基因工程材料

基因工程期末考材料題型：術(shù)語解釋、簡(jiǎn)答題、論述題、可能有選擇題或填空等。

試卷一一、術(shù)語解釋（30分，每題3分,作于答題紙）cDNA：cDNA是由mRNA通過反轉(zhuǎn)錄酶合成的雙鏈DNA。cccDNA:CCCDNA是游離于染色體之外的質(zhì)粒雙鏈閉合環(huán)形DNA?；蛭膸欤夯蛭膸熘改硞€(gè)生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外通過重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽性菌落或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合。生物芯片：生物芯片（Biochip）是指通過機(jī)器人自動(dòng)印跡或光引導(dǎo)化學(xué)合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于芯片表面，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）:能夠吸收DNA的細(xì)胞，稱作感受態(tài)細(xì)胞competentcell）。DNA探針：是帶有標(biāo)記的一段已知序列DNA，用以檢測(cè)未知序列、篩選目的基因等方面廣泛應(yīng)用。穿梭載體：穿梭載體是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。篩選標(biāo)記基因：篩選標(biāo)記主要用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當(dāng)一個(gè)外源DNA片段插入到一個(gè)質(zhì)粒載體上時(shí)，可通過該標(biāo)記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。藍(lán)-白斑篩選:含LacZ基因（編碼6半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物X-gal（5液-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷）產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源DNA插入后，LacZ基因不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來篩選重組細(xì)菌。稱之為藍(lán)白斑篩選?；虿僮鳎╣enemanipulation）:是指對(duì)基因進(jìn)行分離、分析、改造、檢測(cè)、表達(dá)、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱。二、簡(jiǎn)答題（55分，作于答題紙）何謂Klenow片斷？Klenow片斷在基因工程中有哪些用途？（8分）KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymeraseI經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去5'--3'外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影響。也稱為Klenow片段（Klenowfragment），或E.coliDNA聚合酶I大片段（E.coliDNApolymeraseIlargefragment）。它也可以通過基因工程得到，分子量為76kDa。KlenowDNA聚合酶的活性與E.coliDNA聚合酶I的活性是一致的。由于沒有5'--3'外切活性，使用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。補(bǔ)平3'凹端DNA。使用單純的DNA合成活性。注意要加足夠的dNTP；如果使用帶標(biāo)記的dNTP，則可對(duì)DNA進(jìn)行末端標(biāo)記。抹平DNA3'凸端。在3'--5'外切活性作用下，可切除突出的3'凸端。注意必須加足量dNTP，否則外切活性不會(huì)停止。但由于T4和T7DNA聚合酶具更強(qiáng)的3'--5'外切活性，現(xiàn)在已經(jīng)取代了KlenowDNA聚合酶的這一作用。通過置換反應(yīng)對(duì)DNA進(jìn)行末端標(biāo)記。但是該作用也已經(jīng)被T4或T7DNA聚合酶代替；它還可以在補(bǔ)平3'凹端的過程中進(jìn)行標(biāo)記。在cDNA克隆中合成第二鏈。隨機(jī)引物標(biāo)記。應(yīng)用于Sanger雙脫氧鏈末端終止法的DNA測(cè)序（已經(jīng)被T7DNA聚合酶取代）。應(yīng)用于PCR反應(yīng)，現(xiàn)在已經(jīng)被TaqDNA聚合酶等取代。在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA。2、什么是“星星活性”？請(qǐng)簡(jiǎn)述酶切時(shí)如何避免產(chǎn)生星星活性”現(xiàn)象。（8分）（staractivity）在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星號(hào)活性。引起星星活性的因素有廿油濃度高＞5%），酶過量（＞100U/1），離子強(qiáng)度低（＜25mM），pH值過高（＞8.0），或是加了有機(jī)溶劑如PMSD（二甲基亞砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、sulphalane等等，或是用其它二價(jià)陽離子如Mn++、Cu++、Co++或Zn++代替了Mg++。但不同的酶對(duì)上述條件的敏感性不一樣，如為口比EcoR!對(duì)高pH更敏感，但后者對(duì)廿油濃度更敏感。抑制星星活性的措施有許多，如減少酶的用量（可避免過份酶切）減少廿油濃度，保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶劑或乙醇，提高離子強(qiáng)度到100?150mM（如果不會(huì)抑制酶的活性的話），降低反應(yīng)pH至pH7.0，以及保證使用Mg++作為二價(jià)陽離子。PCR技術(shù)的工作原理是什么？用T—載體克隆PCR產(chǎn)物的原理是什么。（8分）經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆基因?它包括三個(gè)基本步驟：?（1）變性（Denature）:目的雙鏈DNA片段在94°C下解鏈；?（2）退火（Anneal）:兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度（50C左右）下與模板上的目的序列通過氫鍵配對(duì)；?（3）延伸（Extension）:在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成.?由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍TaqDNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，可在DNA片段的3'末端添加一個(gè)核苷酸，通常為A。