高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿中美羅培南的濃度

題目高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿中美羅培南的濃度方法學(xué)驗(yàn)證目錄TOC\o"1-2"\h\u18100摘要 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿中美羅培南的濃度摘要建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高且重現(xiàn)性好的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法來(lái)測(cè)定人血漿中美羅培南濃度的方法并驗(yàn)證，為其臨床合理用藥提供依據(jù)。以法羅培南（Faropenem）為內(nèi)標(biāo)，血漿樣品預(yù)處理采用沉淀蛋白法：以1mL乙腈沉淀蛋白，經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心后，取上清液進(jìn)樣。色譜柱為UltimatePolar-RPHPLC3μm(3.0mm×100mm);流動(dòng)相為0.2%甲酸（95%水：5%乙腈）；流速為0.4mL/min;柱溫：40℃。結(jié)果美羅培南在0.1～40μg/mL的濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，R2=0.9998；定量下限為0.1μg/mL；高，中，低，LLOQ濃度點(diǎn)的美羅培南提取回收率相一致，均在15%左右，并且高，中，低，LLOQ4個(gè)濃度點(diǎn)的美羅培南提取回收率的RSD均小于15%，具有良好的精密度和重現(xiàn)性；日內(nèi)、日間RSD均小于15%。本方法操作簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確、靈敏度高且重現(xiàn)性良好，適用于臨床上對(duì)美羅培南的血藥濃度的快速監(jiān)測(cè)。關(guān)鍵詞：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；人血漿；美羅培南；血藥濃度DeterminationofMeropeneminHumanPlasmabyHPLC-MS/MSAbstract:Objective:Toestablishandoptimizeasimple,fast,accurate,high-sensitivityandreproduciblehighPerformanceliqiudchromatographymethodfordeterminingtheconcentrationofmeropeneminhumanplasmaforprovidingapracticalmethodforclinicaluseofmeropenem,andvalidatethemethodology.Methods:PlasmasampleswerespikedwithFaropenemastheinternalstandard,plasmawasprecipitatedwith1mLacetonitrile,aftermixedfor5mins,theywerecentrifugedwithhighspeedfreezingcentrifugeandthesupernatantwasinject.SeparationasachievedonanUltimatePolar-RPHPLC3μm(3.0mm×100mm).Themobilephasewas0.2%HF(95%H2O:5%ACN),andthepumpflowratewas0.4mL/min.Thecolumntemperaturewas40℃.Results:Calibrationcurvesofmeropenemshowedgoodlinearregressionintherangeof0.1～40μg/mL(R2=0.998)Thelowerlimitofquantificationofmeropenemwas0.1μg/mL.Theextractionrecoverybetweenthehigh,medium,lowandLLOQconcentrationofmeropeneminqualitycontrolsampleswasconsistentwitheachother,andwasaround15%.TheRSDofthefourconcentrationlevelQCsamplewaslessthan15%withgoodprecisionandreproducibility.Intra-andinter-dayvariationswere<15%.Conclusion:Theestablishedmethodsimple,fast,accurate,sensitiveandhasgood-reproduciblefortheclinicalbloodconcentrationofmeropenemfastmonitoring.KeyWords:LC-MS/MS;Meropenem;Theconcentrationofmeropeneminhumanplasma.引言美羅培南屬于廣譜碳青霉烯類(lèi)抗生素，用于重癥感染，多用作為耐藥菌感染的最后選擇。臨床患者用藥后，個(gè)體間血藥濃度存在較大差異，故測(cè)定血藥濃度對(duì)臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。美羅培南的測(cè)定方法有多種，如氣相色譜法[1]，旋光法[2]，熒光共振能量轉(zhuǎn)移光譜法[3]等，而在臨床檢測(cè)中，HPLC法是測(cè)定美羅培南的人血藥濃度的常用分析手段。1.