反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)

1反相液相色譜流動(dòng)相設(shè)計(jì)反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第1頁(yè)反相液相色譜法流動(dòng)相選擇

固定相對(duì)分離影響回顧慣用有機(jī)溶劑及其選擇性流動(dòng)相pH值影響流動(dòng)相和固定相優(yōu)化梯度洗脫程序柱溫影響應(yīng)用舉例其它關(guān)鍵細(xì)節(jié)概要反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第2頁(yè)色譜分離終極目標(biāo)：關(guān)鍵組分分離反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第3頁(yè)4反相液相色譜流動(dòng)相固定相:

鍵合相類型(C18vs苯基)

顆粒類型(核-殼vs整體硅膠)流動(dòng)相:

溶劑選擇(乙腈vs甲醇)

流動(dòng)相pH

溫度

梯度反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第4頁(yè)

固定相對(duì)分離影響回顧反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第5頁(yè)Kinetex核-殼技術(shù)2.6um色譜柱能夠提升3倍柱效（與5um全多孔比較）提升柱效改進(jìn)分離反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第6頁(yè)提升柱效改進(jìn)分離反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第7頁(yè)固定相選擇性對(duì)分離度影響回顧1疏水性立體互動(dòng)氫鍵給予

氫鍵接收陽離子選擇性鍵合相與樣品交互作用:反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第8頁(yè)9C18Polar-RP1+212C18Phenyl固定相選擇性對(duì)分離度影響回顧2反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第9頁(yè)LC試驗(yàn)室，一定要有一套互補(bǔ)性強(qiáng)色譜柱相關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)之系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第10頁(yè)各種不一樣基材色譜柱性能比較選擇正確固相載體

固定相選擇性對(duì)分離度影響回顧3反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第11頁(yè)Gemini?3uC18全多孔性載體

從分析到制備

Rs1&2=1.27背壓=264Bar塔板數(shù)=16700Onyx?C18整體技術(shù)載體

對(duì)生物樣品接收度高

Rs1&2=1.35背壓=86Bar塔板數(shù)

=13800Kinetex?C18核-殼技術(shù)載體提升分離度

Rs1&2=1.61背壓=340Bar塔板數(shù)=20300固定相選擇性對(duì)分離度影響回顧4反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第12頁(yè)

固定相選擇性對(duì)分離度影響回顧5推薦固定相選擇必備工具:1、反相色譜柱選擇終極指南畫報(bào)2、反相色譜柱選擇終極指南畫冊(cè)3、反相柱篩分工具反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第13頁(yè)14有機(jī)溶劑選擇

反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第14頁(yè)慣用有機(jī)溶劑流動(dòng)相選擇比固定相選擇更含有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗x擇沒有限制。然而，在實(shí)際方法開發(fā)中，我們都會(huì)大大縮小選項(xiàng)，集中精力在那些會(huì)帶給我們最大成功可能性條件上經(jīng)典反相溶劑:弱溶劑: 水/緩沖鹽強(qiáng)溶劑: 乙腈(64)

甲醇(34)

混合溶劑(1) THF(1)使用頻率反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第15頁(yè)選擇溶劑考慮原因一個(gè)溶劑強(qiáng)度取決于疏水性強(qiáng)弱。溶劑強(qiáng)度會(huì)決定洗脫下來一個(gè)給定化合物所需量。反相溶劑強(qiáng)度:

水： 0

甲醇 2.6

乙腈 3.1THF 4.4溶劑選擇需要考慮其它原因：甲醇-粘度較高，在小粒徑或長(zhǎng)柱提升流速時(shí)會(huì)受到限制乙腈-價(jià)格相對(duì)要高四氫呋喃-低波長(zhǎng)下有紫外吸收，粘度高

