細(xì)菌一般染色方法

細(xì)菌一般染色方法目的要求初步掌握細(xì)菌涂片制作，單染色法及革蘭染色法等染色技術(shù)。實驗內(nèi)容1．細(xì)菌染色一般程序涂片干燥固定初染(媒染)脫色復(fù)染(1)涂片臨床標(biāo)本或液體培養(yǎng)物可直接涂抹于潔凈的載玻片上，固體培養(yǎng)的細(xì)菌先在玻璃片上滴一滴生理鹽水，然后取菌少許在鹽水中磨勻，呈輕度混濁。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右為宜。(2)干燥涂片最好在室溫下自然干燥，或?qū)?biāo)本面向上，置于酒精燈火焰高處慢慢烘干，切不可在火焰上燒干。(3)固定細(xì)菌的固定常用火焰加熱法，即將上述已干的涂片在火焰中迅速通過3～5次，溫度以手能摸時熱而不燙為度。目的在于殺死細(xì)菌，凝固細(xì)胞質(zhì)，改變細(xì)菌對染料的通透性。(4)初染不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆蓋菌膜為度。(5)媒染通過媒染可增加染料和被染物質(zhì)的親和力。媒染劑還可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。(6)脫色此步驟主要目的是觀察細(xì)菌與染料間結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。(7)復(fù)染細(xì)菌初染色被脫色后常以復(fù)染液復(fù)染，便于觀察。復(fù)染液的顏色與初染液有明顯不同。2．常用染料原液配制一般制備100ml純酒精飽和溶液所需染料量：美蘭2g～5g；結(jié)晶紫7g～14g；堿性復(fù)紅3g～7g。3．常用的染色方法(1)單染色法即用一種染料染色的方法。常用呂氏美蘭或稀釋石炭酸復(fù)紅染液。1)染液①呂氏美蘭液美蘭酒精飽和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成。②稀釋石炭酸復(fù)紅液堿性復(fù)紅酒精飽和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸餾水作10倍稀釋即成。2)菌種大腸埃希菌普通斜面培養(yǎng)物。3)染色方法于已做好的涂片上滴加呂氏美蘭或稀釋石炭酸復(fù)紅染液，染色1min，以水沖洗至無顏色流下為止，自然干燥或以遠(yuǎn)火烘干后鏡檢。4)結(jié)果以美蘭染色者菌體呈現(xiàn)蘭色；以稀釋石炭酸復(fù)紅染色的菌體呈現(xiàn)紅色。(2)革蘭染色法1)原理細(xì)菌被結(jié)晶紫著色后，再經(jīng)媒染劑處理，染成深紫色或紫黑色。如被酒精脫去顏色，經(jīng)復(fù)紅復(fù)染成紅色，稱為革蘭陰性菌；如不被酒精脫色，則仍為紫黑色，稱為革蘭陽性菌。革蘭染色的原理尚未完全明了，主要有三種學(xué)說：①等電點學(xué)說革蘭陽性菌的等電點低(pH2～3)，革蘭陰性菌等電點較高(pH4～5)，一般染色液pH值為7.0左右，故電離后陽性菌所帶陰電荷比陰性菌多，因此，攝取帶陽電荷的染料（如結(jié)晶紫）多且不易脫色。②通透性學(xué)說革蘭陽性菌細(xì)胞壁的通透性比陰性菌小，脫色劑較易通過革蘭陰性菌的細(xì)胞壁，將染料溶解洗出，故易脫色；陽性菌的細(xì)胞壁通透性低，故不易脫色。③化學(xué)學(xué)說革蘭陽性菌細(xì)胞內(nèi)含有某種特殊化學(xué)成分，一般認(rèn)為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它能和染料-媒染劑互相結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易脫色；革蘭陰性菌體含核糖核酸鎂鹽復(fù)合物較少，易被脫色。2)染液①結(jié)晶紫染液取結(jié)晶紫飽和溶液20ml+1%草酸銨水溶液80ml混合過濾。