生物技術(shù)概論課件：5-酶工程

學(xué)習(xí)目的

初步掌握酶的發(fā)酵生產(chǎn)和分離純化的大致流程以及酶制劑的保存法。對酶的固定化、酶的修飾改造和主要的酶反應(yīng)器類型有一定的認識。了解生物傳感器及酶對現(xiàn)代人類生活的影響。5酶工程

酶工程

5酶工程

酶工程

引言

酶與酶工程酶的催化特性酶制劑的缺點酶工程的研究內(nèi)容酶是一種生物催化劑，它具有作用專一性強、催化效率高等特點，能在常溫常壓和低濃度條件下進行復(fù)雜的生化條件。酶工程的發(fā)展趨勢

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，酶工程將引起發(fā)酵工業(yè)和化學(xué)合成工業(yè)的巨大變革。21世紀酶工程的熱點和前題，可能包括基因工程和蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用，人工合成酶和模擬酶、核酸酶和抗體酶，分子酶學(xué)，酶的定向固定術(shù)，雜交酶，分子發(fā)動機，酶化學(xué)技術(shù)，非水酶學(xué)，糖生物學(xué)和糖基轉(zhuǎn)移酶，酶標藥物，端粒酶，極端環(huán)境微生物和不可培養(yǎng)微生物的新酶種，酶在環(huán)境保護方面的應(yīng)用等。

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引言細胞融合

動植物細胞細胞融合物理化學(xué)誘度野生菌株采集基因工程細胞微生物培養(yǎng)基空氣

發(fā)酵罐能量發(fā)酵液預(yù)處理

廢料酶分離純化酶制劑菌體酶提取分離

固定化酶酶的化學(xué)修飾可溶性酶吸附色埋交聯(lián)化學(xué)連

逆膠束酶酶電極

酶熱敏電阻酶反應(yīng)器產(chǎn)品回收工藝

廢料

輕工食品工業(yè)醫(yī)藥分析生物工程產(chǎn)品酶工程研究內(nèi)容

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引言

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5酶工程

5.1酶的發(fā)酵生產(chǎn)

酶的來源從動植物組織中分離提取植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

微生物作為酶生產(chǎn)來源的優(yōu)點生長繁殖快，生活周期短，產(chǎn)量高，酶比活很高；

培養(yǎng)方法簡單，原料來源豐富，經(jīng)濟效益高；微生物菌株種類繁多，酶的品種齊全；可以通過誘導(dǎo)、誘變及基因工程等方法培育出新的產(chǎn)酶量高的菌種。

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5.1酶的發(fā)酵生產(chǎn)

5.1.1優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選

優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的優(yōu)點繁殖快、產(chǎn)酶量高能在便宜的底物上生長良好產(chǎn)酶性能穩(wěn)定、菌株不易退化產(chǎn)生的酶容易分離純化

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5.1酶的發(fā)酵生產(chǎn)

產(chǎn)酶菌種的篩選方法篩選步驟產(chǎn)酶菌株的檢測胞外酶的產(chǎn)酶菌株的檢測胞內(nèi)酶的產(chǎn)酶菌株的檢測

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5.1.1優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選5.1.2基因工程菌（細胞）的構(gòu)建

構(gòu)建基因工程菌的目標改善原有酶的各種性能擴充可安全使用的酶源

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5.1酶的發(fā)酵生產(chǎn)

酶基因克隆及表達的基本步驟

能產(chǎn)生目的酶的生物

酶的純化總mRNA的純化

測定N端部分氨基酸序列mRNA

設(shè)計引物RT-PCR

與合適的載體重組、重組子篩選與鑒定

轉(zhuǎn)入工業(yè)生產(chǎn)用的宿主（工程菌或工程細胞），如米曲霉

酶的工業(yè)化生產(chǎn)

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5.1.2基因工程菌（細胞）的構(gòu)建

克隆酶基因的宿主-載體系統(tǒng)應(yīng)具備的特性所希望的酶占細胞總蛋白量的比例要高;菌體容易大規(guī)模培養(yǎng)，生長無特殊要求；載體與宿主相容，且能在宿主中穩(wěn)定維持；宿主的蛋白酶盡可能少；宿主菌對人安全，不分泌毒素。

