分子生物學(xué)研究方法名詞解釋

名詞解釋IP（免疫沉淀、免疫印跡）：是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是用特異性抗體結(jié)合細(xì)胞裂解液中的目的蛋白，洗滌后解離特異性抗體和目的蛋白質(zhì)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），最后用Westernblot分析目的蛋白質(zhì)。這種方法可以分析溶液中的、細(xì)胞內(nèi)的、結(jié)合在細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)或者受體，但只能是定性或者半定量的實(shí)驗(yàn)。NLS（核定位序列）：核定位信號(hào)是另一種形式的信號(hào)肽,可位于多肽序列的任何部分。一般含有4～8個(gè)氨基酸,且沒有專一性,作用是幫助親核蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。可分為單一型NLS和雙分型NLS。單一型NLS，由一段連續(xù)的堿性氨基酸序列排列而成（RKKKRKV），雙分型NLS，有兩段堿性氨基酸被中間10~12GE非特異性氨基酸所分割而形成，（KRPAATKKAGQAKKKKLDK）。SUMO（smallubiquitin-relatedmodifier）：是一種小的泛素相關(guān)修飾蛋白，它與泛素在序列上雖只有18%相同，但在二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上有驚人的相似。SUMO家族成員都有獨(dú)特的N端氨基酸序列和C端外延序列。SUMO化（sumoylation）的功能與泛素化（ubiquitination）不同，它并不是蛋白降解，反而加強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或調(diào)解它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的定位和分布，甚至與凋亡相關(guān)。問答題什么是近交系小鼠，它們有什么特征？有哪些常見的近交系小鼠？答：近交系小鼠：是經(jīng)連續(xù)20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或親代與子代交配）培育而成的小鼠，品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于第20代或以后代數(shù)的一對(duì)共同祖先。特性：=1\*GB3①基因位點(diǎn)的純合性（Homozygosity）近交系小鼠中任何一個(gè)基因位點(diǎn)上純合子的概率高達(dá)99％，因而也能繁殖出完全一致的純合子后代。=2\*GB3②遺傳組成的同源性（Isogenicity）品系內(nèi)所有動(dòng)物個(gè)體都可追溯到一對(duì)共同祖先，個(gè)體在遺傳上是同源的，基因型完全一致。=3\*GB3③表型的一致性（Uniformity）由于基因型的一致，近交系個(gè)體的表型也是相同的，在實(shí)驗(yàn)中用較少的近交系動(dòng)物就可獲得具有統(tǒng)計(jì)意義的結(jié)果。=4\*GB3④對(duì)外界因素的敏感性（Sensitivity）由于近交系某些生理功能的穩(wěn)定性降低，對(duì)外界環(huán)境因素變化的反應(yīng)更為敏感，這使近交系更容易被制備成疾病模型動(dòng)物。供研究使用。=5\*GB3⑤遺傳特征的可辨性（Identifiability）每個(gè)近交系都有自己的標(biāo)準(zhǔn)遺傳概貌，選擇適當(dāng)?shù)倪z傳監(jiān)測方法，即可分辨各個(gè)近交系。=6\*GB3⑥遺傳組成的獨(dú)特性（Individuality）每個(gè)近交系都具有獨(dú)特的遺傳組成和獨(dú)特的生物學(xué)特性。由于這一特點(diǎn)，采用某近交系所作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往不直接代表整個(gè)種屬的反應(yīng)，而必須在多個(gè)近交系作動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以增加其代表性。⑦分布的廣泛性（Extensity）同一品系在不同地區(qū)不同國家都廣泛存在，引種方便并利于研究結(jié)果的交流。⑧背景資料的可查性（Accessibility）具有一份完整的研究背景資料，便于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析。國內(nèi)外常用近交系小鼠：=1\*GB3①BALB/c系：乳腺癌發(fā)病率低，與其他品系相比血壓較高，對(duì)慢性肺炎敏感，對(duì)放射線特別敏感，繁殖期長。=2\*GB3②C57BL系：毛色黑色（隱性），乳腺癌發(fā)病率低，對(duì)化學(xué)致癌劑不敏感，全身照射后淋巴瘤發(fā)病率99～100％，干擾素產(chǎn)量高。