因此，TaqDNA聚合酶擴(kuò)增的產(chǎn)物可與T-載體進(jìn)行粘端互補(bǔ)連接，達(dá)到高效克隆的目的°T-載體最初由Promega公司開發(fā)出商品，并一直沿用到現(xiàn)在，如和pGEM-TEasy（圖5-2）。這些載體特點(diǎn)是，將普通的克隆載體切成線狀，并使之在3'末端含有一個(gè)凸出堿基T。pGEM-T是在pGEM-5Zf（+）基礎(chǔ)上改造而來的，即在其多克隆位點(diǎn)中的EcoRV處將載體切成平末端的線狀DNA，再在其3'末端添加一個(gè)T堿基。在DNA的3'末端添加一個(gè)T堿基的方法有很多，如用末端轉(zhuǎn)移酶和底物ddTMP可以產(chǎn)生單個(gè)T的突出末端；有些識(shí)別不對(duì)稱序列的限制性內(nèi)切酶，如MboII、Xcm!和Hph!，在切割DNA后可直接產(chǎn)生一個(gè)3'突出的T；用TaqDNA聚合酶和高濃度的dTTP也可產(chǎn)生3'突出的T。請(qǐng)簡(jiǎn)述在進(jìn)行RNA操作時(shí)該如何避免mRNA降解。（8分）由于mRNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解，加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在，因而在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。所有的組織中均存在RNA酶，人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200C烘烤2小時(shí)以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC^溶液處理,再用蒸餾水沖凈oDEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑，它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物，因而使用時(shí)需小心。試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理，加入DEPC至0.1%濃度，然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌吟作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復(fù)合物、RNA酶抑制蛋白等。此外為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。請(qǐng)簡(jiǎn)述基因的結(jié)構(gòu)對(duì)基因操作的影響。（5分）（這一題下面答案寫的有點(diǎn)怪，大家自己參照課本第10、11頁)基因組序列：內(nèi)含子，外顯子mRNA/cDNA:G帽子polyA,UTR,ORF,請(qǐng)簡(jiǎn)述堿裂解法從大腸桿菌中提取質(zhì)粒的原理。(8分)質(zhì)粒(Plasmid是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸^(SDS)和TritonX-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或TritonX-100處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子并以溶解狀態(tài)存在于液相中。7.哪些分子生物學(xué)的工具酶可用于DNA片斷的末端標(biāo)記？(5分)Klenow片段DNA聚合酶IT4DNA聚合酶T7DNA聚合酶同多核苷酸激酶8.基因克隆的基本載體應(yīng)具備哪些元件？(5分)將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞(hostcell)的工具稱為載體，載體是基因操作的核心工具?；蚬こ虒?duì)載體的要求(1)在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制(2)有選擇性標(biāo)記(3)有一段多克隆位點(diǎn)外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制(4)分子量小，拷貝數(shù)多5)容易從宿主細(xì)胞中分離純化三、論述題(10分)典型的DNA重組實(shí)驗(yàn)通常包括哪些步驟？⑴目的基因的獲得：■①從細(xì)胞中提取DNA；■②利用限制酶制備具有粘性末端或平端的目的DNA片斷；■③用機(jī)械方法剪切，如用超聲波斷裂DNA;■④經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA,如胰島素基因；■⑤用PCR拉出目的基因；■⑥根據(jù)肽鏈順序用DNA合成儀人工合成目的基因.體外重組黏性末端連接，如E.ccRIGAATTC平端連接，如HpaIGTTAAC和機(jī)械方法剪切，用連接酶連接；同聚末端連接，用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(末端移酶)可在3、端合成低聚多核苷酸如pcly(T)和pcly(A),分別接在載體和目的基因上先形成氫鍵，再用連接酶連接.用人工接頭分子連接如人工合成的寡聚核苷酸接頭，限制酶識(shí)別位點(diǎn)等重組體導(dǎo)入宿主轉(zhuǎn)化(transformation):適合質(zhì)粒(plasmid)作載體；轉(zhuǎn)染(transfection):適合噬菌體作載體；轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):適合噬菌體作載體；脂質(zhì)體-介導(dǎo)(liposome-mediated)基因轉(zhuǎn)移；微注射(microinjection):適合真核細(xì)胞；電穿孔(electroporation)法:適合真核細(xì)胞；基因槍(biolistics,genegun):適合植物細(xì)胞；重組體克隆的篩選與鑒定篩選陽性菌落或噬菌斑利用載體的遺傳標(biāo)記如抗性；lac-Z顯色反應(yīng)遺傳互補(bǔ)DNA瓊脂糖電泳鑒定重組體菌落或噬菌斑原位分子雜交測(cè)序；b.免疫化學(xué)和其它產(chǎn)物分析方法外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離提純電泳過柱葡聚糖親和層析柱液相色譜五.綜合題(5分)認(rèn)真閱讀后，請(qǐng)回答(可用英文作答)在94°C下，DNA以何種形態(tài)存在？(1分)退火時(shí)，在什么情況下單鏈的引物和單鏈的模板之間的氫鍵才不能斷裂(2分)？72C延伸時(shí)，DNA聚合酶是以何方向閱讀模板鏈的？DNA聚合酶在引物的哪一端力口dNTP?