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5.1.2基因工程菌（細胞）的構(gòu)建5.1.3微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)5.1.3.1培養(yǎng)基碳源

氮源

無機鹽類生長因子

pH值

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5.1酶的發(fā)酵生產(chǎn)

5.1.3.2酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式

固體發(fā)酵法

液體深層發(fā)酵法

溫度

通氣和攪拌

pH值

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5.1.3微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)固體發(fā)酵車間5.1.3.3提高酶產(chǎn)量的措施添加誘導(dǎo)物

酶的作用底物

酶的反應(yīng)產(chǎn)物

酶的底物類似物

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5.1.3微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)降低阻遏物濃度可采用難利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培養(yǎng)基中的碳源保持在不至于引起分解代謝物阻遏的濃度。表面活性劑

非離子型表面活性劑常被作為產(chǎn)酶促進劑，但作用機制尚不清楚。添加產(chǎn)酶促進劑

產(chǎn)酶促進劑是指那些能提高酶產(chǎn)量但是作用機制尚未闡明的物質(zhì)，它可能是酶的激活劑或者穩(wěn)定劑，也可能是產(chǎn)酶微生物的生長因子，或者是有害金屬的螯合劑。如，添加植酸鈣可使多種霉菌的蛋白酶和橘青酶（P.citrinum）的5’-磷酸二酸酯酶的產(chǎn)量提高2~20倍。

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5.1.3.3提高酶產(chǎn)量的措施

5.2酶的分離純化

提取和分離純化酶時一般應(yīng)注意的條件

溫度

pH值

鹽濃度

攪拌微生物污染

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HPLC

5.2.1酶制劑的制備破碎細胞溶劑抽提離心分離濃縮干燥

5.2酶的分離純化

高速冷凍離心機超聲波細胞破碎機高壓均質(zhì)細胞破碎機大多數(shù)酶蛋白都可用稀酸、稀堿或稀鹽溶液抽提，抽提時應(yīng)注意溶劑種類、溶劑量和溶劑pH等的選擇。工業(yè)上常采用真空薄膜濃縮法以保證酶在濃縮過程中基本不失活。酶溶液或者含水量高的酶制劑即使在低溫下也極其不穩(wěn)定，只能作短期保存。常用的干燥方法有真空干燥、冷凍干燥和噴霧干燥。5.2.2酶的純化與精制

5.2.2.1根據(jù)酶分子大小和形狀的分離方法離心分離

差速離心速率區(qū)帶離心等密度梯度離心

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5.2酶的分離純化

超速冷凍離心機根據(jù)顆粒大小和密度的不同存在的沉降速度差別，分級增加離心力，從試樣中依次分離出不同組分的方法。

速率區(qū)帶離心:將樣品置于一密度梯度介質(zhì)(如蔗糖、甘油、聚蔗糖等)頂層，該梯度最大密度低于擬分離混合物的最小密度，離心時各物質(zhì)(細胞、細胞器、分子等)按其大小、形狀和密度的不同而沉降速率各異，分別沉降在不同區(qū)帶而達到分離的方法。

等密度梯度離心原理：當不同顆粒存在浮力密度差時，在離心力場下，在密度梯度介質(zhì)中，顆?；蛳蛳鲁两?，或向上浮起，一直移動到與它們各自的密度恰好相等的位置，在這里顆粒沒有重量，不管離心多長時間，它們再也不移動了，形成一系列密度區(qū)。從而使不同浮力密度的物質(zhì)得到分離。

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5.2.2.1根據(jù)酶分子大小和形狀的分離方法凝膠過濾原理分離酶蛋白時，分子大小大于凝膠孔徑的蛋白質(zhì)被凝膠排阻，因而在凝膠顆粒間隙中移動，速度較快；小分子蛋白質(zhì)則可自由出入凝膠顆粒的小孔內(nèi)，路徑加長，移動緩慢。這樣經(jīng)過一定的長度的凝膠層析柱以后，不同大小的蛋白質(zhì)就被分開了。介質(zhì)的特性

類型工作范圍（相對分子質(zhì)量）床體積/（ml/g干膠）葡聚糖凝膠

SephadexG-10<2002～3G-15<1502.5～3.5G-251000～60004～6G-501500～300009～11G-7530000～7000012～15G-1004000～15000015～30G-1505000～40000020～30G-2005000～80000030～40