=3\*GB3③129sv系：毛色agouti棕褐色（顯性）=4\*GB3④FVB系：毛色白化=5\*GB3⑤我國培育的小鼠近交系1946年，我國從印度Haggkine研究所引入小鼠，這是當(dāng)今廣泛應(yīng)用的昆明種小鼠的原種。簡述C.elegans作為模式生物被用于研究生命科學(xué)的基本問題的優(yōu)點(diǎn)及其局限性。（10）答：優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)以德，便于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)繁殖速度快全身透明，可清楚直觀的觀察發(fā)育過程雌雄同體的生活史類型，可以產(chǎn)生大量的“自交后代”雄性個(gè)體可用于雜交（遺傳交配）加入甘油作為防凍介質(zhì)，線蟲可長期保存于—80℃/液氮中19000個(gè)基因，基因冗余少復(fù)雜程度低，但具有組織和器官的分化基因組已經(jīng)完全測序相關(guān)信息和資源豐富局限性（不足）：生物化學(xué)研究困難至今仍沒有線蟲相關(guān)的可用細(xì)胞系特殊組織解剖分析困難什么叫免疫共沉淀。（10）答：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。。其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。實(shí)驗(yàn)流程為：（1）轉(zhuǎn)染后24-48h可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min,細(xì)胞裂解液于4°C，最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清；（2）取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；（3）取10μlproteinA瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min；（4）將預(yù)處理過的10μlproteinA瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與proteinA瓊脂糖珠偶連；（5）免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3,000rpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；（6）SDS,Westernblotting或質(zhì)譜儀分析。三、簡述題1.C-elegans兩種轉(zhuǎn)基因技術(shù)？該技術(shù)可用于解決什么問題？答：兩種轉(zhuǎn)基因技術(shù)：（1）顯微注射法轉(zhuǎn)基因該方法是將外源基因或體外構(gòu)建的目的基因在顯微操作儀下用極細(xì)的微吸管直接注射到活細(xì)胞中，已經(jīng)成功的應(yīng)用于大的青蛙卵、線蟲、培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物胚胎、植物原生質(zhì)和組織。（2）粒子轟擊法轉(zhuǎn)基因（基因槍法）是物理性導(dǎo)入DNA得方法，用包裹DNA的金屬小顆粒轟擊受體組織,使DNA實(shí)現(xiàn)穿壁并被導(dǎo)入眾多細(xì)胞中,稱為“基因槍法”(或微粒轟擊技術(shù)).包裹著DNA的金屬粒加速到一個(gè)很高的速度后(通常需要部分真空以減少顆粒的速度損失)穿透受體組織,一般可以穿透2～3層細(xì)胞。解決的問題：（1）通過挽救一個(gè)突變表型（用野生型復(fù)制）來確定一個(gè)基因的功能（2）通過目的基因的報(bào)告者建立表達(dá)模式（3）借助過表達(dá)野生型基因或者突變基因來干擾生物過程（4）建立人類疾病的動(dòng)物模型（5）生產(chǎn)藥用蛋白（6）提高動(dòng)物的抗病性、培育抗病品種（7）提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能3.簡述02年諾貝爾獎(jiǎng)的研究貢獻(xiàn)。（王亞梅）答：２００２年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)分別授予了英國科學(xué)家悉尼·布雷內(nèi)、美國科學(xué)家羅伯特·霍維茨和英國科學(xué)家約翰·蘇爾斯頓，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了在器官發(fā)育和“程序性細(xì)胞死亡”過程中的基因規(guī)則。程序性細(xì)胞死亡是細(xì)胞一種生理性、主動(dòng)性的“自覺自殺行為”，這些細(xì)胞死得有規(guī)律，似乎是按編好了的“程序”進(jìn)行的，猶如秋天片片樹葉的凋落，所以這種細(xì)胞死亡又稱為“細(xì)胞凋亡”。這３位獲獎(jiǎng)?wù)叩某晒麨槠渌茖W(xué)家研究“程序性細(xì)胞死亡”提供了重要基礎(chǔ)，后來科學(xué)家又在這一領(lǐng)域取得了一系列新成績?