儀器與試藥1.1儀器BT125D電子天平(sartorius公司）；移液槍?zhuān)╡ppendorf公司）；VortexGenius3渦旋混合器（德國(guó)IKA集團(tuán)）；NexeraX2LC-30AD液相色譜-API3200質(zhì)譜聯(lián)用儀，含DGU-20A在線脫氣單元、CTO-30A柱溫箱、SIL-/30A自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜工作站Analyst1.6.2系統(tǒng)軟件（美國(guó)ABSCIEX公司）；KDC-2044低速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；ThermoScientificMicro21R微量臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）1.2試藥對(duì)照品：美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品（EuropeanPharmacopoeiaReferenceStandard,歐洲藥典委員會(huì))(批號(hào)：201403)試劑：乙腈（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）;法羅培南（批號(hào)：050401，江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司）;甲酸（色譜純，上海久億化學(xué)試劑有限公司）;哇哈哈純凈水（杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司）2.方法與結(jié)果2.1色譜條件柱溫：40℃進(jìn)樣體積：2μL流速：0.4mL/min內(nèi)標(biāo)：法羅培南色譜柱：UltimatePolar-RPHPLC色譜柱(3.0mm×100mm，3μm)流動(dòng)相：乙腈(B):0.2%甲酸(A)梯度：時(shí)間(min)AB0.09551.09551.575255.535655.69558.09552.2質(zhì)譜條件Polarity:Postive;Scantype:MRM;CurtainCas(CUR):20;CollisionCas(AD):5;IonSprayVoltage(IS):5500;Temperture(TEM):500;IonSourceGas1(Gas1):50;IonSourceGas2(Gas2):50;InteerfaceHerter(ihe):OnQ1Mass(Da)Q3Mass(Da)Time(msec)DP(volts)CE(volts)384.20141.23002420308.0178.030050162.3溶液的配置2.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱(chēng)取取美羅培南（Meropenem130506-201403）約3mg用稀釋液（ACN：H2O=1：1）稀釋至1mg/mL，作為儲(chǔ)備液溶液，于4℃的條件下冰箱保存?zhèn)溆?。精密量取美羅培南標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用稀釋液定量稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度從高到底依次為400,200,100,50,10,5,1μg/mL的美羅培南系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。美羅培南系列標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋方法如下：1.400μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液：儲(chǔ)備溶液400μL+稀釋液600μL→400μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液2.200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液：400μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL+稀釋液500μL→200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液3.100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液：200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL+稀釋液500μL→100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液4.50μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL+稀釋液500μL→50μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液5.10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液：50μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液200μL+稀釋液800μL→10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液6.5μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液：10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL+稀釋液500μL→5μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液7.1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液：5μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液200μL+稀釋液800μL→1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液2.3.2內(nèi)標(biāo)溶液的配制采用十萬(wàn)分之一天平精密稱(chēng)取法羅培南適量，用稀釋液（ACN：H2O=1：1）溶解稀釋得1mg/mL的法羅培南內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，冰箱保存?zhèn)溆?。