②盧戈碘液取碘化鉀2ml以10ml蒸餾水充分溶解，然后加碘1g待完全溶解后加蒸餾水至300ml。③脫色劑95%乙醇。④稀釋石炭酸復(fù)紅同單染色法。3)菌種大腸埃希菌和葡萄球菌混合菌液。4)方法①初染將結(jié)晶紫染液2～3滴加于制好的涂片上，染色1min，水洗；②媒染加盧氏碘液2～3滴染色1min，水洗；③脫色95%乙醇脫色0.5min(無紫色脫落為止)，水洗；④復(fù)染加稀釋石炭酸復(fù)紅數(shù)滴，染色1min，水洗干后鏡檢。5)結(jié)果革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌染成紅色。6)注意事項①涂片不宜過厚，否則脫色受影響，使革蘭陰性菌染成革蘭陽性菌，造成錯誤鑒定。②為防止染液蒸發(fā)而改變濃度，碘液的顏色變淡應(yīng)棄去。③涂片積水過多會改變?nèi)疽簼舛?，影響染色效果，故每次水洗后?yīng)將玻片甩干。④注意細(xì)菌的菌齡，一般以18h～24h左右培養(yǎng)物效果最好，菌齡過長影響細(xì)菌染色性。(3)萋-納抗酸染色法(ziehl—neelsen)：主要用于結(jié)核桿菌和麻風(fēng)桿菌檢查。1)染液①石炭酸復(fù)紅染液取堿性復(fù)紅酒精飽和液10ml+5%石炭酸水溶液90ml混合。②脫色劑3%鹽酸酒精。③復(fù)染劑呂氏美蘭染液，同單染色法。2)菌種卡介苗和表皮葡萄球菌混合液。3)方法①初染在已固定的涂片上滴加石炭酸復(fù)紅染液，遠(yuǎn)火徐徐加熱至有蒸汽冒出，但切不可沸騰，并隨時添加染色液，染色3min～5min，冷卻后水洗。②脫色滴加3%鹽酸酒精脫色至無紅色流下為止，一般為2min。③復(fù)染水洗后用呂氏美蘭復(fù)染0.5min～1min，水洗干后鏡檢。4)結(jié)果抗酸菌染成紅色，非抗酸菌染成藍(lán)色。5)注意事項①加熱時火切勿過大，防止染液沸騰。②每張玻片只允許放一份標(biāo)本，以免陰陽結(jié)果混淆。③用過的玻片要徹底洗干凈，防止抗酸菌留在玻片上。④切勿使用染色缸，印干的濾紙只能一片一張，不得重復(fù)使用。⑤脫色時間寧長勿短，以免誤診。⑥為防止實驗室感染，標(biāo)本要高壓滅菌后再制片。(4)潘本漢抗酸染色法(panpenhein)主要用于尿及糞便中抗酸菌檢查。當(dāng)用萋-納抗酸染色檢出抗酸菌后，用該方法染色，結(jié)核分枝桿菌染成紅色，恥垢分枝桿菌染成藍(lán)色。1)染液①石炭酸復(fù)紅染液見萋-納抗酸染色法。②復(fù)染液取薔薇色酸1g先溶于100ml無水乙醇中，然后加美蘭2g(至飽和)，置室溫中4天，使其充分溶解，過濾后加甘油20ml混勻備用。2)標(biāo)本懷疑腎結(jié)核患者的尿液。3)方法①初染于制好的涂片上滴加石炭酸復(fù)紅染液數(shù)滴加溫染色2min。②復(fù)染傾去染液勿水洗，滴加復(fù)染液，邊滴邊傾去，重復(fù)4～5次后，水洗、待干、鏡檢。3)結(jié)果結(jié)核分枝桿菌染成紅色，恥垢分枝桿菌及其他細(xì)菌染成藍(lán)色。(5)鞭毛鍍銀染色法1)染液①甲液鞭酸5g，三氯化鐵5g，36%甲醛1ml，1%NaOH1ml，蒸餾水100ml。②乙液取AgNO32g溶于100ml蒸餾水中，臨用前用15%氨水滴定，出現(xiàn)棕色沉淀后繼續(xù)滴加氨水直至呈現(xiàn)乳白色薄霧狀為止。2)方法①將奇異變形桿菌在1.4%的軟瓊脂上傳兩代，形成遷徙生長現(xiàn)象。取潔凈玻片一張，于玻片上滴加蒸餾水一滴，然后取上述遷徙生長邊緣的細(xì)菌少許，輕輕點于蒸餾水中，使其自然擴(kuò)散、干燥，切勿火焰固定。②在制好的涂片上滴加甲液染3min～5min，用蒸餾水沖洗。③用乙液沖去殘水后，加乙液0.5min～1min，并在火焰上方稍加熱，用蒸餾水沖洗，干后鏡檢。3)結(jié)果菌體染成深褐色，鞭毛染成淺褐色。4)注意事項①細(xì)菌培養(yǎng)時傳代次數(shù)因菌種不同可適當(dāng)增加。②制涂片時菌量不宜過多，動作要輕，切勿研磨，以免鞭毛脫落。③加乙液后加熱溫度不要太高。(6)魏曦氏鞭毛染色法1)