溶劑強(qiáng)度反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第16頁(yè)溶劑強(qiáng)度:乙腈Vs甲醇35%甲醇色譜柱: Gemini5μmC6-Phenyl,150x4.6mm流動(dòng)相: 20mM磷酸二氫鉀（pH2.5）%有機(jī)溶劑如圖所表示流速: 1.0mL/min檢測(cè)波長(zhǎng):220nm1.糖精2.對(duì)羥基苯甲酸3.山梨酸4.脫氫乙酸5.對(duì)羥基苯甲酸甲酯20%乙腈用乙腈時(shí)分析物更早洗脫下來（即使乙腈百分比更低）用乙腈洗脫時(shí)候，洗脫次序發(fā)生了改變反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第17頁(yè)溶劑選擇性給定溶劑洗脫強(qiáng)度由它疏水性決定（如，庚烷比己烷強(qiáng)，因?yàn)樗杷愿鼜?qiáng)）然而，溶劑選擇性，是由它極性性質(zhì)所決定（如，庚烷和己烷都含有相同溶劑選擇性）乙腈有偶極矩，不過在氫鍵作用下又是非常弱質(zhì)子接收體四氫呋喃在氫鍵作用下能接收質(zhì)子，但不能給予質(zhì)子甲醇在氫鍵作用下既是強(qiáng)質(zhì)子給予體又是質(zhì)子接收體反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第18頁(yè)用不一樣溶劑優(yōu)化4種類固醇分離

溶劑選擇性反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第19頁(yè)溶劑篩選(等度條件方法)1.從高百分比乙腈開始逐步降低，直到k‘在2-10之間

（假如可能）80%AcCNk’=025%AcCNk’~621%AcCNk’~1140%AcCNk’~0.8反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第20頁(yè)溶劑篩選(等度條件方法)2.用其它溶劑重復(fù)操作:反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第21頁(yè)苯基色譜柱溶劑選擇在任何反相方法中，選擇乙腈或甲醇會(huì)對(duì)最終方法選擇性有顯著影響。然而，當(dāng)用苯基固定相時(shí)候（如Lunaphenyl-Hexyl;SynergiPolar-RP），你會(huì)發(fā)覺甲醇含有更加好選擇性，因?yàn)樗沟帽交潭ㄏ鄍i-pi作用更為顯著。這很可能是因?yàn)橐译媲杌蟨i電子影響了分析物上pi電子和固定相苯環(huán)上pi電子之間作用，而甲醇不會(huì)有這么影響。乙腈上氰基會(huì)干擾固定相苯環(huán)與分析物分子之間pi-pi作用甲醇在氫鍵作用下既是強(qiáng)質(zhì)子給予體又是質(zhì)子接收體反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第22頁(yè)苯基色譜柱溶劑選擇色譜柱: Luna5mC18(2)150x4.6mm Luna5mPhenyl-Hexyl150x4.6mm流動(dòng)相: A:20mM磷酸二氫鉀pH2.5 B:27%乙腈或

50%甲醇流速: 1.0mL/min化合物: 北美黃蓮提取物

1.黃蓮堿

2.小檗堿反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第23頁(yè)苯基色譜柱溶劑選擇27:73乙腈

:20mM磷酸二氫鉀pH2.5LunaC18(2)LunaPhenyl-Hexyl反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第24頁(yè)苯基色譜柱溶劑選擇50:50甲醇

:20mM磷酸二氫鉀pH2.5LunaC18(2)LunaPhenyl-Hexyl反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第25頁(yè)26緩沖鹽和流動(dòng)相pH值作用反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第26頁(yè)反相色譜中緩沖鹽選擇對(duì)于HPLC方法開發(fā)來說，從數(shù)量眾多緩沖鹽中選擇出正確緩沖鹽，非常不輕易但事實(shí)不是這么,因?yàn)橹恍鑾讉€(gè)緩沖鹽就能處理大多數(shù)問題!!預(yù)計(jì)流動(dòng)相pH值時(shí)實(shí)際考慮：1.目標(biāo)物質(zhì)穩(wěn)定性2.固定相在低pH值條件下水解酸性強(qiáng)于TFA時(shí)，就會(huì)造成固定相流失降低保留，暴露硅醇基不一樣廠家/品牌填料穩(wěn)定極限不一樣3.高pH值條件下硅膠溶解普通硅膠基質(zhì)固定相穩(wěn)定至pH～8