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)，控制“程序性細(xì)胞死亡”的基因有兩類，一類是抑制細(xì)胞死亡的，另一類是啟動(dòng)或促進(jìn)細(xì)胞死亡的。兩類基因相互作用控制細(xì)胞正常死亡。如果能發(fā)現(xiàn)所有的調(diào)控基因，分析其功能，研究出能發(fā)揮或抑制這些基因功能的藥物，那么就可加速癌細(xì)胞自殺，達(dá)到治療癌癥的目的，提高免疫細(xì)胞的生命力，達(dá)到抵御艾滋病的目的。4.泛素化，哪年哪個(gè)領(lǐng)域的諾貝爾獎(jiǎng)？蛋白泛素化過程？泛素化過程中E1、E2、E3、A蛋白酶體的作用。答：２００４年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予以色列科學(xué)家阿龍·切哈諾沃、阿夫拉姆·赫什科和美國科學(xué)家歐文·羅斯，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解。泛素化是對(duì)特異的靶蛋白進(jìn)行泛素修飾的過程。一些特殊的酶將細(xì)胞內(nèi)的蛋白分類,從中選出靶蛋白分子。泛素化修飾涉及泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3的一系列反應(yīng):(1)首先在ATP供能的情況下泛素激活酶(E1)催化泛素C末端的甘氨酸(Gly),形成泛素-腺苷酸中間產(chǎn)物,激活泛素，然后激活的泛素被轉(zhuǎn)移至E1酶的Cys殘基上。(2)活化的泛素通過轉(zhuǎn)?；饔眠M(jìn)一步轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶(E2)上,形成E2-泛素巰基酯。隨后,E2酶和一些種類不同的泛素連接酶(E3)共同識(shí)別靶蛋白,對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾。(3)E2-泛素復(fù)合體接下來可以有兩種方式與要降解的底物蛋白質(zhì)結(jié)合:一是直接從E2轉(zhuǎn)移給底物蛋白質(zhì)形成泛素-蛋白質(zhì)復(fù)合體;二是底物蛋白質(zhì)首先與泛素連接酶(E3)結(jié)合,然后底物蛋白質(zhì)與E2轉(zhuǎn)移的泛素結(jié)合。E3酶的外形就像一個(gè)夾子,靶蛋白連接在中間的空隙內(nèi)。酶的左側(cè)結(jié)構(gòu)域決定靶蛋白的特異性識(shí)別,右側(cè)結(jié)構(gòu)域定位E2酶以轉(zhuǎn)移泛素分子。最終泛素-蛋白質(zhì)復(fù)合體主要是被一種沉降系數(shù)為26S的蛋白酶體所識(shí)別降解,少數(shù)被溶酶體和小泡內(nèi)的酶降解。同時(shí)由泛素C末端水解酶釋放泛素供再循環(huán)利用。E1：激活泛素E2：可特意識(shí)別泛素，并與泛素結(jié)合，同時(shí)還具有識(shí)別E3的功能。E3：特意識(shí)別靶蛋白，并將其傳遞給蛋白酶體降解。E4：泛素鏈組裝因子，結(jié)合泛素并催化E1、E2和E3的組裝，對(duì)多聚泛素鏈的延長起重要作用。蛋白酶體：有兩個(gè)亞基α亞基主要用于底物識(shí)別，β亞基主要參與底物降解。為了獲得碩士學(xué)位，你需要通過生物化學(xué)的方法研究兩種蛋白的相互作用。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來獲得蛋白復(fù)合物的化學(xué)計(jì)算(法)。（10）答：要對(duì)樣品進(jìn)行生物化學(xué)研究，首先要進(jìn)行樣品結(jié)晶獲得晶體晶體形成原理：形成規(guī)律——使熵最大化；使自由能最小化驅(qū)動(dòng)力是非共價(jià)鍵——不是在溶液中形成；化學(xué)鍵比在溶液中強(qiáng)；是均勻的；把不同的分子弄亂是一種技術(shù)但并不是科學(xué)晶體形成的步驟：形成晶核——從低聚體開始；持續(xù)形成直到平衡（固液相互交換）；太多時(shí)會(huì)形成微晶體；太少時(shí)很少或者沒有長晶體晶體生長——會(huì)有不同的時(shí)間、大小、數(shù)量和脆性長晶體的方法：蒸發(fā)擴(kuò)散（最常用）——懸滴法；坐滴法擴(kuò)散平衡——滲透；毛細(xì)現(xiàn)象：反擴(kuò)散；微流體；立方晶相自動(dòng)化——工業(yè)化規(guī)模、速度快影響晶體的因素：PH值和緩沖液類型濃度/天然沉降劑溫度和溫度波動(dòng)離子濃度：主要鹽濃度添加劑：金屬鹽、有機(jī)物和去垢劑配體、亞基、輔酶、抑制劑和促進(jìn)劑大分子的純度、穩(wěn)定和濃度大分子來源：同源物還原或一氧化環(huán)境微生物中蛋白水解FXR、FGF調(diào)控膽固醇和膽酸的代謝途徑？如何針對(duì)FGF降脂（膽固醇）。。。藥物？