艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)

艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第1頁HIV感染機(jī)制簡(jiǎn)述

HIV在病毒分類中屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中人類免疫缺點(diǎn)病毒組。迄今為止，依據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和病毒核酸序列測(cè)定，全球流行HIV可分為2型：HIV-1型和HIV-2型。在HIV-1型內(nèi)，依據(jù)編碼包膜蛋白env基因和編碼殼蛋白gag基因序列同源性又深入分為3個(gè)組：Ｍ組（主要組）、Ｏ組（外圍組）和Ｎ組（新組或非M非O組），Ｍ組內(nèi)又可分為Ａ-Ｊ10個(gè)亞型。在HIV-1型和HIV-2型之間,其核苷酸序列有45％-50%同源性，而且存在免疫交叉反應(yīng)。應(yīng)用免疫印跡法(Westblot)能夠?qū)⒍呙鞔_地域別開來。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第2頁HIV感染機(jī)制簡(jiǎn)述HIV-1和HIV-2型即使都起源于非洲，但HIV不一樣型，不一樣組甚至不一樣亞型在全球流行是不均一。HIV-1O組，N組和HIV-2型只局限在非洲一些局部地域流行。而HIV-1M組病毒呈全球性流行。到當(dāng)前為止，全球流行絕大多數(shù)毒株是HIV-1M組中A、C亞型毒株，接著是B亞型毒株，然后是A/E和A/G亞型重組毒株。深入分子流行病調(diào)查表明，在非洲幾乎流行了HIV全部亞型，但以A和C亞型為主，同時(shí)，也正因?yàn)楸姸鄟喰凸擦餍?，那里也是發(fā)生病毒重組最多地方。在北美、歐洲和澳大利亞，B亞型依然是最常見亞型，即使M組其它幾個(gè)亞型、甚至O組病毒已經(jīng)在美國(guó)和歐洲幾個(gè)國(guó)家有報(bào)道，但深入現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，這些人中大多數(shù)是來自非洲移民。在南美，B亞型占有優(yōu)勢(shì)，但C、F亞型也有流行。在阿根廷和巴西有B/F重組毒株報(bào)道。在亞洲，好幾個(gè)不一樣HIV-1亞型流行于不一樣區(qū)域，在印度C亞型占主導(dǎo)，同時(shí)有A、B亞型共流行和A/C亞型重組毒株報(bào)道。在泰國(guó)則有二種獨(dú)立亞型流行，B亞型和E亞型（即A/E亞型重組毒株）。在我國(guó)主要以B、C和E亞型流行，但同時(shí)也A、F和HIV-2型報(bào)道。

艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第3頁HIV感染機(jī)制簡(jiǎn)述HIV病毒侵入人體后，其表面糖蛋白gp120與細(xì)胞表面受體蛋白CD4以高親和力結(jié)合，吸附到宿主細(xì)胞上；gp120再與宿主細(xì)胞表面輔助受體相互作用，使病毒與宿主細(xì)胞膜更靠近；gp41產(chǎn)生一系列構(gòu)象改變，其N端融合肽片段插入宿主細(xì)胞膜，造成病毒包膜與細(xì)胞膜最終融合，病毒RNA進(jìn)入細(xì)胞。在HIV感染后，最先能夠監(jiān)測(cè)到病毒RNA、然后是p24抗原，最終是抗體。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第4頁HIV感染機(jī)制簡(jiǎn)述在感染后10～14d內(nèi)，病毒RNA水平是呈指數(shù)上升，隨即下降并保持在連續(xù)穩(wěn)定水平上，進(jìn)入HIV無癥狀期p24抗原水平伴隨病毒RNA水平發(fā)展而發(fā)展，在急性感染期就能夠出現(xiàn)，被認(rèn)為是病毒復(fù)制間接標(biāo)志，但因?yàn)闄z測(cè)方法靈敏度不夠而使得其檢出時(shí)間要比RNA晚。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第5頁HIV感染機(jī)制簡(jiǎn)述窗口期概念：從HIV感染到能夠檢測(cè)出HIV抗體這一時(shí)期,被稱作“窗口期”。在窗口期，只有經(jīng)過病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴細(xì)胞水平來確定HIV感染。CD4淋巴細(xì)胞水平伴隨感染發(fā)展而逐步下降,當(dāng)其在血液中細(xì)胞下降到200個(gè)/mm3時(shí)，就會(huì)發(fā)生嚴(yán)重免疫缺點(diǎn)，患者就被確診為艾滋病。病毒RNA、p24抗原、HIV抗體和CD4淋巴細(xì)胞水平能夠用來確定HIV感染、檢測(cè)病情發(fā)展。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第6頁HIV感染主要檢測(cè)方法當(dāng)前檢測(cè)HIV方法有100各種，總體來說能夠分為抗體檢測(cè)和病毒檢測(cè)兩大類。早期對(duì)HIV診療主要是經(jīng)過血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)抗HIV抗體,間接地診療HIV感染。病毒檢測(cè)包含p24抗原檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)(病毒分離)和病毒核酸檢測(cè)?？乖軌蛟趥€(gè)體感染后先于血清轉(zhuǎn)化2～18d被檢測(cè)到。所以，在血清轉(zhuǎn)化期經(jīng)過檢測(cè)p24抗原有著很大優(yōu)勢(shì)，能夠作為早期輔助診療HIV感染一個(gè)方法。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第7頁HIV感染主要檢測(cè)方法病毒培養(yǎng)是檢測(cè)HIV感染最準(zhǔn)確方法。普通采取培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)方法進(jìn)行HIV診療。在窗口期能夠檢測(cè)到病毒相關(guān)抗原或分離病毒。病毒核酸檢測(cè)通常是經(jīng)過檢測(cè)HIVRNA水平來反應(yīng)病毒載量，含有很高靈敏度，使用適時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，能夠在HIV感染前2周檢測(cè)到病毒核酸。病毒核酸檢測(cè)方法可用于HIV早期診療，如窗口期輔助診療、病程監(jiān)控、指導(dǎo)治療方案及療效測(cè)定、預(yù)測(cè)疾病進(jìn)程等。當(dāng)前常見測(cè)定方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn)(RTPCR)、核酸序列擴(kuò)增試驗(yàn)(NASBA)、分支DNA雜交試驗(yàn)(bDNA)等。近幾年，分子生物學(xué)方法不停被應(yīng)用到HIV檢測(cè)中，HIV試驗(yàn)室診療方法取得了很大進(jìn)展，核酸檢測(cè)已經(jīng)成為了HIV試驗(yàn)室診療發(fā)展方向。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第8頁HIV感染主要檢測(cè)方法抗體通常是在感染后3～8周能夠被檢測(cè)出來，在窗口期，病毒抗體不能被檢出?？贵w檢測(cè)由初篩和確認(rèn)試驗(yàn)組成，當(dāng)前，大多應(yīng)用雙抗原夾心法進(jìn)行抗體篩查，這種方法含有很好靈敏性和特異性。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法有一定靈敏度，且操作簡(jiǎn)單、快速，適合對(duì)大量樣品檢測(cè)，是當(dāng)前臨床通用初篩檢測(cè)方法，初篩試驗(yàn)呈陽性必須進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。確證試驗(yàn)國(guó)際上有3種確認(rèn)試驗(yàn)方法，包含免疫印跡試驗(yàn)、條帶免疫試驗(yàn)及免疫熒光試驗(yàn),當(dāng)前以免疫印跡試驗(yàn)最為常見。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第9頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法HIV抗體普通在人感染后數(shù)周逐步出現(xiàn),可延續(xù)至終生，95%在三個(gè)月能夠檢測(cè)出抗體。血清學(xué)試驗(yàn)分為初篩和確認(rèn)試驗(yàn)。常規(guī)試驗(yàn)方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)(WestBlot)、間接免疫熒光法(IFA)?？焖贆z測(cè)方法：明膠顆粒凝集試驗(yàn)、斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)、Ｐ24抗原檢測(cè)。最常見初篩試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn)分別是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫印跡試驗(yàn)(WB)。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第10頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法常見HIV病原學(xué)檢測(cè)方法:病毒分離抗原檢測(cè)--Ｐ24抗原檢測(cè)核酸檢測(cè)（cDNA測(cè)定-PCR、RNA測(cè)定-病毒載量）其它方法：逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定、原位雜交常見HIV抗體檢測(cè)方法:ELISA