葡聚糖/雙丙烯胺凝膠

SephacrylS-2005000～250000S-30010000～1500000S-40020000～8000000

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5.2.2.1根據(jù)酶分子大小和形狀的分離方法透析與超濾

透析在純化過程中極為常用，通過透析可以除去酶液中的鹽類、有機溶劑、低分子質(zhì)量的抑制劑等。超濾是指在一定壓力（正壓/負壓）下，將料液強制通過一定孔徑的濾膜以達到分離純化的目的，也可用于酶液的濃縮及脫色等。

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5.2.2.1根據(jù)酶分子大小和形狀的分離方法5.2.2.2根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法離子交換層析

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5.2.2酶的純化與精制根據(jù)不同的蛋白質(zhì)與離子交換劑的親和力不同而達到分離目的蛋白的方法稱為離子交換層析。

-O-CH2CH2N（C2H5)2+OH--O-CH2CH2N(C2H5)2OH

-O-CH2CH2N（C2H5）2+E-COO--O-CH2CH2N(C2H5)2+OH-

OHE-COO

-O-CH2CH2N(C2H5)2+Cl--O-CH2CH2N(C2H5)2+E-COO-

E-COOCl

離子交換原理示意圖原理

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5.2.2.2根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法

蛋白質(zhì)純化過程常用的幾種離子交換劑

名稱種類解離基團交換當量陰離子交換劑DEAE-纖維素弱堿性二乙氨基乙基0.1～1.1

氨乙基纖維素弱堿性氨乙基－

DEAE-纖維素堿性稍強三乙氨基0.5～1.0DEAE-Sephacel

二乙氨基乙基1.3～1.5DEAE-Sephadex

弱堿性二乙氨基乙基3.0～4.0QAE-Sephadex

二乙氨基乙基2.6～3.4-2-羧丙基陽離子交換劑CM-纖維素弱酸性羧甲基－

CM-Sephadex

弱酸性羧甲基4～4.5

介質(zhì)特性

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5.2.2.2根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法層析聚焦層析聚焦類似于等電聚焦電泳，但其連續(xù)的pH梯度是在固相離子交換載體上形成的。它既具有等電聚焦電泳的高分辨率，又具有柱內(nèi)容量大的特點，具有較大的應(yīng)用價值。

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5.2.2.2根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法電泳由于不同蛋白質(zhì)所帶凈電荷的大小和性質(zhì)不同，在外電場作用下，其泳動方向和速率也不同，從而達到分離的目的。等電聚焦電泳它屬于移動界線電泳法。

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5.2.2.2根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法電泳儀5.2.2.3根據(jù)酶分子專一性結(jié)合的分離方法親和層析利用酶分子的專一性結(jié)合位點或特異的結(jié)構(gòu)性質(zhì)來達到分離的目的；它具有結(jié)合效率高、分離速度快的特點。

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5.2.2酶的純化與精制染料配體親和層析利用染料與酶或酶的輔基特異結(jié)合的特點，達到對酶的分離。由于染料分子與被純化的酶沒有任何生物學(xué)關(guān)系，因此嚴格地說只能被稱之為假親和層析。

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5.2.2.3根據(jù)酶分子專一性結(jié)合的分離方法共價層析利用層析介質(zhì)與被分離的酶之間形成共價鍵而達到分離的目的。

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5.2.2.3根據(jù)酶分子專一性結(jié)合的分離方法層析分離5.2.2.4根據(jù)分配系數(shù)的分離方法

雙水相萃取分離某些聚合物與一些無機鹽或另一種聚合物相混合，當濃度達到一定范圍時，體系會自動分為兩相，由于生物活性物質(zhì)在兩相中具有不同的分配比，經(jīng)過反復(fù)處理則可達到分離的目的，這種分離方法稱為雙水相萃取分離。