精密量取?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量用稀釋液定量稀釋?zhuān)渲瞥?00μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液在4℃的條件下保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。2.4血漿樣品預(yù)處理將血樣放入低速冷凍離心機(jī)離心8min，轉(zhuǎn)速調(diào)至3000r/min；拿出血樣后，用移液槍吸取上清液。取100μL上清液加入10μL法羅培南（200μg/mL）混勻，加入1mL乙腈渦旋混勻5min，離心5min后，取上清液2μL進(jìn)HPLC。2.5方法專(zhuān)屬性（考察血漿內(nèi)源性物質(zhì)的干擾）采用“2.1”項(xiàng)下的本實(shí)驗(yàn)的色譜條件，考察空白血漿（6個(gè)不同個(gè)體的空白血漿和6個(gè)不同個(gè)體的空白血漿的混合血漿），空白血漿加入美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，以及給藥后臨床患者的血漿樣品色譜圖。圖1空白血漿圖2空白血漿+內(nèi)標(biāo)圖3空白血漿+藥+內(nèi)標(biāo)結(jié)論：美羅培南保留時(shí)間在3.39min左右，法羅培南保留時(shí)間在4.36左右，美羅培南和內(nèi)標(biāo)法羅培南峰形良好，無(wú)雜峰干擾，基線平穩(wěn)。2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限取解凍后的空白血漿100μL，置于1.5mL的EP管中，分別精密加入400,200,100,50,10,5,1μg/mL的美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液各10μL于100μL空白血漿中，渦旋儀上混合均勻，使得血藥濃度相當(dāng)于40,20,10,5,1,0.5，0.1μg/mL，再加入10μL法羅培南（200μg/mL）混勻，按照“2.3血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法同法處理后，進(jìn)樣2μL,記錄色譜圖，記錄美羅培南與法羅培南的保留時(shí)間和峰面積，以美羅培南血漿濃度為橫坐標(biāo)，美羅培南與內(nèi)標(biāo)物法羅培南的峰面積之比為縱坐標(biāo)，對(duì)美羅培南血藥濃度進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程。表1美羅培南的線性序號(hào)濃度峰面積(MMP)峰面積(FMP)10.11138.7126715.420.55359.9125609.63111302.3133014.74550123.8117984.3510105973.3118341.1620213952.1119884.9740416134.3118791.6結(jié)果表明，美羅培南在0.1～40μg/mL之間，濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.0881X-0.000381,R2=0.9998,標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)0.1μg/mL的RSD<15%,具有較高精密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最小濃度值0.1μg/mL為定量下限，該方法具有高的靈敏度。2.7回收率試驗(yàn)取空白血漿，加入一定量的美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配成濃度分別為30μg/mL(高濃度質(zhì)控樣品)，2μg/mL（中濃度質(zhì)控樣品），0.2μg/mL（低濃度質(zhì)控樣品）的樣品各6份，按樣品預(yù)處理方法處理，進(jìn)樣2μL，得到色譜圖，記錄美羅培南的峰面積為R。另將空白血漿換成等體積的娃哈哈純凈水，與質(zhì)控樣品同樣的方法和步驟處理，加入等量的美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同法制備相同的高，中，低3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品，同法測(cè)定，得到色譜圖，記錄美羅培南的峰面積為D。將質(zhì)控樣品和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品的美羅培南和法羅培南色譜峰面積分別進(jìn)行比較，計(jì)算美羅培南的提取回收率。結(jié)果如表：表2美羅培南和法羅培南提取回收率實(shí)驗(yàn)序號(hào)濃度(μg/mL)RDR/D%Average(R/D%)Average(R/D%)10.222153935.8756.2958.7657.072229258.223232859.154218555.515270068.606215654.79722326844461.2152.3356.9582322352.2392536757.05102509856.45112679260.26122818163.381330351312673347.6952.1755.491435413352.591534412751.111639877159.221736911554.821842426563.01結(jié)論：由表可知，美羅培南的低、中、高濃度的回收率分別為58.76%、56.95%、55.49%，總回收率為57.07%。