快速HIV檢測(cè)（RT）免疫印記法（WesternBlot）其它方法：免疫熒光法（IFA）、放射免疫沉淀艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第11頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：ELISA法基礎(chǔ)原理是免疫反應(yīng)物經(jīng)過化學(xué)或免疫學(xué)方法形成酶結(jié)合物，酶結(jié)合物能與待檢樣品中對(duì)應(yīng)抗原或抗體結(jié)合成為免疫復(fù)合物,然后加入酶底物,經(jīng)酶催化或水解作用,無色底物產(chǎn)生顏色,用肉眼、分光光度計(jì)觀察結(jié)果。分類：雙抗原夾心法測(cè)抗體、雙抗體夾心法測(cè)抗原、間接法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法、捕捉包被法等因?yàn)槊复呋屎芨?，間接地放大了免疫反應(yīng)結(jié)果，使測(cè)定方法到達(dá)很高敏感度。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第12頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法ELISA結(jié)果判斷：試驗(yàn)是否成立判斷：陰性對(duì)照（NC）和陽性對(duì)照（PC1，PC2）要求條件Cutoff值確實(shí)定灰區(qū)概念：把定量分析正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復(fù)試驗(yàn)或換試劑重測(cè)以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則匯報(bào)陽性，

灰區(qū)概念對(duì)血站系統(tǒng)獻(xiàn)血員篩查尤為主要。高值鉤鐮效應(yīng)（HD-HOOK）：在二位點(diǎn)夾心ELISA中，其劑量反應(yīng)曲線高劑量（HIGH

DOSE，HD）區(qū)段，線性走向不是呈平臺(tái)狀無限后延，而是向下彎曲狀。產(chǎn)生該現(xiàn)象分子機(jī)理有"分子變構(gòu)說"和"濃度效應(yīng)"等推論。一步法和二步法均存在，

只是前者出現(xiàn)更早些，大多數(shù)是高值低吸光度，極少陰性結(jié)果。匯報(bào)：對(duì)HIV抗體篩查試驗(yàn)，呈陰性反應(yīng)者可出具“HIV抗體陰性”匯報(bào),對(duì)初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)者不能出陽性匯報(bào)，可出具“HIV抗體待復(fù)查”匯報(bào).艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第13頁ELISA試驗(yàn)影響原因試劑質(zhì)量--選擇質(zhì)量?jī)?yōu)良檢測(cè)試劑，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。選擇靈敏度高，特異性好試劑。不一樣廠家出產(chǎn)試劑靈敏度與特異性存在一定差異，影響靈敏度原因：試劑平衡30分鐘：試劑沒有平衡或平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分，靈敏度顯著偏低。。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。試劑存放：試劑在室溫放置24小時(shí)后靈敏度開始下降，放置時(shí)間越長(zhǎng)、室溫溫度越高靈敏度下降越顯著；試驗(yàn)過程中任何一步縮短時(shí)間靈敏度都顯著下降，假如同時(shí)縮短每一步反應(yīng)時(shí)間靈敏度下降更顯著超出使用期試劑靈敏度顯著下降，超出時(shí)間越長(zhǎng)下降越顯著。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第14頁ELISA試驗(yàn)影響原因標(biāo)本質(zhì)量：最好將血液先自然存放1-2小時(shí)后，再用3000rmp離心15分鐘；標(biāo)本為血漿：必須使用含抗凝劑血液標(biāo)本搜集管，采血后必須馬上顛倒采血管混合5-10次，放置一段時(shí)間后，3000rpm離心15分鐘；若在幾天內(nèi)檢測(cè)，可放在2-8℃冰箱中，若要貯存，則置于-20℃低溫冰箱內(nèi)。干擾物質(zhì)影響，大約40%人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，能夠不一樣程度影響檢測(cè)結(jié)果；常見干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF因子可與標(biāo)識(shí)二抗FC段法結(jié)合造成假陽性，高濃度AFP（如孕婦），在儲(chǔ)存過程中可能形成二聚體會(huì)造成本底過深影響檢測(cè)結(jié)果。溶血標(biāo)本及混有紅細(xì)胞血清采取ELISA法檢測(cè)易產(chǎn)生假陽性

可能是溶血血清中含有過氧化酶物質(zhì)（紅細(xì)胞或血紅蛋白中亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，會(huì)釋放出原生態(tài)氧(O)，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性有色物質(zhì)，即顯藍(lán)色，產(chǎn)生假陽性。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第15頁ELISA試驗(yàn)影響原因標(biāo)本質(zhì)量：因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，所以，被細(xì)菌污染標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。在冰箱中保留過久標(biāo)本，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)造成本底過深、造成假陽性；為克服上述干擾，ELISA測(cè)定血清標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能馬上測(cè)定，5d內(nèi)測(cè)定血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測(cè)定血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性

