系統(tǒng)生物學合成生物學與轉(zhuǎn)錄組學

Genome

transplantation

in

bacteria:

changing

one

species

to

another天然完整基因組種間轉(zhuǎn)移:

As

a

step

toward

propagation

of

synthetic

genomes,

we

completely

replaced

the

genome

of

a

bacterial

cell

with

one

from

another

species

by

transplanting

a

whole

genome

as

naked

DNA.

Intact

genomic

DNA

from

Mycoplasma

mycoides（蕈狀支

原體）large

colony

(LC),

virtually

free

of

protein,

was

transplanted

into

Mycoplasma

capricolum（山羊支原體）

cells

by

polyethylene

glycol(PEG)-

mediated

transformation.

Cells

selected

for

tetracycline

resistance,

carried

by

the

M.

mycoides

LC

chromosome,

contain

the

complete

donor

genome

and

are

free

of

detectable

recipient

genomic

sequences.

These

cells

that

result

from

genome

transplantation

are

phenotypically

identical

to

the

M.

mycoides

LC

donor

strain

as

judged

by

several

criteria.---

Science.

2007

Aug

3;

317:632-8目前一頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點合成基因組---Science論文Science

2

July

2010:

Vol.

329.

no.

5987,

pp.

52

-

56Creation

of

a

Bacterial

Cell

Controlled

by

a

ChemicallySynthesized

GenomeDaniel

G.

Gibson,1

John

I.

GlassetalWereportthedesign,synthesis,andassemblyofthe1.08–mega–basepairMycoplasma

mycoidesJCVI-syn1.0genomestartingfromdigitizedgenomesequenceinformationanditstransplantationintoaM.capricolumrecipientcelltocreatenewM.

mycoidescellsthatarecontrolledonlybythesyntheticchromosome.TheonlyDNAinthecellsisthedesignedsyntheticDNAsequence,including"watermark"sequencesandotherdesignedgenedeletionsandpolymorphisms,andmutationsacquiredduringthebuildingprocess.Thenewcellshaveexpectedphenotypicpropertiesandarecapableofcontinuousself-replication.目前二頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點目前三頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點合成生命的關(guān)鍵步驟FirstSelf-ReplicatingSyntheticBacterialCell20-May-2010

1)合成供體的基因組DNA：首先，將蕈狀支原體的全基因組測序，并按照該序列信息將其合成為1078條平均長度為1080bp的DNA片段。這些片段兩兩間具有80bp的部分重疊，所有片段拼接起來構(gòu)成蕈狀支原體的全長基因組。值得注意的是這些合成的片段較天然基因組略有一些改動，包括去除了14個不重要的基因、為阻斷基因而設(shè)計的兩個插入序列、27處單核苷酸多態(tài)性(其中19處在意料之中)以及4條用來區(qū)分于天然序列模本的“水印”標記(Watermark)，這些改動都不影響細胞正常的生命活動。該過程涉及到計算機對合成序列的精密計算。目前四頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點2)合成DNA片段的拼接：將以上合成的1078條DNA片段分別連接到載體，使其能在酵母細胞中通過同源重組拼接起來。于是，平均1080bp的DNA片段，10個一組拼接為大約10kb的片段(109個)，然后將這些連接有目的基因片段的載體從酵母中分離出來，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli中進行擴增，以限制酶篩選出陽性克??；之后再將陽性克隆質(zhì)粒中的這109條10kb左右的片段按同樣的方法每組10個拼接成100kb的片段(11個)；這11條片段最終拼接成完整的總共1077947bp的基因組(由于攜帶太大片段的載體在E.coli中不能穩(wěn)定傳代，因此后兩步拼接中采用多重PCR來篩選陽性克隆)。此過程除了2個銜接反應(yīng)是在體外用酶處理構(gòu)建，其余所有的片段都是在酵母細胞內(nèi)依靠同源重組拼接而成。目前五頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點3)人工基因組的甲基化修飾：由于供體細胞(蕈狀支原體)和受體細胞(山羊支原體)共用同一套限制酶系統(tǒng)，而天然的供體基因組是經(jīng)甲基化修飾的。因此，拼接完成的基因組DNA還需在體外用甲基化酶(從蕈狀支原體或山羊支原體提取物中純化)進行修飾，以避免受體細胞限制酶系統(tǒng)的阻礙。4)人工基因組移植入受體細胞：將構(gòu)建好的人工合成基因組移植入山羊支原體內(nèi)。細胞經(jīng)過不斷分裂傳代，具有人造基因組的細胞在含抗生素的培養(yǎng)基中篩選出來，同時含有天然DNA的細胞逐漸消失殆盡。最終只剩下含有山羊支原體細胞質(zhì)但由合成DNA控制的人工嵌合體細胞。雖然蕈狀支原體和山羊支原體在基因組上75%是同源的，但該人造細胞明顯表現(xiàn)出蕈狀支原體的生長特性。目前六頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點合成生命操作圖解

