蛋白質(zhì)組學的研究

蛋白質(zhì)組學的研究第1頁/共47頁蛋白組學研究制作：第五組全體組員第2頁/共47頁網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究方法網(wǎng)絡(luò)藥理學系統(tǒng)生物學基因組學代謝組學網(wǎng)絡(luò)生物學分子對接蛋白組學第3頁/共47頁一、蛋白質(zhì)組學研究背景“proteome”(蛋白質(zhì)組)一詞由澳大利亞Macquaie大學的MarcWilkins于1994年首次提出。指一個基因組、一種生物或一種細胞/組織所表達的全套蛋白質(zhì)。含義含義第4頁/共47頁2001年2月，Nature和Science雜志在公布人類基因組序列草圖的同時，分別發(fā)表了“Andnowfortheproteome”和“Proteomicsingenomeland”的述評與展望，對蛋白質(zhì)組學研究發(fā)出了時代性呼喚。2001年，國際人類蛋白質(zhì)組組織(HumanProteomeOrganization,HUPO)成立，提出了人類蛋白質(zhì)組計劃（HPP)，(/)。眾多國家和地區(qū)成立蛋白質(zhì)組學術(shù)組織并踴躍參與國際計劃。第5頁/共47頁二、研究目的

蛋白質(zhì)組學是識別及鑒定蛋白質(zhì)以及其表達模式，是發(fā)現(xiàn)大量新型生物標志物、藥靶和藥物的重要途徑，已經(jīng)成為世界各國奮力搶占的戰(zhàn)略制高點。

第6頁/共47頁三、蛋白組學研究對象

以蛋白質(zhì)組為研究對象，分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動規(guī)律。蛋白質(zhì)組學運用“一網(wǎng)打盡”的“組學”研究模式，與以往研究單個蛋白質(zhì)的“釣魚”模式有所不同。第7頁/共47頁四、研究范圍1、細胞、組織和體液中蛋白質(zhì)數(shù)量和種類的確定和鑒別2、細胞在正常生理情況和異常情況下蛋白質(zhì)表達水平的差異。4、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖、脂類、DNA、RNA的相互作用等。3、蛋白質(zhì)翻譯的后修飾以及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運和定位。第8頁/共47頁五、蛋白質(zhì)組研究技術(shù)體系總流程圖第9頁/共47頁樣品制備的一般過程對細胞、組織等樣品進行破碎溶解失活和還原斷開蛋白質(zhì)之間的連接鍵提取全部蛋白質(zhì)除去非蛋白質(zhì)部分第10頁/共47頁樣品制備直接影響到蛋白質(zhì)組研究結(jié)果.對于一些特殊的蛋白質(zhì)處理如下：溶解度差的蛋白質(zhì),如膜蛋白、與膜相連的蛋白質(zhì)以及來自具有高抗性組織(頭發(fā)、皮膚等等)的蛋白質(zhì),需要添加破膜劑、兼性離子表面活性劑等以增加蛋白質(zhì)的溶解度,提高蛋白質(zhì)的提取率.有報道采用有機溶劑提取親脂性蛋白;或采用不同溶出緩沖液多步提取各種膜蛋白.第11頁/共47頁蛋白組學核心技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)質(zhì)譜鑒定技術(shù)計算機圖像數(shù)據(jù)處理與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫第12頁/共47頁雙向凝膠電泳一是基于蛋白質(zhì)的等電點不同在pH梯度膠內(nèi)等電聚焦二是根據(jù)分子量的不同大小進行聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS—PAGE分離，把復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開?；驹淼?3頁/共47頁雙向凝膠電泳研究程序樣品制備等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠染色挖取感興趣的蛋白質(zhì)點膠內(nèi)酶切質(zhì)譜分析確定肽指紋圖譜質(zhì)譜分析部分氨基酸序列利用數(shù)據(jù)庫確定蛋白第14頁/共47頁判斷雙向凝膠電泳的好壞通過分析其圖譜而獲得.一張好的圖譜必須低背景、少紋理、分辨率高、靈敏度高,而且圖譜之間必須存在良好的重現(xiàn)性.雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)點的矢量圖(vectormapofthe2-Dgel)是專門用來研究蛋白質(zhì)翻譯后是否修飾的一種方法,通過此法能了解蛋白質(zhì)翻譯后修飾程度.第15頁/共47頁質(zhì)譜鑒定技術(shù)