最好使用真空采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留個(gè)別纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過程中能夠形成肉眼可見纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；所以血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。

艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第16頁ELISA試驗(yàn)影響原因加樣：加樣不可太快，要防止加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法確保微量加樣準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部非包被區(qū)，易造成非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同試劑盒這次測(cè)定為陽性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑錯(cuò)誤所致。手工操作中，加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等候時(shí)間過長(zhǎng)(尤其是室內(nèi)溫度較高時(shí))；全自動(dòng)酶標(biāo)儀也存在一樣問題，孵浴時(shí)間差距較大。標(biāo)本較多時(shí)，請(qǐng)分批操作。吸量不準(zhǔn)確，直接影響檢測(cè)結(jié)果。所以加樣器也要經(jīng)常清洗，定時(shí)校準(zhǔn)。加完標(biāo)本再加酶試劑時(shí)酶濺出孔外。加樣次序艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第17頁ELISA試驗(yàn)影響原因孵?。簻赜荅LISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵一個(gè)原因?？乖贵w結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不一樣，造成周圍與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在顯著差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，降低受熱不均，貼密封膜，預(yù)防污物浸入和水分蒸發(fā)。孵育時(shí)未貼封片或加蓋，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底；孵育時(shí)間人為延長(zhǎng)，造成非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第18頁ELISA試驗(yàn)影響原因洗板：是ELISA操作主要步驟，手洗條件一致性較差，對(duì)結(jié)果影響較大，全自動(dòng)洗板機(jī)使用不妥也會(huì)影響結(jié)果，血清中殘留纖維蛋白絲或洗滌液析出結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔處于阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)識(shí)酶洗脫不徹底，抽吸不完全；洗板不暢，造成洗板效果差。造成“花板”造成假陽性或假陰性；洗液量不足，確保洗液注滿各孔。采取手工洗板,孔與孔之間液體交叉。采取半自動(dòng)洗板機(jī)洗板時(shí)，洗液量不足，造成洗板不徹底；反應(yīng)板過多造成洗板等候時(shí)間長(zhǎng)。及時(shí)更換吸水紙，尤其是拍過酶標(biāo)識(shí)物吸水紙一定要棄去，不然可能影響試驗(yàn)結(jié)果。

艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第19頁ELISA試驗(yàn)影響原因顯色：普通來說，顯色時(shí)間過短，結(jié)果偏低；顯色時(shí)間過長(zhǎng)，空白增高或者非特異性顯色增加。顯色劑配制后放置時(shí)間過長(zhǎng)或使用過期顯色劑；尤其是國(guó)產(chǎn)試劑。盡可能臨用時(shí)配置。堅(jiān)持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍(lán)色TMB顯色劑不用；加顯色劑時(shí)濺出孔外造成液體回流。終止：加終止液時(shí)產(chǎn)生較多氣泡，造成假陽性增加。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第20頁ELISA試驗(yàn)影響原因讀板：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇問題。所謂單波長(zhǎng)比色即是通常以對(duì)顯色含有最大吸收波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得吸光度即為臟物吸光度值。最終酶標(biāo)儀給出數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下吸光度值與非常感波長(zhǎng)下吸光度值差。所以，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定含有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度影響優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)镋LISA測(cè)定中單個(gè)空白孔非特異吸收上有一定程度不確定性，也就是說每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置不一樣都有可能得到不一樣吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，最好是使用雙波長(zhǎng)比色。

艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第21頁ELISA試驗(yàn)中常見問題顯色淡，靈敏度偏低：試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng)，溫度太高試劑盒未充分平衡培養(yǎng)箱溫度不足37℃保溫時(shí)間不足洗滌時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過長(zhǎng)、洗滌次數(shù)增加移液器吸液量不足，吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔漏加試劑或底物作用時(shí)間不足艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第22頁ELISA試驗(yàn)中常見問題背景深，全部呈有色：洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成份殘留或酶標(biāo)識(shí)物殘留樣品污染培養(yǎng)箱溫度超出37℃或反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)吸嘴重復(fù)使用，未洗凈或消毒不徹底酶等試劑混用一次試驗(yàn)標(biāo)本量過多，加樣時(shí)間太長(zhǎng)，造成實(shí)際反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第23頁ELISA試驗(yàn)中常見問題出現(xiàn)白板，陽性對(duì)照不顯色顯色液變質(zhì)洗滌液配制有誤--按說明書所表示稀釋倍數(shù)配制未加酶結(jié)合物終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂冒滩】贵w檢測(cè)技術(shù)第24頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法初篩用HIVELISA試劑當(dāng)前已經(jīng)發(fā)展到第四代檢測(cè)試劑。第一代試劑主要以病毒裂解物或個(gè)別純化病毒抗原包被反應(yīng)板,以檢測(cè)血清中抗體。因?yàn)榘豢乖缓芗?假陽性率較高。第二代試劑使用基因工程方法得到重組抗原和合成肽包被反應(yīng)板，因?yàn)榧兓乖褂?特異性有了很大提升。第三代試劑使用雙抗原夾心法檢測(cè)抗體,深入提升了敏感性。第四代試劑則在第三代基礎(chǔ)上深入增加了P24抗原檢測(cè),把HIV抗原和抗P24抗體同時(shí)包被反應(yīng)板,可同時(shí)檢測(cè)血清中HIV抗體和P24抗原。當(dāng)前我國(guó)主要使用第三代艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第25頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法HIV抗體篩查試驗(yàn)基礎(chǔ)要求：篩查試劑必須是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)同意、批檢合格、臨床評(píng)定質(zhì)量?jī)?yōu)良、在使用期內(nèi)試劑。提議采取國(guó)家參比室試劑考評(píng)質(zhì)量?jī)?yōu)良試劑。--中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性艾中心網(wǎng)站艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第26頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法免疫印跡試驗(yàn)：免疫印跡試驗(yàn)主要用于確認(rèn)試驗(yàn)，基礎(chǔ)原理是HIV全病毒抗原經(jīng)過SDSPAGE電泳,將分子量大小不等蛋白帶分離開來,然后再把這些已經(jīng)分離不一樣蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀,每一條硝酸纖維素膜上均含有經(jīng)電泳分離過HIV病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1/100,再把它直接加到硝酸纖維素膜上,恒溫震蕩,使其充分接觸反應(yīng),血清中若含有抗HIV抗體,就會(huì)與膜條上抗原帶相結(jié)合。加入抗人IgG酶結(jié)合物和底物后,即可使有反應(yīng)抗原抗體結(jié)合帶展現(xiàn)紫褐色,依據(jù)出現(xiàn)條帶情況判定結(jié)果有匯報(bào)說，免疫印跡試驗(yàn)特異性不是很好,有大約2％假陽性率，但免疫印跡試驗(yàn)依然是當(dāng)前最常見HIV確認(rèn)試驗(yàn)。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第27頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法嬰幼兒HIV抗體陽性不能用于診療感染HIV，嬰幼兒體內(nèi)從母親得到HIV抗體連續(xù)存在時(shí)間最長(zhǎng)不超出18個(gè)月。在18月齡以前能夠用各種不一樣非抗體依賴性檢驗(yàn)方法對(duì)新生兒HIV感染進(jìn)行輔助診療，包含：HIVP24抗原檢測(cè)、病毒分離培養(yǎng)、RNA或DNA測(cè)定。18月齡以前嬰幼兒感染HIV診療要結(jié)合臨床表現(xiàn)和試驗(yàn)室綜合診療。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第28頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法免疫熒光試驗(yàn)(IFA)：基礎(chǔ)原理為采取熒光染料CalcienAM標(biāo)識(shí)Ｈ9或HUT78培養(yǎng)細(xì)胞作為載體,用HIV感染細(xì)胞,該細(xì)胞內(nèi)就會(huì)含有HIV抗原,將HIV感染淋巴細(xì)胞涂于玻片上,固定，制備為抗原片加入待檢血清，待檢血清中抗HIV抗體與抗原結(jié)合后,再與熒光素標(biāo)識(shí)抗人Ig結(jié)合,在熒光顯微鏡下可見到細(xì)胞內(nèi)有黃綠色熒光。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第29頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA)：PA基礎(chǔ)過程是先將樣品稀釋,然后分別加入經(jīng)抗原致敏和未致敏明膠顆粒,混勻后保溫(普通為室溫)。當(dāng)血清中有HIV抗體存在時(shí),經(jīng)抗原致敏明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng),依據(jù)明膠顆粒在孔中凝集情況判讀結(jié)果。PA操作簡(jiǎn)便,無需特殊儀器設(shè)備,適合對(duì)少許標(biāo)本檢測(cè)。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第30頁（PA）檢測(cè)結(jié)果判定艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第31頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法斑點(diǎn)EIA或稱斑點(diǎn)ELISA（dot-EIA）：以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點(diǎn)狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10min以內(nèi)，使用抗原量少。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第32頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)金標(biāo)紙條采取雙抗原夾心法免疫測(cè)定原理，選擇經(jīng)純化基因工程制備gp36、gp41、p24抗原作為包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作為膠體金結(jié)合抗原。當(dāng)待檢標(biāo)本中含有HIV抗體時(shí)，先和金標(biāo)識(shí)抗原結(jié)合，因?yàn)閷游鲎饔梅磻?yīng)復(fù)合物沿硝酸纖維膜向前移動(dòng)，當(dāng)碰到包被抗原時(shí)，形成Ag-Ab-Ag-Au復(fù)合物而富集在包被線上，形成紅色沉淀線。同時(shí)在包被膜上還有一條質(zhì)控線對(duì)照，故當(dāng)有兩條紅線時(shí)判為陽性，只有一條紅線時(shí)，判為陰性。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第33頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)試劑穩(wěn)定，可室溫長(zhǎng)久保留。試驗(yàn)時(shí)不需任何設(shè)備，快速、簡(jiǎn)便、特異性很好，敏感性約相當(dāng)于中度敏感ELISA，適合用于應(yīng)急檢測(cè)、門診急診個(gè)體檢測(cè)，尤其是基層單位。當(dāng)前已經(jīng)有在我國(guó)被SFDA同意注冊(cè)國(guó)外進(jìn)口試劑和我國(guó)產(chǎn)品。普通可在1030min內(nèi)判讀結(jié)果。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第34頁反應(yīng)艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第35頁金標(biāo)法（膠體硒法）結(jié)果判定艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第36頁當(dāng)前常見HIV抗體、抗原檢測(cè)方法艾滋病唾液檢測(cè)卡：在硝酸纖維膜上包被人工合成HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同時(shí)檢測(cè)含在唾液中HIV-1/HIV-2抗體，原理為酶免疫間接法。主要檢測(cè)唾液中HIVIgA與IgG抗體，敏感性特異性與ELISA相近，可防止靜脈穿刺。但樣品預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)且售價(jià)較高。以唾液為樣品測(cè)定HIV抗體ELISA、免疫印跡法（WB）試劑已經(jīng)美國(guó)FDA同意。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第37頁快速HIV檢測(cè)與ELISA-HIV檢測(cè)比較快速* 平均45分鐘 （10分鐘－2.5小時(shí)）常規(guī) 平均3.5小時(shí) （94分鐘－16小時(shí)）*普通不要特殊設(shè)備，試劑可不用冰箱存放艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第38頁快速試劑不足普通不用于血液篩查有一定假陽性反應(yīng)，如作為臨床診療，要復(fù)檢和確認(rèn)有一定假陰性反應(yīng)（尤其暴露時(shí)間<3個(gè)月）艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第39頁當(dāng)前HIV檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)和進(jìn)展