保護(hù)性鍵合（如Luna）穩(wěn)定提升至pH～10

有機(jī)硅膠雜化（如Gemini）穩(wěn)定提升至pH～12反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第27頁(yè)反相色譜中緩沖鹽選擇反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第28頁(yè)反相色譜中緩沖鹽選擇低pH緩沖鹽

pKaRangeTFA<2<2.5磷酸2.11.1-3.1甲酸*3.82.8-4.82.54.57.08.510中性pH緩沖鹽

pKaRange磷酸鹽(pK2)7.26.2-8.2高pH緩沖鹽

pKaRange碳酸氫鹽pK210.39.3-11.3反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第29頁(yè)pH值對(duì)固定相影響OSiOSiOSiOHOHOHOOOSiSiSipH<3.5OSiOSiOSiOOHOOOOSiSiSipH>3.5任何硅膠基質(zhì)反相填料鍵合和端基封尾之后都會(huì)有一定硅醇基殘留。這些硅醇基在pH3.5以上都能夠去質(zhì)子化。去質(zhì)子化硅醇基能夠與堿性物質(zhì)形成離子交換作用，造成峰形拖尾硅醇基質(zhì)子化離子交換降低峰形拖尾降低硅醇基去質(zhì)子化離子交換作用增加增加了峰形拖尾反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第30頁(yè)pH值對(duì)分析物影響反相色譜最主要保留機(jī)理是疏水作用?；衔镫x子化會(huì)使得他們含有極性化合物行為，降低與固定相疏水作用，降低保留能力分子離子化狀態(tài)能夠由流動(dòng)性pH值決定。所以，流動(dòng)性pH值能影響含有離子化基團(tuán)分析物保留性能?疏水性增強(qiáng)?更強(qiáng)保留?疏水性減小?更弱保留?疏水性增強(qiáng)?更強(qiáng)保留?疏水性減小?更弱保留反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第31頁(yè)pH值對(duì)分析物影響反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第32頁(yè)pH值對(duì)分析物保留行為影響

H+堿化酸化水溶性流動(dòng)相烷烴類鍵合相反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第33頁(yè)pH值對(duì)分析物保留行為影響

H+堿化酸化水溶性流動(dòng)相烷烴類鍵合相H+反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第34頁(yè)pH值對(duì)分析物保留行為影響

BNABNAANB阿米替林(pKa9.4)=（B）堿性甲苯=(N)中性萘普生(pKa4.5)=（A）酸性反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第35頁(yè)pH值對(duì)分析物保留行為影響首選：pH＜pKa－2次選：pH＞pKa＋2反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第36頁(yè)pH值對(duì)分析物保留行為影響首選：pH＞

pKa＋

2次選：pH＜

pKa－

2反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第37頁(yè)化合物pKa預(yù)測(cè)反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第38頁(yè)緩沖鹽濃度普通采取20mM～50mM依據(jù)樣品濃度，提議為樣品濃度5倍依據(jù)色譜柱硅羥基活度，活度越大，需要濃度越大對(duì)堿性化合物，高濃度緩沖鹽能夠減弱反相色譜柱“陽離子選擇性”梯度洗脫和在線混合時(shí)注意高濃度緩沖鹽溶解性反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第39頁(yè)反相色譜柱陽離子選擇性在硅膠表面帶電硅醇基可與帶電堿性物質(zhì)產(chǎn)生離子吸引作用，可造成正面或負(fù)面影響。