電噴霧電離(ESI)連續(xù)離子化方式使樣品電離基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)以脈沖離子化方式使樣品電離

“軟電離”技術(shù)第16頁/共47頁電噴霧電離(ESI)

ESI技術(shù)已經(jīng)運用到四極桿質(zhì)譜、飛行時間質(zhì)譜(TOF)、離子阱質(zhì)譜(ITMS)和傅里葉變換離子回旋加速器質(zhì)譜(FTMS),但還不能用于磁質(zhì)譜中.ESI作為液相進樣,它可以與高效液相色譜(HPLC)、毛細管電泳(CE)等技術(shù)相連.雙向凝膠電泳分離直接導(dǎo)入帶有ESI的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析儀中:HPLC-MS/MS適合含10pmol以上的肽樣品;毛細管HPLC-MS/MS適合含幾個皮摩爾到幾十個飛摩爾肽樣品;

CE-MS/MS適合含飛摩爾或更低肽樣品,此儀器靈敏度最高.LC-MS/MS已經(jīng)實現(xiàn)了自動化;固相提取毛細管區(qū)帶電泳與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用初步實現(xiàn)自動化第17頁/共47頁基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)

MALDI常與飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)聯(lián)用,稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALD-ITOF-MS).

目前蛋白質(zhì)的肽指紋譜(peptidefingerprinting,PMF)測定常用MALDI-TOF-MS,也有用ES-IMS.這兩種方法精確度高,均可達011個質(zhì)量單位;靈敏度高,分解亞皮摩爾量的蛋白質(zhì),所產(chǎn)生的小肽段,也可以做質(zhì)譜分析;分析時間短,測定僅需幾分鐘.例如：MALD-ITOF-MS測定蛋白質(zhì)肽指紋譜已經(jīng)實現(xiàn)了高度自動化集成系統(tǒng)在不到10個工作日內(nèi)鑒定了大腸桿菌雙向凝膠上95個蛋白質(zhì)點.

第18頁/共47頁目前,有兩種分離、鑒定蛋白質(zhì)的方法類似于雙向凝膠電泳:一種是采用雙向高效液相與質(zhì)譜聯(lián)用來鑒定蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫檢索:三條有4~6個肽段質(zhì)量肽段便可用來鑒定蛋白質(zhì),根據(jù)所測數(shù)據(jù),可采用不同的軟件檢索:PeptideSearch、TagIdent、MassSearch、Ms-Fit、ProFound、M-sEdman、MOWSE、Ms-Tag、PepFrag、Sequest、MutiIdent.第19頁/共47頁另一種是采用等電聚焦-固相pH梯度(IEF-IPG)作為第一向，分離質(zhì)譜測定分子質(zhì)量作為第二向.綜上所述：質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì),其優(yōu)點是靈敏度高、準確度高,而且容易實現(xiàn)自動化.因此,質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組研究中最重要的鑒定技術(shù).第20頁/共47頁蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫

蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫貯存了有機體、組織或細胞所表達的全部蛋白質(zhì)信息,

