生物工程制藥之維生素生產工藝

維生素生產工藝2.7維生素B2生產工藝維生素B2的國內外生產現狀

目前維生素B2的全球需求量在8000~10000噸，隨著中國、南美等國家飼料業(yè)的不斷發(fā)展，在未來3~5年內還會進一步提高。但生產商利潤率降低，使許多公司不得不集中力量理順生產和降低生產成本。由于采用發(fā)酵工藝比采用化學合成工藝有更大的降低生產成本空間，因此，生產商對發(fā)酵法維生素B2生產更加重視。飼料仍將是維生素B2最重要的市場，市場份額為50%左右，醫(yī)藥和食品約為30%，其他如保健品等市場份額為20%，。維生素B2產品根據其純度分為醫(yī)藥級（純度≥98%）、食品級（96%）和飼料級（VB2≥80%）。

目前一頁\總數四十七頁\編于二十點維生素B2生理功能和基本性質關于維生素B2商品名：維生素B2化學名：核黃素（riboflavin），6,7-dimethyl-9-(1-D-ribityl)isoalloxazine。分子式：C17H20N4O6分子量：376.38結構式：目前二頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前三頁\總數四十七頁\編于二十點

維生素B2又稱維生素G或核黃素。維生素B2是黃色針狀晶狀，微溶于水，遇堿易降解，遇光也容易分解。熔點：275-280℃溶解度：等電點：6.0

維生素生產工藝25℃27℃40℃100℃0.1g/L0.12g/L0.19g/L2.3g/L目前四頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝

1879年英國化學家布魯斯首先從乳清中發(fā)現VB2。Kuhn等于1933年首次從酵母、蛋清和乳清中分離出純的核黃素，并于1935年人工合成核黃素。因其結構中含有核糖且呈黃色,故取名核黃素。VB2它在動物機體內含量微少,是維持動物良好營養(yǎng)狀況和生產性能所必需的營養(yǎng)物質。

目前五頁\總數四十七頁\編于二十點維生素B2的主要功能是在氨基酸、脂肪酸和碳水化合物的代謝中起作用，是生命活動極其重要的物質，人體及家禽、家畜體內不能合成維生素B2，必須從外界攝取。人缺乏維生素B2將導致口角炎，舌炎，眼炎、結膜炎、陰囊炎等維生素B2缺乏癥。而動物缺乏維生素B2將導致生長發(fā)育遲緩、皮炎、神經失調、食欲不振、生育不良等癥狀。

維生素生產工藝目前六頁\總數四十七頁\編于二十點維生素B2產品廣泛應用于飼料添加劑、營養(yǎng)食品添加劑和著色劑、臨床用藥、保健、美容及化妝品等領域。此外，新的用途不斷被開發(fā)，

維生素B2在治療心絞痛、防治偏頭痛、治療慢性腎炎水腫和治療某些癌癥等方面也日益受到人們的注意；酪酸脂(以維生素B2為原料生產)，在日本廣泛用于治療動脈硬化、高血壓、糖尿病等頑固的慢性疾病，且有良好反應；發(fā)達國家將維生素B2用于污水處理也有報道。

維生素生產工藝目前七頁\總數四十七頁\編于二十點豬用添加預混料配方（美國大豆協(xié)會制定）

維生素生產工藝目前八頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝

維生素B2生產方式維生素B2可以采用微生物發(fā)酵和化學合成兩種方法生產全化學合成法

全化學合成法以葡萄糖為起始原料，工藝路線復雜，生產成本高，而且所用到的原料中含有二甲苯等有毒物質，對環(huán)境的污染嚴重，已經在核黃素的工業(yè)化生產中逐漸被淘汰.目前九頁\總數四十七頁\編于二十點