取名

Synthia:人造兒創(chuàng)造這個可復制的試驗性單細胞生物花費了4,000萬美元目前七頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點人工合成基因組中的水印Thesecretaminoacidmessagescontainedin"watermarks"thatwereembeddedintheworld’sfirstmanmadebacterialgenome.NCBIcheckedintothegeneticsequencesubmittedbyVenter’sInstituteandfoundthewatermarkshiddeninplainsight.ThefivecodedmessagesthatwillgodowninhistoryasembeddedinthefirstsyntheticgenomeVENTERINSTITVTECRAIGVENTERHAMSMITHCINDIANDCLYDEGLASSANDCLYDE代表5個作者:CraigVenter,HamiltonSmith,JohnGlass,ClydeHutchison目前八頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點人工基因組組裝與檢測目前九頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點合成基因組結(jié)構(gòu)圖目前十頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點Transcriptomics轉(zhuǎn)錄組學目前十一頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點Transcriptome:Anevolvingdefinition(Thepopulationof)mRNAsexpressedbyagenomeatanygiventime(Abbott,1999)轉(zhuǎn)錄組（Transcriptom）：細胞所包含mRNA的總和。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時間和空間的限定。轉(zhuǎn)錄組學（Transcriptomics）：研究細胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型與拷貝數(shù)；比較不同功能狀態(tài)下mRNA表達的變化，搜尋與功能狀態(tài)變化緊密相關(guān)的重要基因群。

目前十二頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點新定義Thecompletecollectionoftranscribedelementsofthegenome.(Affymetrix,2004)mRNArRNA,tRNAsnmRNAs(smallnon-messengerRNAs)microRNAsandsiRNAs(smallinterferringRNAs)snoRNAs(smallnucleolarRNAs)核仁小分子RNAsnRNAs(smallnuclearRNAs)Othernon-codingRNAsLongnon-codingRNA(lncRNA)目前十三頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點轉(zhuǎn)錄本All

transcripts

All

mRNAs目前十四頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點Transcriptomics

DefinitionThestudyofcharacteristicsandregulationofthefunctionalRNAtranscriptpopulationofacell/sororganismataspecifictime.ScopethepopulationoffunctionalRNA

transcripts.themechanismsthatregulatetheproductionofRNAtranscriptsdynamicsofthetrancriptome(time,celltype,genotype,externalstimuli)目前十五頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點一、轉(zhuǎn)錄組學研究全部RNA的表達及功能轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）指特定狀態(tài)下一種細胞或組織所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和。——包括編碼RNA，即mRNA和非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)轉(zhuǎn)錄組學（transcriptomics）：是在整體水平上研究細胞基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的科學。RNA組學（RNomics）：是分析、鑒定非信使小RNA（smallnon-messengerRNA,snmRNA）在特定狀態(tài)下表達情況、功能及其與蛋白質(zhì)的相互作用。目前十六頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點轉(zhuǎn)錄組的特點：受到內(nèi)外多種因素的調(diào)節(jié)，因而是動態(tài)可變的。能夠揭示不同物種、不同個體、不同細胞、不同發(fā)育階段及不同生理病理狀態(tài)下的基因差異表達信息。目前十七頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點基于測序：cDNA文庫、illumina測序基于雜交：cDNA芯片（GeneChip，microarray）基因表達聚類轉(zhuǎn)錄組學的研究方法目前十八頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點（一）微陣列是大規(guī)?；蚪M表達譜研究的早期主要技術(shù)大規(guī)模表達譜或全景式表達譜（globalexpressionprofile）：是生物體（組織、細胞）在某一狀態(tài)下基因表達的整體狀況。微陣列或基因芯片（DNAchip）:利用光導化學合成、照相平板印刷以及固相表面化學合成等技術(shù)，在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸探針，并與放射性同位素或熒光物標記的來自不同細胞、組織或整個器官的DNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA進行雜交，然后用特殊的檢測系統(tǒng)對每個雜交點進行定量分析。目前十九頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點SpottedMicroarrayscDNAArraysOligoArrays