細(xì)胞培養(yǎng)方法檢測(cè)HIV專一性強(qiáng)，不會(huì)出現(xiàn)假陽性，對(duì)于確認(rèn)那些抗原/抗體檢測(cè)不確定個(gè)體和陽性母親新生兒是否感染HIV有著主要意義。不過須要有一定數(shù)量感染細(xì)胞存在才能培養(yǎng)和分離出病毒來，因而敏感性差、操作時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜，必須在特定P3試驗(yàn)室中才能進(jìn)行，且費(fèi)用較高(每次培養(yǎng)需要約200～500美元)，不適合用于臨床。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第40頁當(dāng)前HIV檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)和進(jìn)展

p24抗原檢測(cè)能夠在病毒開始復(fù)制后檢測(cè)到血液中可溶性p24抗原，檢測(cè)p24抗原縮短窗口期（可提前1-2周），最早可達(dá)9天。HIV-P24抗原陽性僅作為HIV感染窗口期輔助診療依據(jù)，檢測(cè)早期感染，不能據(jù)此確診。易出現(xiàn)假陽性。陽性結(jié)果必須經(jīng)中和試驗(yàn)確認(rèn)，該結(jié)果才可作為HIV感染輔助診療依據(jù)。HIV1p24抗原檢測(cè)陰性，只表示在本試驗(yàn)中無反應(yīng)，不能排除HIV感染。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第41頁當(dāng)前HIV檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)和進(jìn)展

