演示文稿核酸擴增技術(shù)

演示文稿核酸擴增技術(shù)目前一頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點核酸擴增技術(shù)課件目前二頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點大綱要求：掌握PCR的原理和反應過程掌握PCR反應體系掌握PCR產(chǎn)物的檢測熟悉實時熒光定量PCR的原理和方法了解以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)Special目前三頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點二、教學內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈式反應第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測第X節(jié)實時熒光定量PCR現(xiàn)在位置P169目前四頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點基礎(chǔ)知識遺傳中心法則現(xiàn)在位置P169目前五頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點+基礎(chǔ)知識目前六頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點基礎(chǔ)知識目前七頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點DNA加熱變性DNA冷卻復性一、核酸分子雜交的基本原理基礎(chǔ)知識目前八頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點DNA變性(denaturation)

定義：在某些理化因素作用下，DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵斷裂，使規(guī)則有序的雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則無序的單鏈線團樣結(jié)構(gòu)的過程?；A(chǔ)知識目前九頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點基礎(chǔ)知識目前十頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點融解溫度（Tm）定義：

在DNA熱變性時，其A260的升高達最大值一半時的溫度?；A(chǔ)知識meltingtemperature，目前十一頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點

DNA復性定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復性或雜交。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，此過程稱為退火(annealing)?；A(chǔ)知識目前十二頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點基礎(chǔ)知識目前十三頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點基礎(chǔ)知識dNTPdATPdCTPdGTPdTTPdNTP目前十四頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點 PCR概念：在體外特異地復制一段已知序列的DNA片段的過程。第一節(jié)聚合酶鏈式反應現(xiàn)在位置P169目前十五頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點一、PCR的原理和反應過程PCR反應重復進行DNA復制的過程，使DNA得以擴增，每一次復制包括3個步驟：變性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）現(xiàn)在位置P125目前十六頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點變性（denaturation）

將待復制的雙鏈DNA經(jīng)加熱至94℃～95℃）左右一定時間后，DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，使之成為單鏈分子，作為反應的模板（template)，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備；

現(xiàn)在位置P170目前十七頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點退火（annealing）

溫度降低至寡核苷酸（oligonucleotide）引物的融點溫度以下（40～70℃），使引物能與模板互補結(jié)合，形成雜交鏈；現(xiàn)在位置P125目前十八頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點延伸（extension）

將溫度升至72℃左右，使反應體系中的DNA聚合酶按照模板鏈的序列以互補的方式依次把dNTP加至引物的3’端，使雜交雙鏈不斷延伸，以至形成新的DNA雙鏈。

現(xiàn)在位置P125目前十九頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點PCR的基本反應過程變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C現(xiàn)在位置P170（40-70?C）目前二十頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點PCR的擴增效率現(xiàn)在位置P170循環(huán)次數(shù)：0

1

2

3

…n產(chǎn)物數(shù)量：2222…20123n每一次循環(huán)后，一分子模板被擴增為兩個分子每個循環(huán)所產(chǎn)生的DNA片段，即為下一個循環(huán)的模板PCR產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長目前二十一頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在位置P170目前二十二頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPs

緩沖液二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在位置P170目前二十三頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點模板(template)

模板就是將要被復制的核酸片段，包括基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA和線粒體DNA等。在用RNA作為模板時，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA作為PCR反應的模板進行擴增反應。現(xiàn)在位置P125目前二十四頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點耐熱DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）是從一種生活在熱泉（80～90℃）中的水棲噬熱菌（Thermusaquaticus）中提取的，有很高的耐熱穩(wěn)定性。TaqDNA聚合酶的作用是催化DNA合成，即在模板指導下，以dNTP為原料，在引物的3’-OH端,加上dNTP,在二者間生成3’，5’-磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿5’→3’方向延伸?，F(xiàn)在位置P170目前二十五頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點dNTPs即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種脫氧核苷三磷酸的混合物。反應體系中4種核苷酸的濃度必須一致四種核苷酸間濃度的不平衡會增加反應時DNA聚合酶錯配的機率。濃度過高會加快反應速度，但導致非特異性擴增降低在dNTP濃度會提高反應的特異性一般為20~200umol/L現(xiàn)在位置P170目前二十六頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點鎂離子濃度

鎂離子濃度在擴增反應中是一個至關(guān)重要的因素，因為鎂離子對于反應系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高TaqDNA聚合酶的活性有直接的影響。Mg2+濃度過低使酶活力降低Mg2+濃度過高又會使酶催化非特異性擴增。一般為1.5mmol/L現(xiàn)在位置P172目前二十七頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點

引物(Primer)

引物是化學合成的已知序列的寡核苷酸(oligonucleotide)分子。引物決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度。