染液飽和鉀明礬液2ml，5%石炭酸液5ml，20%鞣酸液2ml相混合。臨用時加堿性復(fù)紅酒精飽和液1ml，混合后過夜，次日過濾后使用。此染液以3日內(nèi)使用效果最好。2)

方法將奇異變形桿菌在1.4%的軟瓊脂上傳兩代，形成遷徙生長現(xiàn)象。取高度潔凈玻片一張，于玻片上滴加蒸餾水一滴，然后取上述遷徙生長邊緣的細(xì)菌少許，輕輕點于蒸餾水中，使其自然擴(kuò)散，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)讓其自干。無需火焰固定。滴加染液染0.5min～1min，水洗待干，鏡檢。3)

結(jié)果菌體與鞭毛均呈紅色。(7)芽胞染色法1)染液①石炭酸復(fù)紅染液見抗酸染色法。②脫色劑95%乙醇。③復(fù)染液呂氏美蘭染液，同單染色法。2)菌種炭疽芽胞桿菌普通斜面培養(yǎng)物。3)方法①初染于制好的涂片上滴加石炭酸復(fù)紅染液加熱染3min～5min，勿使染液沸騰。②脫色水洗后用95%乙醇脫色約1min，水洗。③復(fù)染加呂氏美蘭染液染1min，水洗干后鏡檢。4)結(jié)果芽胞染成紅色，菌體呈藍(lán)色。(8)黑斯(Hiss)莢膜染色法1)染液結(jié)晶紫染液：取結(jié)晶紫飽和液5ml加蒸餾水95ml混合；20%CuSO4水溶液。2)標(biāo)本提前數(shù)日小白鼠腹腔注射肺炎鏈球菌菌液0.2ml，小鼠死亡后解剖取腹腔液印片。3)方法①

將印片在空氣中自然干燥，無需加熱固定。②

滴加結(jié)晶紫染液在火焰上加熱，使有蒸汽冒出為止，勿水洗。③

以20%CuSO4溶液沖洗染液，勿水洗，干后鏡檢。4)結(jié)果菌體呈紫色，莢膜呈淡紫色。(9)阿爾伯特(Albert)異染顆粒染色法1)

染液①甲液甲苯胺蘭0.15g，孔雀綠0.2g，溶于95%酒精2ml中再加入蒸餾水至100ml及冰醋酸1ml，放置24h后過濾備用。②乙液將碘化鉀3g溶于蒸餾水10ml～20ml中，再加碘2g等溶解后加蒸餾水至300ml備用。2)菌種白喉棒狀桿菌呂氏雞蛋斜面培養(yǎng)物。3)方法已固定的涂片上加甲液染3min～5min，水洗后，再加乙液染色1min，水洗待干，鏡檢。4)結(jié)果菌體呈藍(lán)綠色，異染顆粒呈藍(lán)黑色。(10)剛果紅染色法(負(fù)染色法)：背景著色而菌體不著色的染色方法。1)染液2%剛果紅水溶液，1%鹽酸酒精溶液。2)方法于載玻片上滴加2%剛果紅溶液1滴與少量培養(yǎng)菌混合，涂成均勻厚片待干，以1%鹽酸酒精溶液沖洗，待干后鏡檢。3)結(jié)果背景呈藍(lán)色，菌體無色。(11)金胺“O”染色法1)