維生素B2生產方式

化學半合成

化學半合成核黃素的關鍵中間體為D-核糖（多采用細菌發(fā)酵將葡萄糖轉化），較早的合成途徑是D-核糖經氧化等4步化學反應，合成得到核黃素，之后又有化學家將其簡化成3步。具體合成路線為：D-核糖乙醇溶液（1）制備后，在一定氫壓存在的條件下,使（1）和3,4二甲苯胺或4硝基鄰二甲苯反應，得到N-D-核糖醇基-3,4-二甲苯胺（2），（2）再和苯胺重氮硫酸鹽(或鹽酸鹽)反應，得到（D-核糖胺基）-6-偶氮苯基-3,4-二甲苯（3）。此后,在酸性縮合劑存在的條件下，使（3）和巴比妥酸反應，制得最終產物核黃素(4)。維生素生產工藝目前十頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝發(fā)酵方法發(fā)酵生產的菌種主要包括Bacillussubtilis,Ashbyagossypii(核黃菌),Eremotheciumashbyii(阿氏假囊酵母)等，這些構建的微生物基因工程菌在合適的培養(yǎng)基上均可以產生核黃素，多為外分泌，過程采用液體深層發(fā)酵。目前發(fā)酵方法生產維生素B2比化學合成的方法更具優(yōu)勢，尤其是生產飼料級維生素B2，選擇全發(fā)酵法成本更低。目前十一頁\總數四十七頁\編于二十點Bacillus

subtilis由于具有下面幾個優(yōu)點而被選作構建生產核黃素的基因工程菌的出發(fā)菌株。1．Bacillussubtilis是一種非病原微生物，總的來說，許多由這種微生物生產的產品被認為是安全可靠的。2．Bacillussubtilis是革蘭氏陽性菌中一種具有代表性的模式菌株，由英、法、德、日、瑞士等八個國家聯(lián)合完成的枯草芽孢桿菌基因組計劃（BacillussubtilisGenomeProject），將枯草芽孢桿菌基因組的全部4,214,810個堿基完全測序并公開發(fā)表，包括2,379個基因的枯草桿菌基因圖譜也已繪制完成并發(fā)表，其中相當一部分基因及其編碼蛋白的分子生物學信息已經獲得，為枯草芽孢桿菌的基因工程改造、構建具有重要工業(yè)應用價值的工程菌株提供了詳細的背景資料。Bacillussubtilis中的核黃素合成基因在其染色體的210形成一個單一的核黃素操縱子結構。維生素生產工藝目前十二頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝3.通過經典的誘變育種技術，Bacillussubtilis

已經被成功地用于肌苷和鳥苷的工業(yè)化生產，產量可達20-40g/L。由于這些產品是合成核黃素的前體物，這顯示了Bacillussubtilis

具有良好的用于工業(yè)化生產核黃素的潛力。目前十三頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝發(fā)酵主要原材料發(fā)酵原材料主要包括糖或淀粉類糖化液、玉米漿、酵母粉、磷酸鹽等。

提取原料主要為去離子水、無機酸和堿等。生產周期：種子培養(yǎng)14小時，發(fā)酵50-60小時；生產效價：16-18g/L，提取收率90%。目前十四頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前十五頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前十六頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝VB2代謝途徑

維生素B2代謝途徑目前十七頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝

核黃素是異咯嗪的衍生物，在異咯嗪環(huán)的7,8位上有兩個甲基，10位N上連著一個核糖醇。關于核黃素的生物合成過程，不同種類的生物中并不完全相同。目前對大腸桿菌、枯草芽袍桿菌以及一些酵母中的核黃素合成途徑了解得比較清楚。在枯草芽抱桿菌中核黃素的合成從GTP開始共包括6個反應。如圖(Perkins,2002)所示:目前十八頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前十九頁\總數四十七頁\編于二十點目前二十頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前二十一頁\總數四十七頁\編于二十點核黃素合成過程中所涉及的酶以及編碼這些酶的基因在枯草芽抱桿菌中核黃素的合成共涉及4種酶蛋白(RibA,RibG,RibH,RibB)。其中RibA,RibG均為雙功能酶。RibA同時具有GTP環(huán)化裂解酶和3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸合成酶的活性。因此一方面它起到GTP環(huán)化裂解的作用另一方面還可以催化5-磷酸核酮糖生成3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸(Richter,1997)。這一點與大腸桿菌不同。大腸桿菌中這兩種酶分別由兩個不同的基因編碼并分別行使其功能。