(2分)ThecyclingreactionsofPCR(PolymeraseChainReaction)Denaturationat94C:Duringthedenaturation,thedoublestrandmeltsopentosinglestrandedDNA,allenzymaticreactionsstop(forexample:theextensionfromapreviouscycle).Annealingat54C:Theprimersarejigglingaround,causedbytheBrownianmotion.Hydrogenbondsareconstantlyformedandbrokenbetweenthesinglestrandedprimerandthesinglestrandedtemplate.Themorestablebondslastalittlebitlonger(primersthatfitexactly)andonthatlittlepieceofdoublestrandedDNA(templateandprimer),thepolymerasecanattachandstartscopyingthetemplate.Oncethereareafewbasesbuiltin,thehydrogenbondissostrongbetweenthetemplateandtheprimer,thatitdoesnotbreakanymore.extensionat72C:Thisistheidealworkingtemperatureforthepolymerase.Theprimers,wherethereareafewbasesbuiltin,haveastrongerattractiontothetemplate,createdbyhydrogenbonds,thantheforcesbreakingtheseattractions.Primersthatareonpositionswithnoexactmatch,getlooseagain(becauseofthehighertemperature)anddon'tgiveanextensionofthefragment.Thebases(complementarytothetemplate)arecoupledtotheprimeronthe3'side(thepolymeraseaddsdNTP'sfrom5'to3',readingthetemplatefrom3'to5'side,basesareaddedcomplementarytothetemplate)答：(1)在94C下，DNA以何種形態(tài)存在？(1分)thedoublestrandmeltsopentosinglestrandedDNA,(2)退火時(shí)，在什么情況下單鏈的引物和單鏈的模板之間的氫鍵才不能斷裂(2分)？Oncethereareafewbasesbuiltin,thehydrogenbondissostrongbetweenthetemplateandtheprimer,thatitdoesnotbreakanymore.(3)72°C延伸時(shí)，DNA聚合酶是以何方向閱讀模板鏈的？DNA聚合酶在引物的哪一端加dNTP?(2分)thepolymeraseaddsdNTP'sfrom5'to3',readingthetemplatefrom3'to5'side,basesareaddedcomplementarytothetemplat.試卷二一、寫出下列英文縮寫字母所代表的中文含義(15分，每題0.5分)PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳TAE含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸的電泳緩沖液EDTA二乙胺四乙酸TBETris-硼酸和EDTA的電泳緩沖液TPETris-磷酸和EDTAddNTP2',3'一雙脫氧核苷三磷酸cDNA互補(bǔ)DNAdsDNA雙鏈DNAEPO促紅細(xì)胞生成素HAS血清蛋白素TPA組織纖溶酶原激活劑RFDNA復(fù)制型DNAphagemid噬菌粒YAC酵母人工染色體BAC細(xì)菌人工染色體載體ampr氨芐青霉素抗性基因MSC多克隆位點(diǎn)BAP細(xì)菌的堿性磷酸酶CIP牛小腸堿性磷酸酶TdT末端轉(zhuǎn)移酶lacZ8-半乳糖苷酶基因AD轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域DBDDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域ori復(fù)制起點(diǎn)PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)BSA小牛血請(qǐng)白蛋白R(shí)NaseA核糖核酸酶ADNaseI脫氧核糖核酸酶IESC胚胎干細(xì)胞GST谷胱廿肽一S一轉(zhuǎn)移酶二、術(shù)語解釋20分轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指染色體基因組中整合有外源基因并能遺傳給后代的一類動(dòng)物?；蛭膸欤褐改硞€(gè)生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外通過重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽性菌落(或噬菌體)所有菌落或噬菌體的集合。穿梭載體(Shuttlevector):是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。生物芯片(Biochip):是指通過機(jī)器人自動(dòng)印跡或光引導(dǎo)化學(xué)合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于芯片表面，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。隨機(jī)引物：能與任何DNA模板的多個(gè)位點(diǎn)配對(duì)互補(bǔ)的多個(gè)不均一序列寡聚核苷酸DNA片斷叫隨機(jī)引物。探針：用作檢測(cè)的核酸片段即為探針（probe）。探針必須經(jīng)過標(biāo)記，以便示蹤和檢測(cè)。同尾酶：許多不同的限制酶切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的，且是對(duì)稱的，即它們可產(chǎn)生相同的粘性突出末端。這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。粘性末端：識(shí)別位點(diǎn)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend），這樣形成的兩個(gè)末端是相同的，也是互補(bǔ)的?；蚬こ蹋╣eneticengineering）:就是在分子水平上，在體外對(duì)不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進(jìn)行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細(xì)菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA），然后轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，使外源DNA（基因）在收體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，按照人們的需要生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或者定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并能穩(wěn)定的遺傳給下代。