病毒核酸檢測(cè)方法含有很高靈敏度，對(duì)疾病進(jìn)展監(jiān)測(cè)、抗病毒療效觀察和耐藥性監(jiān)測(cè)非常主要。不過，因?yàn)镠IV基因多樣性，沒有一套引物能夠覆蓋全部HIV序列，使檢測(cè)敏感性又受到限制；現(xiàn)有病毒核酸檢測(cè)方法或是檢測(cè)儀器、檢測(cè)試劑昂貴，檢測(cè)1次病毒載量需要上千元(約1500元)，或是操作復(fù)雜，對(duì)操作人員要求高，既難以在普通試驗(yàn)室推廣，又不適合用于對(duì)大量患者快速檢測(cè)，一樣不適合廣泛臨床應(yīng)用。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第42頁當(dāng)前HIV檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)和進(jìn)展

基困芯片應(yīng)用于HIV檢測(cè)得到快速發(fā)展，基因芯片技術(shù)廣泛用于HIV病毒測(cè)序、分型及多態(tài)性分析用基因芯片技術(shù)對(duì)HIV等傳染病病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，1毫升血液中只要含有100個(gè)病毒顆粒即可得出結(jié)論，而以前檢測(cè)方法要等到血液中病毒顆粒到達(dá)1萬甚至10萬才能奏效。該技術(shù)較為復(fù)雜，且成本高，當(dāng)前對(duì)其應(yīng)用仍大多停留在試驗(yàn)階段，離臨床檢驗(yàn)及疾病診療普及性還有一段距離。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第43頁當(dāng)前HIV檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)和進(jìn)展

總而言之各種試驗(yàn)方法能夠依據(jù)HIV感染不一樣時(shí)期與狀態(tài)選擇不一樣檢測(cè)伎倆。HIV原發(fā)感染2周內(nèi)，任何方法均無法檢測(cè)到病毒，2周后出現(xiàn)病毒血癥時(shí)，可檢測(cè)病毒抗原，感染6周~8周后能夠選擇檢測(cè)抗體方法。利用PCR技術(shù)可用來追蹤HIV自然感染史；可用來監(jiān)測(cè)長(zhǎng)久潛伏期患者；以及在抗病毒治療期間病毒載量水平；也可用于HIV血清陽性母親嬰兒HIV檢測(cè)。在嬰兒出生后最初6個(gè)月~9個(gè)月期間。他們血清中存在母體抗體，所以用PCR可判定嬰兒是否真正被HIV感染。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第44頁當(dāng)前HIV檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)和進(jìn)展就當(dāng)前而言，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是血清學(xué)HIV抗體檢測(cè)，它是診療艾滋病感染者和艾滋病主要指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目，分子生物芯片等更新檢測(cè)技術(shù)可能會(huì)廣泛應(yīng)用于HIV檢測(cè)咱們應(yīng)親密注視檢測(cè)技術(shù)發(fā)展，以更準(zhǔn)確、快速方法對(duì)HIV感染作出診療。所以，既要提升檢測(cè)敏感性、特異性，縮短窗口期，又要簡(jiǎn)便、快速和降低成本已成為HIV檢測(cè)技術(shù)發(fā)展要求和方向，很多研究正致力于尋找病毒檢測(cè)替換技術(shù)。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第45頁當(dāng)前HIV檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)和進(jìn)展

