分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座

分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所

景懷琦分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第1頁(yè)細(xì)菌分子分型方法近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)在各個(gè)方面得到廣泛地應(yīng)用，這些技術(shù)滲透到流行病學(xué)之中，形成了一門新分支學(xué)科—分子流行病學(xué)。分子流行病學(xué)中主要一點(diǎn)是利用適當(dāng)分型方法對(duì)分離到病原進(jìn)行分析。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第2頁(yè)細(xì)菌分子分型方法一個(gè)方法是否能應(yīng)用于分子分型以及其分型效果怎樣大致能夠從以下幾個(gè)方面考慮：分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第3頁(yè)細(xì)菌分子分型方法1、分型力是指對(duì)所分析菌株能夠得到明確陽(yáng)性結(jié)果能力。2、重復(fù)性是指當(dāng)重復(fù)測(cè)試相同菌株時(shí)能夠得到相同結(jié)果。3、判別能力是指區(qū)分非相關(guān)菌株能力。理想分型方法應(yīng)該能識(shí)別每一無(wú)關(guān)分析菌株。4、結(jié)果易于解釋這是非常主要。5、快速、廉價(jià)、技術(shù)簡(jiǎn)單。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第4頁(yè)細(xì)菌分子分型方法腸道致病性分型技術(shù)大致以下：1、表現(xiàn)型分型方法?？股孛舾行允删w分型分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第5頁(yè)細(xì)菌分子分型方法2、基因分型技術(shù)，A質(zhì)粒圖譜分析B以PCR為基礎(chǔ)分型方法，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析法（RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）；C限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLPs）SouthernBlot分析。D脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法（PFGE）。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第6頁(yè)細(xì)菌分子分型方法1、抗生素敏感性試驗(yàn)抗生素敏感性測(cè)試是臨床微生物試驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用方法，手工和自動(dòng)方法都能夠做到，也能夠進(jìn)行嚴(yán)格地質(zhì)量控制。操作簡(jiǎn)單，相對(duì)經(jīng)濟(jì)。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第7頁(yè)細(xì)菌分子分型方法假如要進(jìn)行詳盡流行病學(xué)分析，抗生素敏感性試驗(yàn)資料用途就相對(duì)有限了。這不但是因?yàn)楸憩F(xiàn)型有變種存在，更是因?yàn)楫?dāng)代醫(yī)院中，存在中非常大抗生素選擇壓力。一個(gè)特定菌株，能夠經(jīng)過(guò)各種遺傳學(xué)機(jī)制，“突然”對(duì)某種抗生素表現(xiàn)出抗性。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第8頁(yè)細(xì)菌分子分型方法另首先，假如沒(méi)有特定選擇壓力，這些遺傳元件也能夠丟失（如R因子）。所以，不一樣菌株可能含有相同抗性圖譜，在患者不一樣時(shí)期分離到同一個(gè)細(xì)菌菌株，也可能會(huì)表現(xiàn)出不一樣抗生素敏感性圖譜。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第9頁(yè)細(xì)菌分子分型方法噬菌體分型分析噬菌體裂解細(xì)菌細(xì)胞含有一定特異性。一些噬菌體只能感染一個(gè)種或?qū)偌?xì)菌，一些噬菌體能夠裂解同一個(gè)細(xì)菌不一樣株。所以，能夠利用不一樣噬菌體裂解細(xì)菌細(xì)胞特異性，能夠分離、篩選一組噬菌體，用于傳染源追蹤和菌株分析。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第10頁(yè)細(xì)菌分子分型方法缺點(diǎn)是除了一些參比試驗(yàn)室外，極少試驗(yàn)室能擁有種類比較完全噬菌體，在應(yīng)用方面受到了很大限制。其次，噬菌體分型技術(shù)要求比較嚴(yán)格，需要經(jīng)驗(yàn)豐富工作人員。同時(shí)，噬菌體分型經(jīng)常會(huì)碰到多樣性結(jié)果，需要仔細(xì)推敲。還有，使用認(rèn)可噬菌體，許多菌株不能取得滿意結(jié)果，不得不考慮使用其它噬菌體，給結(jié)果分析帶來(lái)困難。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第11頁(yè)細(xì)菌分子分型方法英國(guó)把噬菌體分析和PFGE方法結(jié)合使用，對(duì)E.coliO157：H7大腸桿菌進(jìn)行分型。能夠把E.coliO157：H7大腸桿菌最少分為66個(gè)噬菌體型。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌亦可用噬菌體分型。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第12頁(yè)細(xì)菌分子分型方法基因分型技術(shù)質(zhì)粒圖譜方法最先應(yīng)用于流行病學(xué)研究以DNA為基礎(chǔ)技術(shù)就包含質(zhì)粒分析。分別提取分離菌株質(zhì)粒DNA，在瓊脂糖凝膠上電泳分離，測(cè)定質(zhì)粒數(shù)目及大小。該方法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，易于推廣。臨床分離E.coliO157：H7大多數(shù)菌株都含有質(zhì)粒，能夠應(yīng)用質(zhì)粒圖譜法來(lái)進(jìn)行分型。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第13頁(yè)細(xì)菌分子分型方法然而，細(xì)菌質(zhì)粒能夠自發(fā)丟失（如小腸結(jié)腸炎耶爾森菌質(zhì)粒自然丟失率在10%左右，且這種丟失是不可逆）、取得質(zhì)粒。還能夠在細(xì)菌之間進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，這就使得質(zhì)粒圖譜分析結(jié)果有時(shí)候難以解釋。另一個(gè)問(wèn)題是質(zhì)粒DNA構(gòu)型可能發(fā)生改變。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第14頁(yè)細(xì)菌分子分型方法另外，使用質(zhì)粒圖譜分析方法不能夠區(qū)分那些分子量相同而DNA序列不一樣質(zhì)粒，或分子量不一樣而有較高同源性質(zhì)粒。針對(duì)這一情況，人們把質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶消化，再用電泳分析限制性片段數(shù)目和大小，這么質(zhì)粒分析可重復(fù)性和分辨力都會(huì)得到很大提升。