反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第40頁(yè)腎上腺素

陽離子選擇性－改進(jìn)極性堿保留

LunaPFP(2)Luna?C18(2)反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第41頁(yè)

陽離子選擇性－堿性物質(zhì)峰形變差Kinetex?PFPKinetex

XB-C18美沙酮

美沙酮芬太尼

芬太尼

反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第42頁(yè)緩沖鹽濃度對(duì)陽離子選擇性影響Luna5uSCX100A250×4.6mm

乙腈：50mmol/l磷酸二氫鉀（PH3.0）（5：95）

反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第43頁(yè)緩沖鹽濃度對(duì)陽離子選擇性影響Luna5uSCX100A250×4.6mm

乙腈：100mmol/l磷酸二氫鉀（PH3.0）（5：95）

反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第44頁(yè)45流動(dòng)相和固定相優(yōu)化反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第45頁(yè)優(yōu)化流動(dòng)相選擇性溶劑篩選：乙腈，甲醇確定適合緩沖鹽有調(diào)整pH值來調(diào)整保留和選擇性選擇固定相色譜柱高效C18是否有pH值特殊限制？調(diào)整pH值來調(diào)整保留和選擇性選擇固定相色譜柱沒有用乙腈，甲醇在低pH值條件下篩選反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第46頁(yè)47優(yōu)化流動(dòng)相和固定相分析尼古丁及其代謝物尼古丁(pKa~8)可替寧新煙堿去甲煙堿羥基可替寧OH反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第47頁(yè)優(yōu)化流動(dòng)相和固定相KinetexC18是否有pH值特殊限制？沒有用乙腈在低pH值條件下篩選反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第48頁(yè)49尼古丁和降解產(chǎn)物：初始低pH值條件篩選流動(dòng)相：A0.1%甲酸水溶液

B0.1%甲酸乙腈溶液梯度：10分鐘內(nèi)B%從5%變?yōu)?5%流速：1.5ml/min檢測(cè)器：254nm化合物：尼古?。?.1%）.進(jìn)樣1ul尼古丁(pKa~8.5)+CH3反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第49頁(yè)優(yōu)化流動(dòng)相和固定相KinetexC18是否有pH值特殊限制？沒有用乙腈在低pH值條件下篩選調(diào)整pH值來調(diào)整保留和選擇性反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第50頁(yè)51流動(dòng)相：A10mM碳酸氫銨pH10.5B乙腈梯度：10分鐘內(nèi)B%由5%變?yōu)?5%流速：1.5ml/min檢測(cè)器：254nm化合物：尼古?。?.1%）進(jìn)樣量1ul尼古丁及其代謝物：高pH條件下篩選，增加保留反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第51頁(yè)優(yōu)化流動(dòng)相和固定相KinetexC18是否有pH值特殊限制？沒有用乙腈在低pH值條件下篩選調(diào)整pH值來調(diào)整保留和選擇性Kinetex在pH10.5條件下不穩(wěn)定有機(jī)硅膠雜化GeminiNX3umC18反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第52頁(yè)53尼古丁及其代謝物：最終方法用雜化顆粒色譜柱：流動(dòng)相：pH10.5A20mM碳酸氫銨B100%乙腈梯度時(shí)間B%0.00103.00783.10105.0010流速：0.5ml/min進(jìn)樣體積：10ul溫度：25℃反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第53頁(yè)54梯度分析反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第54頁(yè)55梯度分析梯度洗脫目標(biāo)在于在同一個(gè)色譜運(yùn)行下分離疏水差異很大，而且需要很長(zhǎng)時(shí)間才能在等度洗條件下脫完全樣品。梯度洗脫：峰形更尖銳，更加好定量改進(jìn)對(duì)最終洗脫下來小峰檢測(cè)適于運(yùn)行完樣品后對(duì)色譜柱清洗和再生適于探索分析條件色譜柱：流動(dòng)相：70:300.1%三氟乙酸水溶液:0.1%三氟乙酸乙腈流速：2.0ml/min組成：1.硫脲（標(biāo)識(shí)為t0）4.苯乙酮7.苯戊酮