答：BileacidsactivateFXRtoinduceFGF15insmallintestineandSHPinliver.FGF15issecretedfromintestinetoactivateFGFR4inliver.TheFGFR4signalingpathway（FGFR4→JNK-+HNF4→Cyp7A）cooperateswithSHPtorepressCYP7Ainliver.AlthoughSHPcontributestoFGF15-mediatedrepressionofCYP7A,SHP-independentmechanismscannotberuledout.由于肝臟中Cyp7A的表達(dá)受到了抑制，從而抑制了膽酸的合成。同時(shí)，此時(shí)膽固醇水平較低，進(jìn)而進(jìn)行膽固醇的合成。隨著膽固醇水平的提高，通過LXRα受體，激活了肝臟中Cyp7a表達(dá)，從而又促進(jìn)了肝臟中膽酸的合成。降脂藥物：使用FXR受體的抑制劑，阻斷FXR的生物學(xué)功能，從而阻斷了FGF15的激活表達(dá)；或者使用FGFR4受體的抑制劑，最終均解除了FGF15對(duì)Cyp7a的抑制作用，使肝臟膽酸合成水平提高，從而降低了膽固醇水平。簡述C.elegans基因功能研究中人們所采用的幾種RNA干擾的方法，并比較它們的優(yōu)缺點(diǎn)。（10）答：（1）注射雙鏈RNA（dsRNA）優(yōu)缺點(diǎn)：可直接將dsRNA注射到蟲體生殖腺、內(nèi)臟等任何解剖部位中。由于線蟲中RNAi信號(hào)傳播效應(yīng)的存在,所以對(duì)不同的部位注射不會(huì)引起系統(tǒng)性差異。采用顯微注射對(duì)儀器和操作人員的要求都很高，操作麻煩。（2）將線蟲浸泡在含雙鏈RNA（dsRNA）的溶液中優(yōu)缺點(diǎn)：操作相對(duì)容易，但干擾效率較一般。（3）喂食E.coliHT115（表達(dá)dsRNA）優(yōu)缺點(diǎn)：操作簡單，可應(yīng)用于線蟲基因組水平的系統(tǒng)性RNA干擾。但需要對(duì)喂食的E.coli進(jìn)行基因改造，使其可以產(chǎn)生dsRNA。簡述凝膠阻抑電泳的原理及應(yīng)用。（10）答：凝膠阻抑電泳是一種研究DNA/RNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA/RNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)。其原理是DNA/蛋白質(zhì)或RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合體在聚丙烯酰凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率。當(dāng)?shù)鞍邹D(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)因子與一條人工合成的特異的末端標(biāo)記DNA或RNA探針結(jié)合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA或RNA探針，從而檢測到活化的與DNA或RNA結(jié)合的蛋白轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)因子。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中主要有結(jié)合反應(yīng)和競爭性結(jié)合反應(yīng)，更進(jìn)一步研究可以有SuperShift實(shí)驗(yàn)，即通過加入特異性的抗體來檢測特定的蛋白質(zhì)。應(yīng)用：用于定性和定量分析。最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前也廣泛應(yīng)用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，并可進(jìn)行未知蛋白的鑒定。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用基因敲出的方法研究prohibitin在肝再生中的作用（注：prohibitin在胚胎發(fā)育中是必須的）（10）Prohibitin1234567答：由于prohibitin在胚胎發(fā)育中是必須的，因此，要用基因敲除的方法研究prohibitin在肝再生中的作用，應(yīng)該選用條件性敲除的技術(shù)方法。并且該方法可以排除其它組織器官由于基因缺失對(duì)研究目的器官造成的影響。利用Cre／loxP系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)某特定基因在特定條件下的敲除，需要兩只轉(zhuǎn)基因小鼠。第一只小鼠一般采用胚胎干細(xì)胞技術(shù)獲得，首先在體外構(gòu)建一個(gè)在Prohibitin基因外顯子1之前和外顯子2之后分別含有一個(gè)loxP位點(diǎn)的基因序列，之后將體外構(gòu)建好的這段基因序列轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞內(nèi)，使其通過同源重組替代細(xì)胞基因組內(nèi)原來的基因序列。