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5.2.2酶的純化與精制

聚合物P、Q和水系統(tǒng)的相圖示意圖

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5.2.2.4根據(jù)分配系數(shù)的分離方法

幾種常用的兩水相系統(tǒng)聚丙二醇-聚乙二醇聚丙二醇-聚乙烯醇非離子型聚合物-聚丙二醇-葡聚糖非離子型聚合物聚乙二醇-聚乙烯醇聚乙二醇-葡聚糖

聚乙二醇-聚乙烯吡咯烷酮帶電荷聚電解質(zhì)-DEAE-葡聚糖-HCl-聚丙二醇NaCl非離子型聚合物-聚乙二醇Li2SO4兩種聚電解質(zhì)羧甲基葡聚糖鈉鹽-羧甲基纖維素鈉鹽聚乙二醇-磷酸鉀聚合物-無機鹽聚乙二醇

-硫酸銨聚乙二醇

-硫酸鈉

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5.2.2.4根據(jù)分配系數(shù)的分離方法5.2.3酶的純度與酶活力

酶的純度

酶的活力酶活力（enzymeactivity）也稱為酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示，酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測定酶活力實際就是測定酶促反應(yīng)的速度。酶促反應(yīng)速度可用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在一般的酶促反應(yīng)體系中，底物往往是過量的，測定初速度時，底物減少量占總量的極少部分，不易準確檢測，而產(chǎn)物則是從無到有，只要測定方法靈敏，就可準確測定。因此一般以測定產(chǎn)物的增量來表示酶促反應(yīng)速度較為合適.

酶的比活力

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5.2酶的分離純化

比活力是以每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)。酶的純度可用酶的比活力來衡量5.2.4酶制劑的保存

溫度

緩沖液

氧化/還原

蛋白質(zhì)的濃度及純度

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5.2酶的分離純化

超低溫冰箱5月30日5.3酶分子的改造5.3.1酶分子修飾

是指通過對酶蛋白主鏈剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對酶分子進行改造，改造的目的在于改變酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造出天然酶不具備的某些優(yōu)良性狀，擴大酶的應(yīng)用以達到較高的經(jīng)濟效益。酶分子化學(xué)修飾（下頁）酶分子化學(xué)修飾的目的（下下頁）

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化學(xué)修飾主要是利用修飾劑所具有的各類化學(xué)基團的特性，直接或經(jīng)一定的活化步驟后與酶分子上的某種氨基酸殘基（一般盡可能選用非酶活必需基團）產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而改造酶分子的結(jié)構(gòu)和性能。進行化學(xué)修飾時應(yīng)注意：修飾劑的要求、酶性質(zhì)的了解、反應(yīng)條件的選擇。制備修飾酶的目的

提高酶活力改進酶的穩(wěn)定性允許酶在一個變化的環(huán)境中起作用改變最適pH值或最適溫度改變酶的特異性使它能催化不同的底物改變催化反應(yīng)類型提高催化過程的反應(yīng)效率（引自Smith，1996）

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5.3.1酶分子修飾酶分子化學(xué)修飾應(yīng)注意的事項

修飾劑的要求酶性質(zhì)的了解反應(yīng)條件的選擇酶修飾劑的類型

修飾酶的特性

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5.3.1酶分子修飾

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5.3.1酶分子修飾天然酶和修飾酶的特性比較——耐溫特性比較

酶修飾劑處理條件殘留酶活/％天然酶修飾酶

?-葡萄糖苷酶右旋糖酐60℃/40min4182

尿酸酶人血清白蛋白37℃/48h5095

尿激酶聚丙烯酰胺17℃/2d50100-丙烯酸糜蛋白酶肝素37℃/6h080（24h）糜蛋白酶聚（-乙烯75℃/117h61100

吡咯烷酮)天然酶和修飾酶的特性比較——最適pH比較

酶修飾劑天然酶修飾酶

尿酸酶（豬肝）白蛋白10.57.4~8.5

尿激酶（豬肝）聚乙二醇8.29.0

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5.3.1酶分子修飾

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5.3.1酶分子修飾天然酶和修飾酶的特性比較——其他特性比較

酶修飾劑特性天然酶修飾酶胰蛋白酶右旋糖酐抗失活因子抗自身水解抗大豆蛋白酶抑制劑抗尿素胰蛋白酶聚乙二醇抗失活因子抗大豆蛋白酶抑制劑 抗原性抗原性消除尿酸酶白蛋白抗失活因子抗胰酶 抗原性抗原性消除體內(nèi)半衰期4h20h