現(xiàn)在位置P170目前二十八頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點引物設(shè)計時必須遵循的原則（6條）用于PCR反應的引物需要二條，分別設(shè)在被擴增目標片段的二端，并分別與模板正負鏈序列互補。引物的長度一般以18～25個核苷酸為宜引物過長容易產(chǎn)生寡核苷酸的鏈內(nèi)互補，形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，引物過短則會降低擴增的特異性；現(xiàn)在位置P171目前二十九頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點引物設(shè)計時必須遵循的原則二條引物之間（尤其在3’端）的序列不可有互補，以免形成引物二聚體；引物的堿基組成應平衡，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積。C＋G的比例一般為45~55%。現(xiàn)在位置P171目前三十頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點PCR擴增中的退火溫度是根據(jù)引物的Tm值而決定的，二條引物的Tm值不能差別太大。根據(jù)需要，合成引物時在其5’端可以加修飾成分 如加入酶切位點，用生物素、熒光素、地高辛等標記，引入突變位點，引入啟動子序列，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列等?，F(xiàn)在位置P171引物設(shè)計時必須遵循的原則目前三十一頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點三、反應條件1、溫度①變性溫度：一般把變性溫度定在95～97℃之間，以使模板DNA和產(chǎn)物雙鏈完全打開。②退火溫度：退火溫度決定PCR反應的特異性，退火溫度的設(shè)定取決于引物的Tm，通常PCR的退火溫度應低于引物Tm

5℃左右。③延伸溫度：一般為72℃，在這個溫度下TaqDNA聚合酶具有較高的酶促活性，有利于DNA的復制?，F(xiàn)在位置P172目前三十二頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點2、時間

PCR循環(huán)中每個步驟所需的時間取決于所擴增片段的長度。以長度為200～1000bp的擴增片段為例，循環(huán)中變性、退火和延伸三個步驟的持續(xù)時間一般均為30秒～1分鐘。在模板（尤其是基因組DNA）進行第1次變性時應給予足夠長的時間（5～7分鐘，根據(jù)變性溫度高低而異）以使模板徹底變性，然后再進入循環(huán)。時間過長會降低擴增的特異性?，F(xiàn)在位置P173目前三十三頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點3、循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)一般為20～45次。PCR擴增效率呈S型曲線，有平臺效應平臺效應的原因：初始模板量引物二聚體和反應產(chǎn)物抑制擴增反應體系的組份被消耗引物與模板DNA間競爭

現(xiàn)在位置173目前三十四頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制硬件方面實驗室規(guī)范化設(shè)置軟件方面樣本采集核酸提取擴增產(chǎn)物分析測定結(jié)果的報送現(xiàn)在位置P173目前三十五頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（一）實驗室的規(guī)范化設(shè)置

臨床基因擴增檢驗實驗室必須包括四個工作區(qū)域：①試劑貯存和準備區(qū)；②標本制備區(qū)；③擴增反應區(qū)；④產(chǎn)物分析區(qū)。這四個區(qū)域必須互相獨立，并嚴格按照上述順序設(shè)置。每一區(qū)域都必須配置專用儀器，所用物品、試劑和耗材不得從某一個區(qū)域移至另一個區(qū)域使用?，F(xiàn)在位置P174目前三十六頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證PCR技術(shù)用于臨床檢驗的質(zhì)量保證主要涉及基因擴增檢驗全過程的質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價?，F(xiàn)在位置P129目前三十七頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證樣本采集核酸提取擴增產(chǎn)物分析測定結(jié)果的報送現(xiàn)在位置P129目前三十八頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（一）目的基因的克隆（二）基因的體外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析四、PCR的主要用途現(xiàn)在位置P目前三十九頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)目前四十頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）巢式（三）定量PCR技術(shù)（＊＊＊＊＊）（四）多重PCR技術(shù)（五）PCR誘導定點突變（六）原位PCR技術(shù)（七）差異顯示PCR技術(shù)（X）免疫PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P174以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)目前四十一頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（一）、逆轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）是以細胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進行體外擴增的技術(shù)。由于耐熱的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作為模板，因此首先必須將總RNA或mRNA作逆轉(zhuǎn)錄，以生成與之互補的cDNA，然后再以cDNA作為模板進行PCR擴增，得到所需的目的基因片段。RT-PCR主要用于克隆cDNA、合成cDNA探針、檢測RNA病毒和分析基因表達等?，F(xiàn)在位置174目前四十二頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（二）、巢式PCR巢式PCR（nestedPCR）是對靶基因進行二次擴增。二次擴增所用的引物不能相同，第二次擴增所用的引物必須位于第一次擴增所用引物的內(nèi)側(cè)先用第一對引物擴增出一個較大的片段，再用第二對引物進行第二次擴增第二次擴增的模板是第一次擴增的產(chǎn)物現(xiàn)在位置174目前四十三頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（二）、巢式PCR現(xiàn)在位置174引物1引物2nest要擴增的目標基因目前四十四頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（三）、定量PCR相對定量PCR定量PCR（實時熒光PCR）現(xiàn)在位置175目前四十五頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（四）多重PCR技術(shù)