經(jīng)過這樣處理的胚胎干細(xì)胞被重新植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育成為一個(gè)完整的胚胎，最終成為一只轉(zhuǎn)基因小鼠。在這只轉(zhuǎn)基因小鼠中，loxP位點(diǎn)被引入到Prohibitin基因的內(nèi)含子內(nèi)，理論上不會(huì)對(duì)相應(yīng)基因的功能產(chǎn)生影響，因此一般情況下，該小鼠的表型是正常的。第二只轉(zhuǎn)基因小鼠一般采用卵母細(xì)胞注射或者胚胎干細(xì)胞技術(shù)獲得，在這只小鼠中，Cre重組酶被置于肝臟組織特異性基因啟動(dòng)子的調(diào)控之下，可以使其在肝臟組織中特異性表達(dá)。同時(shí)，為了避免在胚胎發(fā)育早期由于Prohibitin基因功能的異常所產(chǎn)生的副作用，可與控制Cre表達(dá)的外源性誘導(dǎo)系統(tǒng)相結(jié)合，如四環(huán)素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而可以實(shí)現(xiàn)空間與時(shí)間的雙重調(diào)控。最后，讓這兩只小鼠進(jìn)行交配，產(chǎn)生的同時(shí)含有上述兩種基因型的子代小鼠，當(dāng)小鼠完成胚胎發(fā)育后，通過對(duì)四環(huán)素水平的調(diào)控，便可以獲得肝臟中prohibitin敲除小鼠。兩種來自同一種復(fù)合物的蛋白，一個(gè)約100個(gè)氨基酸，另一個(gè)約1000個(gè)氨基酸。為了研究它們之間的相互作用，需要制備蛋白樣品。你的工作是要將兩種蛋白表達(dá)和純化。請(qǐng)你設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來表達(dá)和純化它們。對(duì)于兩種蛋白，你首要考慮的是什么？（10）答：蛋白質(zhì)樣品制備：有抽提法、人工合成法和異源表達(dá)（包括原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)）從原始的細(xì)胞、組織、器官中抽提——便宜；自然狀態(tài)下的恰當(dāng)修飾；來源有限人工合成：DNA、RNA、小分子和多肽——省時(shí)；相互作用設(shè)計(jì)；昂貴異源表達(dá)（原核載體和真核載體）——是稀有蛋白的有效獲得途徑；易于控制；耗時(shí)原核載體中蛋白表達(dá)：使用大腸桿菌或者芽孢桿菌已有的良好載體——但缺乏合適修飾若蛋白高修飾才能穩(wěn)定，則不可用原核表達(dá)系統(tǒng)真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)：酵母與絲狀真菌——真核生物類似于細(xì)菌；啤酒酵母、巴斯德畢赤酵母、裂殖酵母；一定的修飾；克隆篩選困難，低表達(dá)昆蟲/桿狀病毒——由于其安全性所以被用于商業(yè)生產(chǎn)，如：疫苗；高產(chǎn)量；更好的修飾但不同于天然構(gòu)象；耗時(shí)，費(fèi)錢；哺乳類（瞬轉(zhuǎn)、穩(wěn)轉(zhuǎn)和病毒轉(zhuǎn)染）——低可溶性；完全正確的修飾；低產(chǎn)出、省時(shí)、省錢蛋白質(zhì)和核酸純化：帶有某種標(biāo)簽：His、GST、MBP、avidin、flag液相層析——離子交換：Q瓊脂糖凝膠、SP瓊脂糖凝膠；疏水的：苯基、丁醇瓊脂糖凝膠；凝膠過濾：superdex和supharose；天然凝膠：PAGE在晶體篩選前進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定：SDSPAGEforpurity,potentialcontaminationQuantification測濃度Bufferoptimization緩沖液優(yōu)化—lowersalt低鹽—Sufficientadditivesforprotection保護(hù)劑Stability—Gelfiltration:monodispersive單分散—Dynamicormulti-anglestaticstaticlightscattering:stoichiometry動(dòng)力學(xué)和多角度計(jì)量光散射：化學(xué)計(jì)量，測分子量—Circulardichroism二向色性Activitytocheckfolding檢測折疊—Enzymationegkinase,phosphatase—Bindingegligand,DNAorRNA—Responsetostimulieglight,Ca為了繼續(xù)你的PH.D項(xiàng)目，你被要求獲得蛋白復(fù)合物中這兩種蛋白組分結(jié)構(gòu)方面的可靠資料。假設(shè)你已經(jīng)具備所有相關(guān)的儀器，請(qǐng)列舉你要選擇的方法，并說說它們的優(yōu)缺點(diǎn)。