星號(hào)活性（staractivity）:在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星號(hào)活性。三、簡(jiǎn)答題（40分）簡(jiǎn)述瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定和純化DNA片段的原理以及影響DNA片段遷移速率的因素。?DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極一正極移動(dòng)。分子篩效應(yīng)。?瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定?1、DNA的分子大小：?線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。?2、瓊脂糖濃度?一個(gè)給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同°DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。?3、DNA分子的構(gòu)象?當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí)它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān)還和它本身構(gòu)象有關(guān)。?4、電源電壓?在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)片段越大，因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大所加電壓不得超過5v/cm。?5、嵌入染料的存在。熒光染料漠化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng)，還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15%。?6、離子強(qiáng)度影響?電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10X電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。2、簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的原理和基本步驟。（6分）

經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆基因?它包括三個(gè)基本步驟：?(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94°C下解鏈;?(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50C左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對(duì)；?(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成.?由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍什么叫PCR擴(kuò)增引物？簡(jiǎn)述PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)需要遵循的原則。?引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：(1)引物長(zhǎng)度約為16-30bp,太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。太長(zhǎng)則比較浪費(fèi)且難以合成。?(2)引物中G+C含量盡量控制在40%至60%之間，4種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻。盡量避免嘌吟或嘧啶的連續(xù)排列，以及T在3‘末端的重復(fù)排列。(3)四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，引物的3‘末端最好是G或C，但在3’端不存在連續(xù)3個(gè)G或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。?(4)引物的解鏈溫度：兩個(gè)引物之間的Tm值差異最好在2-5C。?(5)避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補(bǔ)序列(3個(gè)堿基)，從而減少引物二聚體的形成以及引物內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。((6)引物5‘端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等通常應(yīng)在5’端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。((7)引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在RNA操作中，如何控制潛在的RNA酶活性。(8分)1、干烤耐熱器皿2、DEPC處理溶液3、低溫操作典型的真核轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4、等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可識(shí)別DNA上的特異序列并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游?轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。4、54、5.避免RNAase污染簡(jiǎn)述酵母雙雜交技術(shù)的基本原理。(二個(gè)結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開，仍具有各自的功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄。只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。即不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。(根據(jù)這個(gè)特性，構(gòu)建二類載體：(1、將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)(Baitprotein)的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Baitprotein。(2、將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上。(同時(shí)將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長(zhǎng)。(當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。(將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對(duì)載體中插入的文庫基因進(jìn)行測(cè)序和分析工作。