染液①

金胺“O”染液金胺“O”0.1g溶于10ml95%酒精中，另取3ml石炭酸加在87ml的蒸餾水中。將此二液混勻，雖混濁但不必過濾，裝入褐色瓶中，放室溫保存。②0.5%鹽酸酒精。③0.5%高錳酸鉀溶液。2)菌種懷疑結(jié)核的痰標(biāo)本。3)方法在已固定的涂片上加金胺“O”染液染15min，水洗后用0.5%鹽酸酒精脫色2min，水洗，再加0.5%高錳酸鉀液作用3min，水洗，待干，用熒光顯微鏡觀察。4)結(jié)果抗酸菌呈亮黃色熒光。（12）美蘭染色法美藍(lán)是常用的活體染色染料，當(dāng)它處于氧化狀態(tài)是呈現(xiàn)出藍(lán)色，而還原態(tài)時為無色。用它進(jìn)行活體染色時，由于活細(xì)胞代謝過程中的脫氫作用，美藍(lán)接受H后就由氧化轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)，故表現(xiàn)出無色；而衰老的細(xì)胞由于代謝緩慢或停止，不能使美藍(lán)還原，所以呈藍(lán)色或者淡藍(lán)色。（13）蘇木精-伊紅染色蘇木精-伊紅染色，又稱“蘇木素-伊紅染色”，或“H&E染色”（hematoxylinandeosinstain、HEstain），是組織學(xué)最常用的染色方法之一。這種染色方法的基礎(chǔ)是組織結(jié)構(gòu)對不同染料的結(jié)合程度不同。染料蘇木精可以將嗜堿性結(jié)構(gòu)染成藍(lán)紫色，而伊紅可以將嗜酸性結(jié)構(gòu)染成粉紅色。嗜堿性結(jié)構(gòu)通常包括含有核酸的部分，如核糖體、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中富含核糖核酸（RNA）的區(qū)域等。嗜酸性結(jié)構(gòu)則通常由細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，如路易體（Lewybody）、酒精小體（Mallorybody）、細(xì)胞質(zhì)的大部分等。有時，黃褐色也會出現(xiàn)在染色樣本中，這是由于組織內(nèi)原有的色素，例如黑色素等造成的。（14）吉姆薩染液吉姆薩染液（英語：Giemsastain）是一種用于染色體的染色方法。它是羅曼諾夫斯基染色法的改進(jìn)版本。以它的發(fā)明者，德國漢堡科學(xué)家古斯塔夫·吉姆沙命名。染色物質(zhì)Giemsa與DNA上的磷酸機(jī)團(tuán)結(jié)合，可以用于產(chǎn)生G顯帶并制作染色體組型圖。通過后者，可以觀察到染色體變異，如缺失，易位等。Giemsa在A-T豐富的區(qū)段結(jié)合率高，通過顯微鏡可以觀察到該區(qū)段呈暗帶。（15）免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)染色法是指在抗體上結(jié)合螢光或可呈色的化學(xué)物質(zhì)，利用免疫學(xué)原理中抗原和抗體間專一性的結(jié)合反應(yīng)，檢測細(xì)胞或組織中是否有目標(biāo)抗原的存在，此方式不只可以用來測知抗原的表現(xiàn)量也可觀察抗原所表現(xiàn)的位置。只要是能夠讓抗體結(jié)合的物質(zhì)，也就是具有抗原性的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖、病原體等都可偵測。免疫組織化學(xué)的優(yōu)勢在于專一性、靈敏度、簡便快速以及成本低廉，所以廣為醫(yī)院采用，通常是借由特定的腫瘤標(biāo)記來篩選癌癥。免疫組織化學(xué)染色法對基礎(chǔ)研究及預(yù)防和診療上都是相當(dāng)重要的一個方法。（16）劉氏染色法劉氏染色法（Liu'sstain），一種將動物細(xì)胞染色以便用光學(xué)顯微鏡觀察的方法。改良自瑞氏染色法（RomanowskyStain），1953年由臺灣大學(xué)劉禎輝教授所研究發(fā)表。簡介相較于其他染色法，劉氏染色法的優(yōu)點是非?？焖伲旧^程只須2~3分鐘。劉氏染色法在臨床上的應(yīng)用非常廣泛，主要用作血球染色形態(tài)分類，此外也可以當(dāng)作組織學(xué)的簡易染色，在臨床細(xì)菌學(xué)上的使用更可以作為陰道分泌物、痰液、膿等檢體的簡單染色劑(SimpleStain)。成份劉氏染色法所用的染液分成LiuA和LiuB兩部份。LiuA含有EosinY，可將細(xì)胞質(zhì)和血紅素等染成紅色；LiuB