通過用鼠標點擊雙向凝膠圖譜上的蛋白質(zhì)點獲得這些信息,如蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果;蛋白質(zhì)的亞細胞定位;在不同條件下有機體、組織或細胞蛋白質(zhì)的表達水平等.目前僅有酵母蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(YPD,)是完整的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,其他數(shù)據(jù)庫需要不斷完善.第21頁/共47頁目前可用Make2ddb軟件來構(gòu)建蛋白質(zhì)組的雙向凝膠數(shù)據(jù)庫.查找蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址是2Dhunt(http://www.expasy.ch/ch2d/2DHunt),一個有機體、組織或細胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫可能由不同研究小組構(gòu)建,它們各有特點,檢索時數(shù)據(jù)庫之間互相連接,可用索引檢索:WORLD-2DPAGE(http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index.html).同基因組靜態(tài)過程相比較,蛋白質(zhì)組是一種動態(tài)過程.第22頁/共47頁蛋白組學研究其他方法與技術(shù)生物質(zhì)譜技術(shù)

生物傳感芯片質(zhì)譜同位素標記和標簽技術(shù)（ICAT）

蛋白質(zhì)芯片

酵母雙雜交系統(tǒng)

噬菌體展示技術(shù)串聯(lián)親和純化（TAP）

生物信息學方法第23頁/共47頁生物質(zhì)譜技術(shù)

基本原理是在樣品離子化后，根據(jù)不同離子質(zhì)荷比(-n／z)的不同進行分離并確定相對分子量，具有靈敏度高、準確度高且易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)。成為蛋白質(zhì)鑒定分析的主要支撐技術(shù)。

生物質(zhì)譜還可應(yīng)用于定量蛋白質(zhì)組分析、蛋白質(zhì)翻譯后修飾(如糖基化、磷?；?以及蛋白質(zhì)相互作用等研究領(lǐng)域。第24頁/共47頁生物傳感芯片質(zhì)譜

是定性和定量檢測蛋白質(zhì)相互作用并對其進行鑒定的簡易方法。

它是以表面等離子激原共振SPR為基礎(chǔ)的生物分子相互作用分析技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)有機結(jié)合而形成的新型技術(shù)。

第25頁/共47頁同位素標記和標簽技術(shù)（ICAT）

是用具有不同質(zhì)量的小分子試劑ICAT去標記處于不同狀態(tài)下的細胞中的蛋白質(zhì)，再利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，就能非常準確地比較出兩份樣品中蛋白質(zhì)表達水平的不同。目前ICAT已成為蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)之一。第26頁/共47頁

蛋白質(zhì)芯片原理是利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、酶與底物、蛋白質(zhì)與其他小分子之間的相互作用，檢測分析蛋白質(zhì)。在硅物質(zhì)如玻璃等固相支持物表面高密度排列的探針蛋白點陣，通過如抗原一抗體專一性結(jié)合等各種相互作用，可特異地捕獲樣品中的靶蛋白，然后通過檢測器對靶蛋白進行定性或定量分析

廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達譜的分析、蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究、臨床疾病的診斷和療效評價、藥物信爬電的篩選和新藥研制的各個領(lǐng)域。第27頁/共47頁

酵母雙雜交系統(tǒng)

基本思路是只有靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后，其中的誘餌蛋白結(jié)合于報道基因的啟動子才能啟動報道基因在酵母細胞內(nèi)的表達，通過檢測報道基因表達產(chǎn)物判別作為“誘餌”和“靶蛋白”的兩個蛋白間是否存在相互作用。第28頁/共47頁噬菌體展示技術(shù)

將編碼噬菌體外殼蛋白的基因上連接—個單克隆抗體的基因序列．當噬菌體生長時，表面就會表達出相應(yīng)的單抗．將噬菌體過柱，檢測單抗與柱上目的蛋白的特異性結(jié)合。第29頁/共47頁串聯(lián)親和純化（TAP）

集成了經(jīng)典的親和純化和免疫共沉淀這兩種技術(shù)的優(yōu)點，可像前者得到高純度、低拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)復(fù)合體，也繼承了后者運用特異性的標記蛋白與親和柱之間的相互作用。