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第15頁(yè)細(xì)菌分子分型方法基于PCR分型系統(tǒng)隨機(jī)引物PCR（AP-PCR），也就是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（RAPD）。使用那些不針對(duì)任何已知遺傳位點(diǎn)短引物（通常8-10bp），能夠隨機(jī)地與染色體DNA結(jié)合，并有足夠親和力開(kāi)啟聚合酶反應(yīng)。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第16頁(yè)細(xì)菌分子分型方法然而，在實(shí)踐中，用AP-PCR取得可重復(fù)高分辨力結(jié)果還存在一定困難。第一，假如條帶強(qiáng)弱能夠證實(shí)菌株之間差異時(shí)，我們極難比較和解釋圖譜；第二，因?yàn)橐恍┊a(chǎn)物可能代表效率相對(duì)低反應(yīng)，技術(shù)原因微小改變就能夠造成不一樣擴(kuò)增反應(yīng)中一個(gè)特定菌株產(chǎn)生實(shí)際片段差異很大。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第17頁(yè)細(xì)菌分子分型方法另外一個(gè)影響RAPD可重復(fù)性原因或許是由質(zhì)粒編碼片段擴(kuò)增，質(zhì)粒是能夠丟失或取得，有文件報(bào)道質(zhì)粒影響很小。可重復(fù)性差是問(wèn)題，造成了分辨力降低，極大地妨礙了不一樣試驗(yàn)室之間結(jié)果比較。一些報(bào)道提出使用固定濃度純化DNA能夠提升可重復(fù)性，從而使此方法有了很好應(yīng)用，但操作起來(lái)很困難很煩瑣。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第18頁(yè)細(xì)菌分子分型方法擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（AFLP）技術(shù)。AFLP原理：用特異性酶將細(xì)菌染色體組消化之后，對(duì)其消化片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第19頁(yè)細(xì)菌分子分型方法此技術(shù)包含三個(gè)步驟：（1）將DNA酶切，并在酶切片段兩端連接上寡聚核苷酸接頭，（2）對(duì)一組限制性片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，（3）對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行凝膠分析。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第20頁(yè)細(xì)菌分子分型方法其引物是依據(jù)接頭和酶切位點(diǎn)序列來(lái)確定。因?yàn)槠湟镅由熘料拗菩云蝺?nèi)部，所以只有限制性位點(diǎn)兩側(cè)核苷酸序列與引物延伸端匹配片段才能被擴(kuò)增，這么就實(shí)現(xiàn)了選擇性擴(kuò)增。使用這種方法，在不知道核苷酸序列情況下，就能夠應(yīng)用PCR觀察到一組限制性片段。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第21頁(yè)細(xì)菌分子分型方法從理論上來(lái)講，AFLP能夠應(yīng)用于全部細(xì)菌且重復(fù)性和分辨力都好。有報(bào)道應(yīng)用于E.coliO157：H7分子分型。他們認(rèn)為，AFLP技術(shù)能夠作為E.coliO157：H7分子流行病學(xué)研究一個(gè)方法。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第22頁(yè)細(xì)菌分子分型方法核糖體分型（Ribotyping）Ribotyping指一個(gè)特殊SouthernBlot分析法。在此方法中，用與核糖體操縱單元相關(guān)RFLP來(lái)對(duì)菌株進(jìn)行分析。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第23頁(yè)細(xì)菌分子分型方法總來(lái)說(shuō)，核糖體分型方法穩(wěn)定、可重復(fù)。在普通情況下，起源于一個(gè)暴發(fā)菌株有相同核糖體型.。然而，流行病學(xué)上無(wú)相關(guān)性菌株經(jīng)常有相同圖譜，這就直接限制了該方法應(yīng)用.。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第24頁(yè)核糖體分型（Ribotyping）Ribotyping指一個(gè)特殊SouthernBlot分析法。在此方法中，用與核糖體操縱單元相關(guān)RFLP來(lái)對(duì)菌株進(jìn)行分析。在國(guó)際上已經(jīng)有完全自動(dòng)化儀器，如美國(guó)杜邦企業(yè)生產(chǎn)RiboPrinterMicrobialCharacterizationSystem，操作快速簡(jiǎn)便，完全排除了人為原因?qū)υ囼?yàn)結(jié)果影響，重復(fù)性好結(jié)果穩(wěn)定。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第25頁(yè)其操作過(guò)程可簡(jiǎn)述為：將純化細(xì)菌培養(yǎng)物用儀器自帶取樣棒蘸取并加入樣品緩沖液中，置于熱處理器上滅活，然后加入細(xì)胞裂解液使細(xì)菌DNA釋放。按照操作程序打開(kāi)儀器，將樣品和試劑放到固定位置，該儀器便可進(jìn)行以下自動(dòng)操作：酶切→電泳→轉(zhuǎn)膜，電泳和轉(zhuǎn)膜同時(shí)完成。轉(zhuǎn)好膜與結(jié)合了化學(xué)發(fā)光物質(zhì)探針結(jié)合（雜交），數(shù)碼攝影系統(tǒng)經(jīng)過(guò)捕捉化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，對(duì)所發(fā)出光進(jìn)行拍照，這么我們即可得到最終結(jié)果。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第26頁(yè)我們利用這一系統(tǒng)提供核糖體基因DNA指紋相同度值和判定結(jié)果，便可進(jìn)行分型。我們利用本系統(tǒng)對(duì)我國(guó)分離部分O：3，O：9小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行了分型，這種分型基本上和血清型相符合（見(jiàn)圖）。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第27頁(yè)分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第28頁(yè)細(xì)菌分子分型方法五、脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）這一方法在凝膠上外加正交交變脈沖電場(chǎng)。每當(dāng)電場(chǎng)方向改變后，大DNA分子便滯留在爬行管里，直至沿新電場(chǎng)軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動(dòng)。DNA分子越大，這種重排所需要時(shí)間就越長(zhǎng)。若DNA分子變換方向時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，DNA分子就能夠按其大小分開(kāi)。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第29頁(yè)細(xì)菌分子分型方法分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第30頁(yè)細(xì)菌分子分型方法

