的白明膠就無(wú)此反應(yīng)。（5）茚三酮反應(yīng)：蛋白質(zhì)和氨基酸一樣，也能與水合前三酮反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物。實(shí)踐中常利用這一反應(yīng)來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)的存在。但不能區(qū)別蛋白質(zhì)與氨基酸。（6）Folin（福林）-酚試劑反應(yīng)：蛋白質(zhì)分子一般都含有酪氨酸，酪氨酸中的酚基能將福林-酚試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物（即鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。這一反應(yīng)常用來(lái)定量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。（7）坂口反應(yīng)：蛋白質(zhì)分子中的精氨酸含有胍基，能與次氯酸鈉或次溴酸鈉及a-萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色物質(zhì)。此反應(yīng)用以測(cè)定精氨酸或含有精氨酸的蛋白質(zhì)。第73頁(yè)/共81頁(yè)6.蛋白質(zhì)的紫外吸收一般蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處都都最大的吸收率，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故。通常利用這些特異性的吸收，可以測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，如果沒(méi)有干擾物質(zhì)存在的話，可用來(lái)測(cè)定濃度為0.1一0.5mg／ml的蛋白質(zhì)溶液。返回第74頁(yè)/共81頁(yè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的測(cè)定小分子化合物相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定方法冰點(diǎn)降低法、沸點(diǎn)升高法或蒸汽壓減