可快速地得到生理條件下與目標蛋白存在真實相互作用的蛋白質(zhì)。第30頁/共47頁

生物信息學方法生物信息學是在生命科學、計算機科學和數(shù)學的基礎(chǔ)上逐步發(fā)展而形成的一門新興交叉學科。生物信息學的研究內(nèi)容已經(jīng)從對基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的高效分析，轉(zhuǎn)移到比較基因組學、代謝網(wǎng)絡(luò)分析、基因表達譜網(wǎng)絡(luò)分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析以及藥物靶點篩選等領(lǐng)域。第31頁/共47頁六、蛋白質(zhì)組學的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學主要應(yīng)用：在微生物研究中，主要在模式微生物以及病原微生物這兩大方面。在模式微生物中，主要是大腸桿菌和酵母的蛋白質(zhì)組學研究。一些專門收錄微生物蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)庫日益完善。實例(一)在病原微生物方面，2006年Tahefi[21]將HIV主要衣殼蛋白p24-gag展示在T4噬菌體的hoc蛋白上，將帶有p24的噬菌體免疫小鼠除產(chǎn)生了高效價的抗體外，還觸發(fā)機體體液免疫和細胞免疫的參與。第32頁/共47頁實例(二)ZhangY等[27]用結(jié)腸癌細胞SW480和人正常的腸上皮細胞對噬菌體7肽庫進行了多輪篩選,結(jié)果顯示CP15(VHLGYAT)與結(jié)腸癌細胞SW480結(jié)合率高，而對正常的腸上皮細胞幾乎不結(jié)合，為診斷結(jié)腸癌和開發(fā)治療結(jié)腸癌藥物奠定了基礎(chǔ)。Bacarese-Hamilton等[22]將5種病毒的抗原點在玻片上制成抗原芯片，用于分析人血清IgG、IgM，結(jié)果表明，檢測濃度最低小于0.5pg。與ELISA檢測的符合率大于80%。蛋白質(zhì)組學在其他領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，如在植物學以及藥物開發(fā)和評價上等。第33頁/共47頁實例(三)第34頁/共47頁本研究針對激素性骨壞死模型組，中藥治療組及空白對照組骨組織總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進行比較，獲得了3個差異蛋白。隨后對這3個差異蛋白進行了質(zhì)譜分析，得到其肽質(zhì)量指紋譜，通過數(shù)據(jù)庫MASCOT軟件搜索對三個蛋白進行了初步鑒定。第35頁/共47頁該研究操作步驟材料和試劑動物處理動物骨組織蛋白樣品提取和處雙向電泳質(zhì)譜樣品的制備質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)庫查詢得出結(jié)果第36頁/共47頁1、不同對照組大鼠骨組織蛋白雙向電泳圖譜的比較第37頁/共47頁2、不同對照組大鼠骨組織蛋白雙向電泳圖譜差異點第38頁/共47頁3、不同對照組大鼠骨組織蛋白2-DE圖譜中差異蛋白點的肽質(zhì)量指紋圖譜第39頁/共47頁第40頁/共47頁第41頁/共47頁4、P1，P2，P3在數(shù)據(jù)庫搜索的結(jié)果第42頁/共47頁結(jié)果P1搜索到一種蛋白質(zhì)與之相匹配，即阻凝蛋白重鏈ⅡB。P2在數(shù)據(jù)庫中檢索到一種與之相匹配的蛋白質(zhì)，即磷脂谷胱甘肽過氧化酶，P3在數(shù)據(jù)中搜索到一種與之相匹配的蛋白質(zhì)，即泛素化酶E2(MW：17KD)。第43頁/共47頁意義通過蛋白質(zhì)組學研究的方法，研究了激素性壞死模型組、中藥治療組以及對照組的骨組織蛋白質(zhì)組的表達變化情況，并利用質(zhì)譜分析結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)查詢，初步鑒定了其中的差異蛋白質(zhì)點，經(jīng)過分析，結(jié)合文獻資料總結(jié)，這些蛋白質(zhì)在不同疾病中都確實與糖皮質(zhì)激素作用相關(guān)，這為揭示激素性骨壞死的發(fā)病機理和中藥的治療機理，提供了全新的實驗證據(jù)，能夠大大推進我們從分子水平認識激素性骨