多重PCR（multiplexPCR）即在同一反應體系中加入多對引物，以同時擴增一份DNA樣品中多個不同序列的靶片段。現(xiàn)在位置P179目前四十六頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（四）多重PCR技術(shù)多重PCR必須滿足的兩個條件：PCR反應條件適合所有被擴增的DNA片段同一反應內(nèi)各擴增片段的大小應不同，以便檢測時能通過電泳將各片段充分分離現(xiàn)在位置P179目前四十七頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（四）多重PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P179目前四十八頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（四）多重PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P179目前四十九頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（五）PCR誘導定點突變DNA重組技術(shù)使我們能夠首先用各種方法對克隆的DNA片段進行突變，在對產(chǎn)生的突變作DNA序列分析以后，再對突變體的特殊功能作進一步研究?，F(xiàn)在位置P180目前五十頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（六）原位PCR技術(shù)（insituPCR）

組織固定處理細胞內(nèi)的DNA或RNA，并以其作為靶序列進行PCR反應的過程稱為原位PCR。原位PCR與普通PCR的主要區(qū)別在于模板的制備。經(jīng)脫蠟處理的組織切片或滴加在載玻片上的細胞懸液都可作為擴增樣品，所有步驟均在載玻片上進行。現(xiàn)在位置P134目前五十一頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（六）原位PCR技術(shù)（insituPCR）

進行PCR時，加入地高辛標記的的dUTP，使擴增產(chǎn)物帶有地高辛。PCR結(jié)束，加入酶標抗地高辛抗體，再加入底物顯色。

現(xiàn)在位置P134目前五十二頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（六）原位雜交PCR

原位雜交PCR與原位PCR的唯一區(qū)別：擴增結(jié)束后，用寡核苷酸探針與擴增產(chǎn)物作原位雜交?，F(xiàn)在位置P134目前五十三頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（七）差異顯示PCR