2.咖啡因5.鄰苯二甲酸二甲酯

3.苯酚6.苯丁酮

反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第55頁(yè)56梯度分析18min色譜柱：Luna?3μmC18(2)50x4.6mm流速：2.0ml/min流動(dòng)相：A：0.1%TFA水B：0.1%TFA乙腈1+23456776543214minA:B(70:30)B%5%→100%in5min反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第56頁(yè)梯度斜率梯度斜率與等度洗脫中溶劑強(qiáng)度相同等度洗脫溶劑強(qiáng)度提升溶劑強(qiáng)度降低分析時(shí)間同時(shí)降低了分離度降低溶劑強(qiáng)度增加分離度同時(shí)也增加了分析時(shí)間溶劑強(qiáng)度有時(shí)會(huì)影響選擇性梯度斜率提升梯度斜率降低運(yùn)行時(shí)間不過同時(shí)降低了分離度減緩梯度斜率增加了分離度但同時(shí)也增加了分析時(shí)間梯度斜率有時(shí)也會(huì)影響選擇性梯度洗脫目標(biāo):優(yōu)化分離度同時(shí)縮短分析時(shí)間反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第57頁(yè)梯度分析示例：五種除草劑色譜柱：PhenomenexLunaC18

150x4.6mm反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第58頁(yè)梯度分析5種除草劑在等度洗脫模式下：反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第59頁(yè)梯度斜率對(duì)分離度影響梯度斜率：1%/分鐘乙腈20-80%，60分鐘12345反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第60頁(yè)梯度斜率對(duì)分離度影響梯度斜率：2%/分鐘乙腈20-80%，30分鐘反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第61頁(yè)梯度斜率對(duì)分離度影響梯度斜率：3%/分鐘乙腈20-80%，20min反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第62頁(yè)梯度斜率對(duì)分離度影響梯度斜率：4%/分鐘乙腈20-80%，15min分離度不夠!*增加梯度斜率將降低整體保留時(shí)間同時(shí)也降低了分離度反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第63頁(yè)起始有機(jī)相百分比對(duì)分離度影響優(yōu)化后方法=梯度斜率：3%/分鐘20-80%乙腈，20min乙腈30-90%，20min方法調(diào)整=梯度斜率：3%/min反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第64頁(yè)梯度斜率：3%/分鐘，起始強(qiáng)溶劑=30%30-90%乙腈，20min分離度變小!起始有機(jī)相百分比對(duì)分離度影響*提升起始強(qiáng)溶劑量，降降低整體保留和分離度反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第65頁(yè)梯度方法開發(fā)1.從探索梯度條件開始，判斷分析物洗脫時(shí)間：5-95%有機(jī)相，X分鐘（1分鐘/厘米柱長(zhǎng)）150×4.6mm=B%5-95%15分鐘2、依據(jù)最早洗脫下來組分，調(diào)整起始有機(jī)相百分比3%有機(jī)溶劑等度保持X分鐘3.調(diào)整梯度斜率優(yōu)化分離度或關(guān)鍵物質(zhì)減緩斜率，提升分離度（5-95%B，20分鐘）增加斜率，假如分離度足夠（5-95%B，12分鐘）反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第66頁(yè)梯度方法開發(fā)4、優(yōu)化截止有機(jī)相百分比作為結(jié)束梯度截止在65%B5.調(diào)整起始有機(jī)相百分比縮短運(yùn)行時(shí)間（假如沒有極性組成限制） 5-65%B，18分鐘 10-70%B，18分鐘 15-75%B，18分鐘反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第67頁(yè)梯度程序方法轉(zhuǎn)移時(shí)微調(diào)梯度洗脫–最小化滯后體積降低循環(huán)時(shí)間PumpAPumpBDetectorInjectorMixer反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第68頁(yè)69柱溫影響反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第69頁(yè)方法開發(fā)中柱溫應(yīng)用 HPLC方法開發(fā)中溫度應(yīng)用非常含有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗鼘?duì)選擇性影響不可預(yù)知升高溫度將會(huì)：1.