RibG則同時具有嘧啶脫氨酶和嘧啶還原酶的活性。維生素生產工藝目前二十二頁\總數四十七頁\編于二十點

RibH和RibB分別具有黃素合成酶β亞基和黃素合成酶α亞基的功能。現在除了導致核糖脫去磷酸的酶沒有被鑒別出來之外，其余的酶均己被鑒定。表1為枯草芽抱桿菌中與核黃素合成相關的酶與基因(Perkins,2002)核黃素合成酶是一種復合酶，有輕酶和重酶兩種。由3個α亞基組成的酶為輕酶，重酶包括輕酶和60個β亞基，其中輕酶處于60個β亞基組成的衣殼中心。ribH編碼核黃素合成酶的β亞基，即二氧四氫蝶啶合成酶，分子量為16144，催化DHBP和ArP的縮合產生DRL。ribB編碼核黃素合成酶的α亞基，分子量為23333，催化2分子DRL發(fā)生歧化反應產生核黃素和ArP。維生素生產工藝目前二十三頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前二十四頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前二十五頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前二十六頁\總數四十七頁\編于二十點ribO是核黃素操縱子ribG基因上游存在的一個約300bp的非翻譯區(qū)，也稱為前導區(qū)，在早期對ribO的研究中發(fā)現其中含有一個不依賴ρ因子的終止子（一個穩(wěn)定的發(fā)卡結構后跟著6個U的殘基）和一個位于5’末端的8個核苷酸區(qū)域的反終止子，它與終止子發(fā)卡的“左翼”的是完全互補的。反終止子與終止子的左翼配對將會阻止發(fā)卡結構的形成，從而使轉錄能夠順利進行。維生素生產工藝目前二十七頁\總數四十七頁\編于二十點

反終止子位于終止子上游193個核苷酸處，這表明為了有效的與左翼競爭，需要通過特定的折疊而到達終止子處。該折疊為被稱做rfn-box或RFN元件，為一特異性RNA結構的保守序列。該rfn-box特異的同FMN/FAD結合從而感知其濃度。當FMN/FAD的濃度的較高時，rfn-box與FMN/FAD結合形成一個復合物。該復合物的形成對于rib操縱子的調控是非常重要的，它可以改變RNA的構象，形成抗－反終止子結構并阻止反終止子的形成，導致已經開始的轉錄在前導區(qū)提前終止，從而抑制核黃素的生成。維生素生產工藝目前二十八頁\總數四十七頁\編于二十點破壞RFN元件的ribO突變株均可以解除FMN對核黃素操縱子轉錄的負調節(jié)作用，從而有利積累核黃素。目前二十九頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前三十頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前三十一頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝2.7.6維生素B2的代謝調控和通量分析細胞代謝途徑的實質就是與一組特定的流入和流出代謝物相聯(lián)系的任何一個合理、可觀察的生化反應序列，代謝工程利用重組DNA技術對細胞的酶反應、物質運輸以及調控功能進行遺傳操作，進而改良細胞的生物活性，它關注代謝途徑的組合而非單一的反應，用整體、系統(tǒng)的觀點考察完整的生化反應網絡，重視途徑和目標產物的熱力學可行性、代謝通量及其控制。將代謝通量的定量分析方法與代謝通量控制的分子生物學技術完美結合在一起，合理地修飾生物細胞的遺傳性狀，是代謝工程的基石。系統(tǒng)研究代謝通量及其控制機制有三大基本步驟：（1）盡可能多地觀察途徑并測定其流量；（2）在代謝網絡中施加一個已知的擾動，并確定系統(tǒng)達到新的穩(wěn)態(tài)時的代謝通量；（3）系統(tǒng)分析代謝通量擾動的結果。若某個代謝通量的擾動對其下游代謝通量未能造成可觀察的影響，那么就可以認為該處的節(jié)點對上游擾動的反應是剛性的，反之則為柔性。在剛性節(jié)點處，試圖通過改變上游酶活性來影響下游代謝通量的做法是徒勞的。目前三十二頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝

細胞內同時進行的數千個生化反應構成了錯綜復雜的細胞代謝網絡體系，其中的各反應速率決定了整個網絡的代謝通量，而這些反應的速率受相應的酶活水平以及參與反應的代謝物濃度的影響，它們同時又受細胞性狀和所處環(huán)境的制約。代謝控制分析理論認為，代謝通量的控制是由組成代謝途徑的各個步驟及相互之間的關系決定的，并且分布在整個代謝途徑上。生物大分子和效應物并不能直接產生控制，而是通過作用于所在的反應而影響整個代謝系統(tǒng)的控制，限速步驟不是固定的，但系統(tǒng)控制系數的總和卻是固定的，它可以定量描述各個步驟對整個代謝控制發(fā)揮作用的相對程度，從而使實驗結果的解釋更趨合理。目前三十三頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝代謝通量平衡一般包括三個部分：化學計量網絡分析代謝通量分析同位素標記物分析目前三十四頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前三十五頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前三十六頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前三十七頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前三十八頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前三十九頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前四十頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝目前四十一頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝

由定量描述確定的代謝網絡可知，三種菌株中糖酵解途徑的通量

r7均大于戊糖磷酸氧化途徑（pentosephosphatepathway,PPP）的通量r4，因此糖酵解是葡萄糖代謝的主要途徑，大約有45~50%的葡萄糖用于生物體的合成，2.5-8.5%的葡萄糖用于合成核黃素，在發(fā)酵過程中大約有0.5~2%的葡萄糖用于合成副產物乙酸，3~7%的葡萄糖通過丙酮酸合成其它有機物，在我們的分析測定中，這些有機物中主要為雙乙酰，其含量約占30~70%，副產物中幾乎檢測不到甲酸。目前四十二頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝

一般認為PP途徑的兩個重要功能是提供還原力NADPH及前體物Ribulose-5-P和4-磷酸赤蘚糖，24R7/pMX45中PPP的通量比較小，通量r6只有3.2%，前體物Ribulose-5-P幾乎全用于合成核酸和核黃素，而在RH13[pRB63]40

中雖然PPP的通量增加了10%，但其合成核黃素的通量卻基本和24R7/pMX45相同。

另外在RH33/pMX45中PPP的通量達到32%，這比其兩株分別高約20%和10%，但其合成核黃素的通量僅增加了2~2.5%，通量分析的結果表明Ribulose-5-P的供給已經遠大于合成核黃素的需要，僅僅通過增加r4很難使合成核黃素的通量增加，因此要進一步提高RH33/pMX45中核黃素合成的通量必須增加從Ribulose-5-P到核黃素的合成能力，其中主要包括提高GTP的合成通量和從GTP到核黃素的通量兩個環(huán)節(jié)。目前四十三頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝

將RH33/pMX45

染色體上的pRB63進一步進行擴增以增加核黃素操縱子的劑量，然后將擴增后的菌株進行搖瓶發(fā)酵，結果擴增后菌株的核黃素產量并沒有得到有效的提高。這表明RH33/pMX45

中核黃素合成的主要通量限制因素可能存在于從Ribulose-5-P到GTP的一系列反應中。目前四十四頁\總數四十七頁\編于二十點維生素生產工藝2.7.7維生素B2的提取工藝VB2提取工藝路線（一）（1）

用鹽酸調發(fā)酵液pH到7，然后加熱到70℃，維持45分鐘；（2）將發(fā)酵液打入一個中間儲罐，然后靜置，冷卻到20℃，然后將發(fā)酵液進行多次離心，第一次需要的離心條件是：離心力2500g—3000g，最好是根據情況進行調整，以后的離心條件都是600g—750g，根據實際情況進行調整。（3）離心后的固體加入到酸性的去離子水中，同時將懸浮液加熱到120℃，攪拌并維持60分鐘，然后冷卻到80℃。離心過濾，得到的固體純度可以達到96%。（4）

如果此時的