2.8精密度試驗(yàn)精密吸取空白血漿，分別配制質(zhì)量濃度為40μg/mL（ULOQ質(zhì)控樣品），30μg/mL(高濃度質(zhì)控樣品)，2μg/mL（中濃度質(zhì)控樣品），0.2μg/mL（低濃度質(zhì)控樣品），0.1μg/mL（LLOQ質(zhì)控樣品）的樣品各5份，按照樣品預(yù)處理方法處理。每天隨行建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并重新配制各濃度質(zhì)控樣品，連續(xù)三天，考察日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果如下：表3日內(nèi)精密度濃度（μg/mL）序號(hào)實(shí)測(cè)值（μg/mL)RSD(%)0.110.091312.2320.11530.11440.092450.09220.210.2046.4620.20630.19140.17850.183211.788.7122.0932.1342.1352.2730129.73.39229.5329.5429.9531.940134.312.34244.5344.9440.6547.9表4日間精密度濃度（μg/mL）序號(hào)第一天-實(shí)測(cè)值（μg/mL)第二天-實(shí)測(cè)值（μg/mL)第三天-實(shí)測(cè)值（μg/mL)平均值RSD(%)0.110.09130.1130.1130.117.8420.1150.1050.10530.1140.1120.11240.09240.1010.10150.09220.1070.1070.210.2040.2140.2140.217.5620.2060.2330.23330.1910.1970.19740.1780.2080.20850.1830.2130.213211.781.971.971.9910.9522.091.681.6842.131.831.8352.272.332.3330129.727.827.828.635.61229.525.825.8329.527.827.8429.928.428.4531.929.729.740134.337.337.338.9310.45244.538.638.6344.939.539.5440.63535547.935.535.52.9穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取空白血漿，分別配制質(zhì)量濃度為30μg/mL(高濃度質(zhì)控樣品)，0.2μg/mL（低濃度質(zhì)控樣品）的樣品各3份，分別考察在室溫條件下放置0，6，12h,24h美羅培南的穩(wěn)定性，并隨行建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，將美羅培南峰面積和內(nèi)標(biāo)法羅培南的峰面積比值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求算美羅培南濃度，分別與0h根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所求算得到的美羅培南濃度進(jìn)行比較，計(jì)算保留比例。表5美羅培南的穩(wěn)定性時(shí)間（h)低（μg/mL)中（μg/mL)高（μg/mL)097.33100.1097.50690.26100.03100.2612105.6798.70100.372498.4394.1796.20AVE97.9298.2598.58RSD(%)6.442.852.102.10基質(zhì)效應(yīng)取6種不同空白血漿平分為3組，每份血漿為100μL，加1mL乙腈沉淀蛋白，取上清液200μL留備用。再在上述溶液中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為以下濃度：低（0.2μg/mL）、中（2μg/mL）、高（30μg/mL）的美羅培南的內(nèi)標(biāo)法羅培南（200μg/mL），渦旋，離心，取上清，進(jìn)樣測(cè)定峰面積記為T(mén)。另取空白試管直接加入相應(yīng)濃度的美羅培南和內(nèi)標(biāo)法羅培南各10μL，再加入200μL流動(dòng)相，進(jìn)樣測(cè)定，峰面積記為D。以上同一質(zhì)量濃度、兩種處理方法得到的峰面積比值即為基質(zhì)影響百分比。數(shù)據(jù)如表：表6美羅培南的基質(zhì)效應(yīng)濃度（μg/mL)TDT/D(%)AVE(%)0.242093935.87106.94109.324326109.914343110.354386111.433969100.844583116.4524449344461.21100.07100.2347856107.6347568106.993561080.0945160101.5746681104.9930645256673347.6995.8396.3056497883.91718629106.7262830393.3164272295.45690642102.57內(nèi)標(biāo)23375.2621856.02106.9599.1821742.4599.4823541.97107.7116730.2976.5521630.6498.9723043.8105.43結(jié)果顯示，低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的美羅培南和內(nèi)標(biāo)法羅培南的基質(zhì)效應(yīng)影響百分比分別為109.32%，100.23%，96.30%，99.18%，符合方法學(xué)要求，可視為無(wú)基質(zhì)效應(yīng)影響。3.討論3.1內(nèi)標(biāo)化合物的選擇查閱相關(guān)文獻(xiàn)，美羅培南的內(nèi)標(biāo)化合物有：頭孢他定[4]，頭孢曲松，法羅培南等，分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線，觀察出峰情況，其中，法羅培南對(duì)美羅培南干擾最小，且未出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，內(nèi)標(biāo)法羅培南的響應(yīng)也足夠高，故內(nèi)標(biāo)化合物選擇法羅培南。