InSituOligoSynthesisPhotosynthesisPlanersurfaceMicrofluidicschipE-fieldsynthesisIntegratedChips

IntegrateduF,microarrayanddetectionchipswithPCR,fluorescenceore-detectionMicrofluidicsPlasticsCeramicsSiliconOthermaterials不同的生物芯片技術(shù)平臺點樣芯片原位合成芯片微流體芯片整合型芯片目前二十頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點基因芯片的探針目前二十一頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點TaggedRNAfragmentsflushedoverarrayLaseractivationoffluorescenttagsOpticalscanningofhybridizationintensities基因芯片的雜交實驗?zāi)壳岸揬總數(shù)六十八頁\編于二十一點Experimentaloverview:HybridizationWashingScancy5channelScancy3channel“Overlayimages”Quantifypixelintensities.CellpopulationACellpopulationBRNAextractionAABBReversetranscriptionAABBKlenowlabelincorporationSampleBlabelledwithcy3dyeSampleAlabelledwithcy5dye目前二十三頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點Cy3和Cy5Cy3激發(fā)波長532nmCy5激發(fā)波長635nm目前二十四頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點圖像掃描Cy5Cy3目前二十五頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點歸一化目前二十六頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點LimitofDetection:1in30,000transcripts

~20transcripts/cellRed–increaseofCy5sampletranscriptsGreen–increaseofCy3sampletranscriptsYellow–equalabundance目前二十七頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點差異基因篩選原理：采用cy3/cy5的ratio值對差異基因進行判斷，或采用統(tǒng)計方法對差異基因進行統(tǒng)計推斷。方法：倍數(shù)法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5Z值法：Z=(X-μ)/σ

作用：發(fā)現(xiàn)兩個樣本間的差異表達基因，便于后續(xù)分析。目前二十八頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點MicroarrayandGeneChipApproachesAdvantages:RapidMethodanddataanalysiswelldescribedandsupportedRobustConvenientfordirectedandfocussedstudiesDisadvantages:ClosedsystemapproachDifficulttocorrelatewithabsolutetranscriptnumberSensitivetoalternativesplicingambiguities目前二十九頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點目前三十頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點高通量測序高通量測序技術(shù)（High-throughputsequencing）是指能夠一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，每一次序列測定的讀長一般較短的測序技術(shù)。

高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(shù)(nextgenerationsequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。目前三十一頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點目前三十二頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點高通量測序中重要名詞解釋1、測序深度：測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一個基因組大小為7M，測序總堿基數(shù)為70M，則測序深度為10×。2、覆蓋度：測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中高GC含量，重復序列等復雜結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組裝的序列往往無法覆蓋所有的區(qū)域，這些區(qū)域就叫做Gap。二者的關(guān)系：測序深度與基因組覆蓋度之間是一個正相關(guān)的關(guān)系，測序帶來的錯誤率或假陽性結(jié)果會隨著測序深度的提升而下降。當測序深度在10～15X以上時，基因組覆蓋度和測序錯誤率控制均得以保證。目前三十三頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點3、RPKM（readsperkilobasepermillionreads）是每百萬讀段中來自于某基因每千堿基長度的讀段數(shù)。其公式為:

其中，totalexonreads指映射到某個基因上的reads數(shù)，mappedreads指map到所有基因的總的reads數(shù)。RPKM不僅對測序深度作了歸一化，而且對基因長度也作了歸一化，使得不同長度的基因在不同測序深度下得到的基因表達水平估計值具有了可比性，是目前最常用的基因表達估計方法。目前三十四頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點基于illumina測序的轉(zhuǎn)錄組分析：

RNA-seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析目前三十五頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點TotalRNA樣品檢測

Agilent2100檢測OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

目前三十六頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓↓第二天末端修復↓↓加接頭膠回收3’端加A第三天PCRPCR膠回收↓↓

文庫制備↓↓目前三十七頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點cDNA:為具有與某RNA鏈呈互補的堿基序列的單鏈DNA即complementaryDNA之縮寫。以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。cDNA文庫目前三十八頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過磁珠吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。目前三十九頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點mRNA反轉(zhuǎn)錄純化過的mRNA樣品加入1μl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1μl的stopbuffer終止反應(yīng)。加入沉淀劑（NaAc糖原無水乙醇）沉淀酶切產(chǎn)物。目前四十頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點末端修復cDNA3′末端加AAdapter連接目前四十一頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點不同方法比較目前四十二頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點OHFlowCell接頭diol

P7

P5

dioldiol模板雜交dioldiol

延長dioldiol

變性堿基片段雜交目前四十三頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點CTAGCTA5’-3’-…-5’GT

合成第一個堿基Cycle1:按順序加入反應(yīng)試劑

清除未反應(yīng)的堿基和試劑

激發(fā)堿基熒光并收集熒光信號去除阻斷基團和熒光基團Cycle2-n: 重復前面的步驟GTCTAGTCTGCTAGA基于SBS測序技術(shù)目前四十四頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點Clusterstation剩下的復制鏈其一端“固定”在芯片上，另外一端隨機和附近的另外一個引物互補，被“固定”住，形成“橋”(bridge)。形成的單鏈橋，以周圍的引物為擴增引物，在芯片表面進行擴增，形成雙鏈。雙鏈經(jīng)變性成單鏈，再次形成橋，并作為下一輪擴增的模板繼續(xù)擴增反應(yīng)。反復若干輪擴增，每個單分子得到了大量擴增，成為單克隆“DNA簇群”。目前四十五頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點生物信息分析目前四十六頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點基因表達聚類分析轉(zhuǎn)錄組學方法的應(yīng)用導致基因表達數(shù)據(jù)爆炸性增長。如何對這些數(shù)據(jù)進行分析，從中提取有意義的生物學信息，已成為轉(zhuǎn)錄組學的研究熱點和技術(shù)瓶頸。聚類分析技術(shù)能將待處理的對象分配到相應(yīng)的聚類中，使得同一聚類中的對象差別較小，不同聚類之間的對象差別較大。聚類分析技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組學研究中，非常適合大批量分析基因群的功能。

目前四十七頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點基因表達聚類的數(shù)據(jù)表現(xiàn)Systematicvariationingeneexpressionpatternsinhumancancercelllines.

Nature,2000,Rossetal.目前四十八頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點目前四十九頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點目前五十頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點有參考基因組序列信息分析流程目前五十一頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點Reads在基因組上的分布目前五十二頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化(Nagalakshmi,U.etal.,2008)

通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出酵母3’和5’UTR區(qū)域目前五十三頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點

鑒定基因可變剪接exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA目前五十四頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點鑒定融合基因目前五十五頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistributionPaired-End(PE)Reads目前五十六頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點NEngJMed2009SNP分析目前五十七頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolution

revealshighcomplexityofthericetranscriptomeGenomeRes2010RiceTranscriptomeMaterial

callus

rootatseedlingstage（14d）

shootatseedlingstage（14d）

flagleaves（2stages）

panicle（3stages）Methods

RNASeq（paired-end&singleend）

DGE

smallRNA（18-30nt）基因功能注釋基因結(jié)構(gòu)分析鑒定出大量新轉(zhuǎn)錄本可變剪接鑒定基因融合鑒定目前五十八頁\總數(shù)六十八頁\編于二十一點無參考基因組生物信息分析Unigene功能注釋Unigene的GO分類Unigene代謝通路分析預(yù)