中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第31頁(yè)分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第32頁(yè)細(xì)菌分子分型方法盡管PFGE在許多病原體分子流行病學(xué)研究中表現(xiàn)出很好分辨能力，不過(guò)詳細(xì)到應(yīng)用它本身就存在著顯著缺點(diǎn)，此種方法耗時(shí)、耗力而且對(duì)設(shè)備要求也很嚴(yán)格。況且，當(dāng)PFGE圖形匹配得不是很好時(shí)候，其結(jié)果依然難以解釋。況且，也不能夠僅僅以PFGE結(jié)果為依據(jù)。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第33頁(yè)細(xì)菌分子分型方法盡管如此，PFGE分析技術(shù)在O157：H7大腸桿菌分子流行病學(xué)分析中得到了廣泛應(yīng)用，也是當(dāng)前最推崇方法。美國(guó)CDC已經(jīng)建立一個(gè)O157：H7PFGE圖譜網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)，為疾病監(jiān)測(cè)和調(diào)查提供有力依據(jù)和幫助。不過(guò)，當(dāng)前這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)使用還有著嚴(yán)格限制，并非全部科學(xué)家都能夠使用。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第34頁(yè)細(xì)菌分子分型方法在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，任何單一方法所得出結(jié)論都含有片面性，所以，聯(lián)合應(yīng)用幾個(gè)方法是當(dāng)前較為理想分子分型方法。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第35頁(yè)細(xì)菌分子分型方法這其中又以PFGE與其它方法相結(jié)合效果為最正確，先用分辨力較低方法進(jìn)行初篩，然后用分辨力較高方法進(jìn)行深入分型，這是當(dāng)前大多數(shù)試驗(yàn)室所采取策略。伴隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展和進(jìn)步，會(huì)有更加好方法問(wèn)世。分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第36頁(yè)細(xì)菌分子分型方法我國(guó)部分地域分離到E.coliO157:H7菌株P(guān)FGE圖譜分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第37頁(yè)E.coliO157：H7分子分型方法病人身上分離到無(wú)毒株E.coliO157：H7PFGE圖譜分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第38頁(yè)E.coliO157：H7分子分型方法病人身上分離到有毒株E.coliO157：H7PFGE圖譜分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第39頁(yè)E.coliO157：H7分子分型方法徐州地域E.coliO157:H7動(dòng)物糞便分離株P(guān)FGE圖譜分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第40頁(yè)ICDC,ChinaCDC分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第41頁(yè)基因芯片分子診療研究基因芯片技術(shù)是90年代興起一項(xiàng)前沿生物技術(shù),它能夠?qū)⑸飳W(xué)中許多不連續(xù)分析過(guò)程,移植到固相介質(zhì)芯片上,并使其連續(xù)化和微型化。因?yàn)樗鼨M跨生命信息、生物物理等眾多研究領(lǐng)域,包括生命科學(xué)、化學(xué)、微電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)等很多自然學(xué)科,故已成為當(dāng)今多學(xué)科交叉、綜合前沿研究熱點(diǎn)。1雜交模型建立現(xiàn)有病原體分子生物學(xué)檢測(cè)方法通常需36~48小時(shí)Real-timePCR可在1h內(nèi)得到結(jié)果，但有其不足基因芯片可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病原體許多參數(shù)選擇探針含有敏感、重復(fù)性好雜交信號(hào)2其它試驗(yàn)條件探索和優(yōu)化分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第42頁(yè)