（defferentialdisplayPCR,DD-PCR）現(xiàn)在位置P182一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達差異的技術(shù)。DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學研究，是目前篩選基因表達差異最有效的方法。目前五十四頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點目前五十五頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）結(jié)合PCR技術(shù)和抗原抗體反應用于檢測抗原（蛋白質(zhì)）固相載體上包被有抗體1抗體2上標記有DNA，作為PCR的模板現(xiàn)在位置P134目前五十六頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）第一步：載體－抗體1->抗原<-抗體2－DNA（C－DNA）第二步：C－DNA->PCR現(xiàn)在位置P134目前五十七頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點目前五十八頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）IPCR的靈敏度是ELISA的100-10000倍現(xiàn)在位置P134目前五十九頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測DetectionofthePCRproduct目前六十頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測PCR完成以后，必須對擴增產(chǎn)物進行檢測有效性和正確性：通過對PCR產(chǎn)物進行電泳分離，觀察擴增條帶的有無、擴增片段的大小等判斷PCR反應的有效性和正確性。PCR產(chǎn)物定量：（專門章節(jié)講）序列是否正確：測序現(xiàn)在位置P185目前六十一頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點一、PCR—限制性片段長度多態(tài)性是根據(jù)突變序列是否位于限制性內(nèi)切酶的酶切位點內(nèi)而設(shè)計的對PCR產(chǎn)物作限制性片段長度多態(tài)性分析的技術(shù)。若點突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點內(nèi)，可在突變點二側(cè)設(shè)計引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列。一種檢測點突變的技術(shù)，應用十分廣泛?，F(xiàn)在位置P185目前六十二頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點基因組中某個基因在同種生物的不同個體中，同時和經(jīng)常存在的兩種或兩種以上的變異型，以至于用某種限制性核酸內(nèi)切酶消化基因組的某段序列時，會呈現(xiàn)不同長度的消化片段，形成生物群體的多態(tài)性，這種多態(tài)性稱為限制性核酸內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)目前六十三頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點EcoRI5’-GAATTC-3’5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’P1P2目前六十四頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’5’-NNNNGAATTCNNN-3’5’-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3’EcoRI5’-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3’EcoRI+_+_目前六十五頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點RFLP的優(yōu)缺點RFLP用于檢測點突變可以確定點突變的位置目前六十六頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點二、等位基因特異性寡核苷酸Allelespecificoligonucleotide,ASO是用寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物進行雜交以檢測點突變的方法。被檢基因片段經(jīng)PCR擴增并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與經(jīng)標記的含有正常序列和突變序列的寡核苷酸探針雜交。PCR產(chǎn)物僅與完全互補的探針雜交現(xiàn)在位置P185目前六十七頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點野生型基因DNA突變型基因DNA野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針目前六十八頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針結(jié)論：不存在點突變目前六十九頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針結(jié)論：存在點突變目前七十頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離膜上固定DNA片段在緩沖液中將標記的探針加到膜上DNA片段從瓊脂糖凝膠上轉(zhuǎn)印到膜上雜交信號的檢測目前七十一頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點ASO的優(yōu)缺點用于檢測點突變由于探針的序列是已知的，可以確定點突變的位置缺點是成本相對較高，檢測一個點突變即需要一對引物和一對寡核苷酸探針現(xiàn)在位置P185目前七十二頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）當DNA分子以單鏈存在時，能在空間內(nèi)自發(fā)地形成二級結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象取決于DNA分子本身的的堿基構(gòu)成，即使一個堿基的差別也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)。SSCP用于檢測點突變?nèi)秉c：不能確定突變的位置現(xiàn)在位置P186目前七十三頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同的兩條單鏈。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時，不同構(gòu)象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA。只適合于檢測200bp以內(nèi)的DNA靶基因片段實驗的關(guān)鍵是控制各種條件以避免在操作過程中DAN單鏈分子復性為雙鏈。現(xiàn)在位置P186目前七十四頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點四、變性梯度凝膠電泳現(xiàn)在位置P186DNA分子的物理特性之一是當DNA分子被加熱至其融點溫度時雙鏈被打開。融點溫度取決于DNA分子本身的序列，不同序列的DNA分子具有不同的融點溫度。目前七十五頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點變性梯度凝膠電泳技術(shù)正是利用了DNA分子的這一特性。在設(shè)計引物時使被擴增目的片段的二端含有不同的Tm值，一端較高，另一端相對較低。將這一PCR產(chǎn)物在由變性劑形成梯度的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，當其泳動至相應位置時，片段于Tm值較低一端的雙鏈被部分解鏈，如此形成的構(gòu)象至使該片段的電泳遷移率大大降低。現(xiàn)在位置P186目前七十六頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點＋－變性劑濃度由低到高Tm值低Tm值高目前七十七頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點變性梯度凝膠電泳的優(yōu)缺點變性梯度凝膠電泳技術(shù)用于檢測點突變?nèi)秉c：不能確定突變的位置現(xiàn)在位置P186目前七十八頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點Tm值的大小取決于DNA分子的長度和其序列中的G/C含量雙鏈DNA可以結(jié)合熒光染料（SYBRGreenI）DNA復性時，熒光最強，隨溫度上升，熒光變?nèi)?，形成融點曲線。正常序列和突變序列因不同Tm而產(chǎn)生不同的融點曲線。

五、融點曲線分析現(xiàn)在位置P137目前七十九頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點溫度熒光強度目前八十頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點溫度熒光強度目前八十一頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點優(yōu)點：PCR產(chǎn)物不需要純化，可以直接分析可以進行大批量樣本分析，成本低結(jié)果重復性可達100%

缺點：不能確定突變的位置五、融點曲線分析現(xiàn)在位置P137目前八十二頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點PCR產(chǎn)物的序列分析主要用于

分子克隆時對于目的基因擴增片段的序列鑒定 對致病基因檢測時分析擴增片段中點突變的位置和性質(zhì)。六、PCR產(chǎn)物的序列分析現(xiàn)在位置P137目前八十三頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應，反應產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。目前八十四頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點DNA自動測序結(jié)果舉例目錄目前八十五頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點PCR產(chǎn)物序列分析的優(yōu)缺點優(yōu)點：可以確定點突變的位置和性質(zhì)缺點：成本貴目前八十六頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點PCR產(chǎn)物分析方法的比較用于突變位置突變性質(zhì)RFLP點突變能確定不能確定ASO點突變能確定能確定SSCP點突變不能確定不能確定DGGE點突變不能確定不能確定融點曲線點突變不能確定不能確定測序點突變能確定能確定目前八十七頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點拓展：PCR技術(shù)在分子診斷中的應用

分子診斷的定義就是用分子生物學技術(shù)通過檢測被檢測基因的存在與否、結(jié)構(gòu)變化或表達異常，確定受檢者有無基因水平的變化，并以此作為確認疾病的依據(jù)。分子診斷不僅能在疾病早期對患者作出確切的診斷，也能判別致病基因的攜帶者，確定個體對疾病的易感性并對疾病的分期、分型、療效監(jiān)測和預后作出判斷。因此，分子診斷已成為檢驗醫(yī)學的一個重要組成部分?，F(xiàn)在位置目前八十八頁\總數(shù)九十六頁\編于二十二點目前分子診斷最常見的應用：(1)鑒