3.2蛋白沉淀方法的選擇美羅培南屬于碳青霉烯類(lèi)抗生素，在血漿中很不穩(wěn)定，在受熱和水解條件下易產(chǎn)生指針型雜質(zhì)[5]。目前實(shí)際工作中常用的血漿樣品預(yù)處理方法有：去除蛋白質(zhì)法，液液萃取法（LLE），固相萃取法（SPE）等。其中去除蛋白質(zhì)的方法常用的有：溶劑解法，加入中性鹽，加入強(qiáng)酸，超濾法等。嘗試使用甲醇或乙腈沉淀蛋白，發(fā)現(xiàn)含藥血漿加入甲醇后，形成混懸液，而加入乙腈后，直接出現(xiàn)沉淀物，很明顯，乙腈的沉淀效果更佳，故選用乙腈。含藥血漿加入1mL乙腈，可將90%蛋白質(zhì)沉淀除去。3.3試驗(yàn)局限性美羅培南在血漿中很不穩(wěn)定，在室溫下也很不穩(wěn)定。通常，采集來(lái)的血液樣本，經(jīng)離心后，需要加入穩(wěn)定劑，常用的穩(wěn)定劑，如MES（馬林乙磺酸）等。然而，本實(shí)驗(yàn)樣本不能加入穩(wěn)定劑溶液，因其含有金屬離子，而質(zhì)譜檢測(cè)器不能進(jìn)金屬離子，所以，采集來(lái)的樣本，經(jīng)離心提取血漿后，應(yīng)放入冰箱，并盡快測(cè)其濃度。4.臨床應(yīng)用美羅培南適用于嚴(yán)重感染一種或多種美羅培南敏感的細(xì)菌的成人和兒童[6]。包括肺炎、腦膜炎、尿路感染、皮膚軟組織感染、敗血癥。經(jīng)驗(yàn)性治療，對(duì)成人粒細(xì)胞減少癥伴發(fā)熱患者，可單獨(dú)應(yīng)用本品或聯(lián)合抗病毒藥或抗真菌藥使用。美羅培南單用或與其它抗微生物制劑聯(lián)合使用可用于治療多重感染。目前對(duì)于中性粒細(xì)胞減少或原發(fā)性、繼發(fā)性免疫缺陷的嬰兒患者，尚無(wú)本品的使用經(jīng)驗(yàn)。藥代動(dòng)力學(xué)（PK）/藥效學(xué)（PD）：美羅培南為時(shí)間依賴(lài)型抗生素，其抗菌效能取決于給藥間隔內(nèi)藥物濃度超過(guò)病原菌最低抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）的時(shí)間（t>MIC）。文獻(xiàn)表明[7-9]，由于年齡、體重、腎功能、疾病狀態(tài)的不同，患者的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)有較大差異。當(dāng)（t>MIC）接近20%時(shí)，可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，達(dá)到40%時(shí)具有最大殺菌效應(yīng)[10]。近期研究表明，當(dāng)（t>MIC）＞76%時(shí)，對(duì)下呼吸道感染具有較好的療效。而對(duì)于血液感染，（t>MIC）應(yīng)＞75%[11]。由于美羅培南在常規(guī)劑量下的毒性反應(yīng)較低，建議對(duì)于嚴(yán)重感染，盡可能按敏感性折點(diǎn)對(duì)MIC進(jìn)行取值。因此，通過(guò)血藥濃度監(jiān)測(cè)，結(jié)合微生物培養(yǎng)結(jié)果，能及時(shí)調(diào)整給藥方案，對(duì)抗菌藥物的合理應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。5.結(jié)論本實(shí)驗(yàn)采用法羅培南作為內(nèi)標(biāo)物，建立了測(cè)定人血漿中美羅培南的血藥濃度的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，線性方程為Y=0.0881X-0.000381,R2=0.9998,定量下限為0.1μg/mL；高，中，低，LLOQ濃度點(diǎn)的美羅培南提取回收率相一致，均在15%左右，并且高，中，低，LLOQ4個(gè)濃度點(diǎn)的美羅培南提取回收率的RSD均小于15%，具有良好的精密度和重現(xiàn)性；日內(nèi)、日間RSD均小于15%。且血漿樣品預(yù)處理步驟簡(jiǎn)單，可用于快速測(cè)定人血漿中美羅培南的濃度。目前該方法已經(jīng)應(yīng)用于臨床上重癥感染患者美羅培南治療藥物濃度監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，該方法能夠滿足臨床美羅培南血藥濃度的快速監(jiān)測(cè)，為個(gè)體化給藥方案的制定提供技術(shù)檢測(cè)依據(jù)，指導(dǎo)臨床合理用藥，同時(shí)也為進(jìn)行美羅培南重癥感染患者的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。致謝（謝辭）參考文獻(xiàn)[1]殷果,李玉蘭,鄧穎,等.旋光法測(cè)定注射用美羅培南的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2004,23(11):865-866.[2]趙國(guó)芬,尹翠英.氣相色譜法測(cè)定美羅培南中殘留溶劑含量[J].河北化工,2009,32(8):69-70.[3]劉秋連,李松青.熒光共振能量轉(zhuǎn)移光譜法測(cè)定尿液中美羅培南的含量[J].中國(guó)藥師,2014,12:2016-2018.[4]徐明,王強(qiáng),史中華,楊莉,韓榮,陳光強(qiáng),周建新.美羅培南靜脈持續(xù)泵入時(shí)血液和腦脊液藥物濃度的測(cè)定[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,05:584-586.[5]王楠,胡昌勤,劉茜.表征碳青霉烯類(lèi)藥物穩(wěn)定性的指針性雜質(zhì)的確定及其應(yīng)用[J].藥物分析雜志,2011,01:90-94.[6]梅丹.新的碳青酶烯類(lèi)抗生素———美羅培南.中