尿激酶白蛋白抗失活因子抗胃蛋白酶抗胎盤抑制劑 體內(nèi)半衰期

20min90min

酶蛋白質(zhì)工程的程序圖三維結(jié)構(gòu)新蛋白質(zhì)設(shè)計藍圖蛋白質(zhì)利用基因產(chǎn)物分子模型

X射線晶體衍射基因誘變克隆和表達開發(fā)5.3.2酶的蛋白質(zhì)工程（下頁）

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5.3酶分子的改造是在基因工程的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，而且仍需要應(yīng)用基因工程的全套技術(shù)。所不同的是，酶的基因工程主要解決的是酶大量生產(chǎn)的問題，而蛋白質(zhì)工程則致力于天然蛋白質(zhì)的改造，制備各種定做的蛋白質(zhì)其工作程序。酶的蛋白質(zhì)工程酶蛋白質(zhì)工程的策略分子裁減

定點突變

對隨機誘變的基因庫進行定向的篩選和選擇

雜交酶（hybridenzyme）

——利用高度同源的酶之間的雜交

——創(chuàng)造具有新活性的雜交酶

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5.3.2酶的蛋白質(zhì)工程雜交酶（又稱雜合酶，hybridenzyme）

是指利用基因工程將兩種或兩種以上的酶的結(jié)構(gòu)片段構(gòu)建成的新酶。首先，人們可以利用高度同源的酶之間的雜交，將一種酶的耐熱性、穩(wěn)定性等非催化特性“轉(zhuǎn)接”給另一種酶。這種雜交是通過相關(guān)酶同源區(qū)間殘基或結(jié)構(gòu)交換來實現(xiàn)的。其次，人們可以創(chuàng)造具有新活性的雜交酶。最便捷的途徑就是調(diào)節(jié)現(xiàn)有酶的專一性或催化活性。迄今為止，所有雜交酶大都屬于這種酶。雜交酶技術(shù)還可以用于研究酶的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。2000-2006年就有62個利用雜交酶技術(shù)改良的酶獲得了美國專利。5.3.3生物酶的人工模擬

生物酶的人工模擬模擬酶（下頁）抗體酶（abzyme）印跡酶

——分子印跡酶

——生物印跡酶

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5.3酶分子的改造

一般來說，它的研究就是吸收酶中那些起主導(dǎo)作用的因素，利用有機化學(xué)、生物化學(xué)等方法設(shè)計和合成一些比天然酶簡單的蛋白質(zhì)分子或者非蛋白質(zhì)分子，以這些分子作為模型來模擬酶對其作用底物的結(jié)構(gòu)和催化過程。抗體酶的出現(xiàn)和快速發(fā)展為生物酶的人工模擬開辟了一條新道路。模擬酶抗體酶（abzyme）是具有催化活性的抗體。產(chǎn)生抗體酶的方法有兩種：①以反應(yīng)過渡態(tài)類似物（小分子）作為半抗原，然后讓動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對半抗原的具有催化活性的抗體;②通過化學(xué)修飾、點突變及基因重組技術(shù)將催化基因直接引入抗體的結(jié)合部位。分子壓?。╩olecularimprinting）技術(shù)（1）分子印跡酶選擇底物、底物類似物、酶抑制劑、過渡態(tài)類似物以及產(chǎn)物為印記分子（模板），通過分子壓印技術(shù)可以在高聚物中產(chǎn)生類似于酶活性中心的空穴，對底物產(chǎn)生有效結(jié)合，并在結(jié)合部位的空穴內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生催化基因，并與底物定向排列。（2)生物印跡酶是指在天然的生物材料上進行壓印，從而產(chǎn)生對印跡分子具有特異性識別的空腔的過程。

分子印跡聚合物的制備流程圖

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5.3生物酶的人工模擬5.4生物催化劑的固定化

第一階段：主要是載體的開發(fā)、固定化方法的研究及其應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展第二階段：包括含輔酶系統(tǒng)或ATP、ADP和AMP系統(tǒng)的多酶反應(yīng)系統(tǒng)的構(gòu)建，