基因芯片分子診療研究

基本技術(shù)路線點(diǎn)樣以及結(jié)果分析所用儀器設(shè)備1點(diǎn)樣儀SDDC-2arrayer（VIRTEK）- 0,6nlperspot(spacing=0,5mm)- 108to1013oligonucleotides/μl(~105to1010oligos/spot)2掃描儀ScanArray4000XL（GSILumonics）分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第43頁(yè)基因芯片分子診療研究探針和引物設(shè)計(jì)與合成

引物在目標(biāo)基因片段上位置

分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第44頁(yè)基因芯片診療開(kāi)發(fā)工作探針合成、修飾及固定20mers探針，5’-端氨基修飾靶DNA擴(kuò)增與熒光標(biāo)識(shí)

dUTP-Cy3PCR產(chǎn)物純化與測(cè)定分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第45頁(yè)基因芯片分子診療研究雜交及檢測(cè)20μl雜交混合液：6XSSPE，1%SBA，0.01%PVP，0.01%SDS，25%Formamide13mmHybri-wellchamber芯片清洗和干燥熒光掃描以及結(jié)果分析（ScanArray4000XL，QuantArraysoftware）分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用專家講座第46頁(yè)基因芯片分子診療研究其它試驗(yàn)條件探索和優(yōu)化

1

簡(jiǎn)易芯片制作功效化芯片比較昂貴（1~10$/片），Kumaretal(NucleicAcidsRes28:e71,)等人匯報(bào)了一個(gè)方法，能夠把普通顯微鏡用載玻片經(jīng)3-mercaptopropyl-trimethoxysilane活化后，與5‘-末端巰基(-SH)修飾寡核苷酸直接結(jié)合，將捕捉探針固定在載玻片上，此方法含有簡(jiǎn)單、快速、背景干擾小等優(yōu)點(diǎn)。

2化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)探索通常，基因芯片結(jié)果是經(jīng)過(guò)數(shù)字化激光掃描儀對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行讀取和分析，如Cy3,Cy5,Alexa594等。但熒光掃描儀價(jià)格昂貴而且我們?cè)囼?yàn)表明該技術(shù)在自動(dòng)化方面有欠缺，為了適應(yīng)臨床試驗(yàn)室以及結(jié)合微流體（