四、論述題（20分）1.請(qǐng)闡述一個(gè)好的表達(dá)載體需要具備哪些條件？各元件有何作用？（15分）?通過基本克隆載體上加上合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列即可使它變?yōu)楸磉_(dá)載體。?（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制，具有自主復(fù)制的序列?（2）有選擇性標(biāo)記編碼序列：（3）有一段多克隆位點(diǎn)外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制?（4）強(qiáng)啟動(dòng)子，經(jīng)常是可誘導(dǎo)的，如lac或trp操縱子的啟動(dòng)子或T7后期啟動(dòng)子（T7RNA聚合酶基因從可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子表達(dá)）（5）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止子2、比較在細(xì)菌、真核生物和動(dòng)物個(gè)體中表達(dá)外源基因的優(yōu)缺點(diǎn)。大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)?全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架?基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善?繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定?被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)?缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能?缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)?內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白蛋白?細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)?酵母菌是最簡(jiǎn)單的真核模式生物全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便?能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中?具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)?大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉低廉?不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系KGenerallyRecognizedAsSafeGRAS）缺點(diǎn)：缺乏強(qiáng)啟動(dòng)子、分泌效率差、表達(dá)質(zhì)粒不穩(wěn)定，但是酵母細(xì)胞不內(nèi)能提供哺乳動(dòng)物蛋白功能所需的翻譯后加工生物反應(yīng)器a、產(chǎn)量高、成本低、周期短，效率高；b、乳腺表達(dá)、不影響動(dòng)物整體；c、能彌補(bǔ)其它表達(dá)系統(tǒng)的不足，對(duì)蛋白可進(jìn)行翻譯后修飾加工。d、從乳汁中純化蛋白技術(shù)簡(jiǎn)單，不污染環(huán)境。e、改變?nèi)橹煞荩鳛楸＝∈称?。缺點(diǎn)：技術(shù)不成熟，研發(fā)費(fèi)用高。閱讀題（5分）（這一題沒題目，有考出來知道答案就行了。）Nodescendedfromthefertilizedegghavebeenproducedbymitosis.試卷三1、簡(jiǎn)述基因工程對(duì)載體的要求。（15）?①分子較小，可攜帶比較大的DNA片段。?②能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。?③要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)multiplecloningsites，MCS）。?④有適合的標(biāo)記，易于選擇。?⑤有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。?⑥從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。2、什么叫a-互補(bǔ)？簡(jiǎn)述基因工程中蘭白斑法篩選重組子的原理。（20）a-互補(bǔ)是指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的P-半乳糖苷酶（|3-galactosidase，由1024個(gè)氨基酸組成）陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。lacZ基因是乳糖lac操縱子中編碼p-半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其表達(dá)。?乳糖既是lac操縱子的誘導(dǎo)物，也是作用的底物。?異丙基-P-D-硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作為lac操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反應(yīng)的底物；5-漠-4-氯-3-吲哚-P-D-半乳糖苷（X-gal）可作為lac操縱子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物X-gal還可充作生色劑，被P-半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。?當(dāng)外源DNA插入后，LacZ基因不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來篩選重組細(xì)菌。稱之為藍(lán)-白斑篩選。3、載體、質(zhì)粒、cos位點(diǎn)、限制性核酸內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶的概念。（30）?載體是指基因工程中用來轉(zhuǎn)移外源DNA的一類DNA分子。?質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中擬核以外的脫氧核糖核酸（DNA）分子。cos位點(diǎn)（cohensive-endsite）:當(dāng)入DNA進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，便迅速通過黏性末端配對(duì)形成雙鏈環(huán)狀的DNA分子，這種黏性末端結(jié)合形成雙鏈的區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。?簡(jiǎn)稱限制性核酸酶。這是一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