多年來，HIV檢測(cè)技術(shù)取得了很大進(jìn)展。如發(fā)展了ICDp24抗原測(cè)定法(immunecomplexdisassociate，免疫復(fù)合物解離，ICD)，將免疫復(fù)合物熱解離后經(jīng)過TSA信號(hào)放大系統(tǒng)使用ELISA進(jìn)行檢測(cè)，使p24抗原檢測(cè)最小檢出值由原來10pg/ml降低到0.5pg/ml，在HIV-1抗體陽性母親所生嬰兒早期診療中與RNA檢測(cè)相當(dāng)，與HIV核酸檢測(cè)含有可比性，含有主要實(shí)用價(jià)值。第四代HIV檢測(cè)試劑、超敏感EIA、線性免疫酶測(cè)定(linealimmunoenzymaticassay)等，使檢測(cè)出HIV感染時(shí)間大大提前。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第46頁當(dāng)前HIV檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)和進(jìn)展窗口期問題：窗口期是從被感染到身體產(chǎn)生足夠多特定抗體這段時(shí)間，“足夠多”是指能被咱們當(dāng)前測(cè)試伎倆檢測(cè)出來。人被感染后身體會(huì)制造抗體來反抗病毒，當(dāng)身體產(chǎn)生足夠多抗體后，抗體測(cè)試將呈陽性。不一樣人對(duì)病毒感染反應(yīng)有一點(diǎn)差異，以至于不一樣人“窗口期”長(zhǎng)度也有微小改變。關(guān)于窗口期到底有多長(zhǎng)問題，當(dāng)前醫(yī)學(xué)界存在很多爭(zhēng)論，有說6—8周，也有說3個(gè)月，最保守說法是6個(gè)月！我國(guó)比較認(rèn)同說法是3個(gè)月，HIV抗體窗口期存在只能縮小但無法防止。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第47頁當(dāng)前HIV檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)和進(jìn)展提升檢測(cè)試劑靈敏度：新試劑研發(fā)病毒相關(guān)抗原或病毒分離：第四代試劑應(yīng)用，核酸檢測(cè)在發(fā)達(dá)國(guó)家進(jìn)行血液篩查被普遍應(yīng)用。德國(guó)NAT使HIV殘余危險(xiǎn)度由1：277萬降低到1：554萬，法國(guó)由1：307 萬下降到：315萬（對(duì)多份標(biāo)本進(jìn)行混合集合，RT-PCR方法檢測(cè)，對(duì)陽性集合進(jìn)行拆分）窗口檢疫期（血漿制品—90天）艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第48頁

HIV抗體檢測(cè)試劑發(fā)展

從1985年第1代HIV抗體檢測(cè)試劑問世到現(xiàn)在，HIV血清學(xué)檢測(cè)試劑已經(jīng)發(fā)展到了第4代。第4代ELISA試劑優(yōu)點(diǎn)在于能同時(shí)檢測(cè)抗原和抗體，降低血源篩查殘余危險(xiǎn)度。與第3代抗HIV1/2試劑相比，檢出時(shí)間提前了4～5d，窗口期縮短了1周多，在對(duì)艾滋病早期診療效果上顯著優(yōu)于第3代。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第49頁HIV抗體檢測(cè)試劑發(fā)展但使用第4代試劑對(duì)艾滋病毒進(jìn)行檢測(cè)，依然有2～3周窗口。另外，因?yàn)榘芽乖涂贵w同時(shí)包被在反應(yīng)板上，存在著相互干擾可能，影響了免疫反應(yīng)特異性。普通來講，使用第4代試劑檢測(cè)p24抗原，其靈敏度(20～100pg/mL)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單獨(dú)檢測(cè)抗原抗體分析法(3.5～10pg/mL)。從方法學(xué)上來講，這種基于ELISA分析方法，靈敏度終究是有限。相對(duì)化學(xué)發(fā)光和時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)等更先進(jìn)分析方法，它靈敏度比較低。由此可見，提升敏感性、特異性、縮短窗口期和簡(jiǎn)便快速是HIV檢測(cè)試劑未來發(fā)展主要趨勢(shì)。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第50頁p24抗原檢測(cè)方法研究進(jìn)展伴隨檢測(cè)靈敏度不停提升，p24抗原檢測(cè)逐步從主要用于在窗口期輔助早期診療和深入縮短窗口期，發(fā)展到用于病毒載量測(cè)定。當(dāng)前，p24抗原在以下幾方面都有主要應(yīng)用：HIV1抗體不確定或窗口期輔助診療；HIV1抗體陽性母親所生嬰兒早期輔助判別診療；第4代HIV1抗原/抗體ELISA試劑檢測(cè)呈陽性反應(yīng)，但HIV1抗體確認(rèn)陰性者輔助診療；監(jiān)測(cè)病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。但現(xiàn)有監(jiān)測(cè)病程進(jìn)展和抗病毒治療效果均采取昂貴、操作復(fù)雜病毒RNA測(cè)定方法。我國(guó)HIV/AIDS患者絕大個(gè)別是在基層，極難在基層普及，對(duì)疾病治療和控制很不利。高靈敏度p24抗原檢測(cè)方法建立成為在發(fā)展中國(guó)家使用病毒載量測(cè)定方法一個(gè)選擇。艾滋病抗體檢測(cè)技術(shù)第51頁p24抗原檢測(cè)方法研究進(jìn)展年，來自HIV病毒發(fā)覺者之一美國(guó)