（10）答：可以用：電子晶體衍射、X-射線衍射、中子衍射X-射線衍射：優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，達(dá)到原子分辨率既可研究水溶性蛋白，也可研究膜蛋白和大分子組裝復(fù)合體能給出生物大分子的分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)型，確定活性中心的位置和結(jié)構(gòu)，從分子水平理解蛋白如何識(shí)別和結(jié)合客體分子，如何催化，如何折疊和進(jìn)化的生命基本過程，繼而闡明生命現(xiàn)象應(yīng)用于測定蛋白和核酸晶體結(jié)構(gòu)并結(jié)合分子模擬技術(shù)，為新藥設(shè)計(jì)提供了新方向缺點(diǎn)：樣品必須為晶體，但生物大分子結(jié)晶困難，切獲得的結(jié)果是結(jié)晶狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，非自然狀態(tài)向并蘇那樣的大分子組裝體，測量其精細(xì)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜電子衍射VSX-ray衍射：ElectronsscatteredbyobjectnucleuswhileX-rayinteractswithobjectelectroncloudElectronsscattered106-107strongerSensitivetoboneelectronsMuchlargerradiusofEwaldsphere(λ0.02A)Diffractionangleθ=0-20whileX-rayto180AbletofromimagesX射線晶體學(xué)——X射線與晶體相互作用電子晶體學(xué)——電子與晶體相互作用（1）X-ray法要求晶體至少20μm，而電子與物質(zhì)作用遠(yuǎn)強(qiáng)于X-ray，更適于研究微小晶體（2）X-ray是能以X射線的衍射數(shù)據(jù)來獲得晶體結(jié)構(gòu)信息；而電子晶體學(xué)不僅可以從電子衍射數(shù)據(jù)中得到警惕的結(jié)構(gòu)信息，從電鏡還可獲得結(jié)構(gòu)信息、電子來自電鏡聚焦，利用電子顯微鏡三維結(jié)構(gòu)的原理，通過有限個(gè)數(shù)的已知投影影像來近似重構(gòu)生物體三維結(jié)構(gòu)。（3）電子顯微學(xué)可以電子衍射學(xué)結(jié)合，既可拍攝電子顯微像（結(jié)構(gòu)因子相位），又可拍攝電子衍射影像（準(zhǔn)確的全部結(jié)構(gòu)因子振幅）中子衍射：采用中子束來研究化合物的結(jié)構(gòu)，與X射線衍射相比，應(yīng)用分辨率水平寬，從核反應(yīng)堆發(fā)射出的電子束是波長連續(xù)的輻射，沒有特征譜線的出現(xiàn)。因此，它既可以在原子水平上確定原子位置，作為X射線晶體學(xué)和NMR（核磁共振）方法的補(bǔ)充，又可以作為電子顯微波譜法的補(bǔ)充，在生物大分子組織水平上（~100A）用特殊的D標(biāo)記研究生物大分子復(fù)合結(jié)構(gòu)。對(duì)生物大分子產(chǎn)生射線傷害小既適用于溶液研究又適用于晶體研究，由于原子對(duì)中子輻射的吸收系數(shù)小，同時(shí)中子主要被原子核散射，核外e影響極小，散射振幅與原子系數(shù)無關(guān)，這些特點(diǎn)是中子散射有良好吸收和可比性，特別適于溶液中大分子與周圍環(huán)境作用的研究。單色電子束強(qiáng)度較弱，用于單晶結(jié)構(gòu)測定時(shí)，中子衍射VSX-ray衍射：中子衍射優(yōu)點(diǎn)：Constantscatteringpoweratallangles持續(xù)的散射能量（從各個(gè)角度）NoradiationdamageandcanbedoneatRT沒有輻射損傷，并可在常溫下進(jìn)行Veryprecisemeasurementforhydrogen對(duì)于測定H原子非常精確Noneedorstructurefactorforelectrondensitybecauseitinteractswithnuclei中子衍射缺點(diǎn)：ManyterminationerrorsinFouriermapsRequiresignificantlargecrystals(>0.1mm2ofen1-10mm3)07年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主？工作技術(shù)路線？工作意義？答：得主：瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院８日宣布，２００７年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予來自美國的馬里奧·卡佩奇、奧利弗·史密斯和來自英國的馬丁·伊文思因胚胎干細(xì)胞研究獲該獎(jiǎng)項(xiàng)。獲獎(jiǎng)是因?yàn)樗麄儭霸谏婕芭咛ジ杉?xì)胞和哺乳動(dòng)物DNA重組方面的一系列突破性發(fā)現(xiàn)”，他們“發(fā)現(xiàn)了利用胚胎干細(xì)胞對(duì)老鼠基因進(jìn)行