降低流動(dòng)相粘度和背壓。這么話能夠用更加快流速，或者用更長(zhǎng)/粒徑更小規(guī)格色譜柱2.縮短洗脫時(shí)間3.提升方法重現(xiàn)性（與室溫下操作相比） 然而，不可能確定升高溫度是否有利于還是不利于樣品分離。對(duì)于一復(fù)雜分離來說，色譜結(jié)果中一份提升幾乎都會(huì)伴伴隨其它部分降低反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第70頁(yè)方法開發(fā)中溫度應(yīng)用℃反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第71頁(yè)方法開發(fā)中溫度應(yīng)用在我們方法開發(fā)工作中：1.初始方法會(huì)設(shè)在30℃色譜柱篩選流動(dòng)相選擇和優(yōu)化2.更高溫度應(yīng)用僅在： 需要降低柱壓 （通常伴伴隨提升流速或使用更長(zhǎng)柱子） 30度下不能到達(dá)理想分離度反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第72頁(yè)73方法開舉例1：梯度優(yōu)化和固定相篩選反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第73頁(yè)巴比妥酸鹽臨床檢測(cè) 巴比妥酸鹽是CNS鎮(zhèn)靜劑，用于降低麻醉，治療焦慮和失眠，但同時(shí)常被濫用 LC/MS分析這類化合物困難在于異戊巴比妥和戊巴比妥是異構(gòu)體，分子量相同，所以必須到達(dá)基線分離才行異戊巴比妥pKa=7.8戊巴比妥反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第74頁(yè)分離目標(biāo)：異戊巴比妥和戊巴比妥分離流動(dòng)相和固定相優(yōu)化堿性樣品信息：無pH值限制樣品潔凈溶劑?10cm乙腈，粘度低緩沖鹽?低pH值（甲酸）反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第75頁(yè)核-殼C18色譜柱：初始梯度分析條件1、快速，陡峭梯度斜率確定分析物大約情況10-90%B5min;16%/min減小梯度斜率保留不錯(cuò)峰形不錯(cuò)沒分開反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第76頁(yè)梯度斜率優(yōu)化：10-90%B5min;16%/min10-90%B10min;8%/min10-90%B40min;2%/min反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第77頁(yè)其它可選方法：核-殼苯基色譜柱2%/min核-殼C18色譜柱2%/min

用甲醇替換乙腈反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第78頁(yè)79其它關(guān)鍵細(xì)節(jié)反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第79頁(yè)強(qiáng)溶劑效應(yīng)防止強(qiáng)進(jìn)樣溶劑應(yīng)注意最小化管路長(zhǎng)度和內(nèi)徑優(yōu)化進(jìn)樣器和色譜柱間連接選擇死體積小保護(hù)柱w1/2tR強(qiáng)溶劑進(jìn)樣反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第80頁(yè)強(qiáng)溶劑效應(yīng)進(jìn)樣溶劑比流動(dòng)相弱能夠使樣品集中在柱頭從而取得更尖銳峰形w1/2tR弱溶劑弱溶劑進(jìn)樣反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第81頁(yè)強(qiáng)溶劑效應(yīng)實(shí)際案例進(jìn)樣10uL進(jìn)樣5uL方法源：ChP一部：刺五加中紫丁香苷測(cè)定反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第82頁(yè)檢測(cè)器采樣頻率影響分離效果和柱效20Hz1sec5Hz對(duì)于保留因子小于3峰，采樣頻率可能至關(guān)主要反相色譜流動(dòng)相的設(shè)計(jì)第83頁(yè)3.0s0.15s2.0s提議