以及疏水體系或水分很低的體系的固定化酶催化反應(yīng)的研究。（目前處于此階段）近年，又發(fā)展了新技術(shù)，它是酶和細胞固定化技術(shù)發(fā)展的綜合產(chǎn)物。與普通的固定化酶或固定化細胞相比，聯(lián)合固定化生物催化劑可以充分利用酶和細胞的各自特點，把不同來源的酶和整個細胞的生物催化劑結(jié)合到一起。酶固定化的目的、固定化、共固定化、聯(lián)合固定化

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5酶工程

酶與微生物細胞聯(lián)合固定化體系的應(yīng)用聯(lián)合固定化生物催化劑微生物酶應(yīng)用領(lǐng)域參考文獻黑曲霉過氧化氫酶生產(chǎn)葡萄糖酸姜明等生物化學(xué)與生酵母纖維二糖酶生產(chǎn)乙醇物物理進展，1991，酵母胃蛋白酶葡萄汁發(fā)酵18（1）：26

釀酒酵母果膠酶葡萄汁發(fā)酵面包酵母β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)乙醇隋德新，生物科學(xué)動態(tài)，釀酒酵母β-半乳糖苷酶生產(chǎn)乙醇1988，（3）：19

酵母糖化酶啤酒釀造釀酒酵母木糖異構(gòu)酶木糖發(fā)酵大腸桿菌葡萄糖氧化酶牛奶防腐

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5.4生物催化劑的固定化

淀粉水解酶淀粉泡盛曲霉葡萄糖

02

菌體運動發(fā)酵單孢菌 菌體 乙醇

泡盛曲霉（Asp.awamori）和運動發(fā)酵單菌（Z.mobilis）聯(lián)合固定化體系代謝模式

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5.4生物催化劑的固定化

定向固定化每一個酶蛋白分子通過其一個特定的位點以可重復(fù)的方式進行固定化；蛋白質(zhì)的定向固定化技術(shù)有利于進一步研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；這種固定化技術(shù)可以借助一個與酶蛋白的酶活性無關(guān)或影響很小的氨基酸來實現(xiàn)。

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5.4生物催化劑的固定化

5.4.1酶的固定化方法酶固定化方法分類還沒有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶。特定的酶要根據(jù)具體的應(yīng)用目的選擇特定的固定化方法。已建立的固定化方法，大致可分為三類：載體結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法。

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5.4生物催化劑的固定化

酶固定化方法示意圖（引自戚以政等,1996）（1）離子結(jié)合；（2）共價結(jié)合；（3）交聯(lián)；（4）聚合物包埋；

（5）疏水相互作用；（6）脂質(zhì)體包埋；（7）微膠囊

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5.4.1酶的固定化方法

5.4.1.1載體結(jié)合法物理吸附法：是制備固定化酶最早采用的方法，它是以固體表面物理吸附為依據(jù)，使酶與水不溶性載體相接觸而達到酶吸附的目的。

離子結(jié)合法：該法是通過離子效應(yīng)，將酶分子固定到含有離子交換基團的固相載體上。

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5.4.1酶的固定化方法螯合法：這是一種比較吸引人的技術(shù)，它主要是利用螯合作用將酶直接螯合到表面含過渡金屬化合物的載體上，具有較高的操作穩(wěn)定性。共價結(jié)合法：共價結(jié)合法是通過酶分子上的官能團，與載體表面上的反應(yīng)基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成共價鍵的一種固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。

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5.4.1.1載體結(jié)合法

5.4.1.2

共價交聯(lián)法共價交聯(lián)法是通過雙功能或多功能試劑，在酶分子間或酶分子和載體間形成共價鍵的連接方法。

5.4.1.3包埋法將酶包埋在高聚物凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定方法。前者又稱為凝膠包埋法，后者則稱為微囊法。

酶工程

5.4.1酶的固定化方法5.4.2細胞的固定化方法5.4.2.1包埋法

將細胞包埋在多微孔載體內(nèi)部制備固定化細胞的方法稱包埋法，可分為凝膠包埋法、纖維包埋法和微膠囊包埋法。5.4.2.2吸附法

主要是利用細胞與載體之間的吸引力，使細胞固定在載體上。

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5.4生物催化劑的固定化

5.4.3固定化酶（細胞）的性質(zhì)

酶活力的變化

酶穩(wěn)定性提高

最適pH值的變化最適溫度的變化

動力學(xué)常數(shù)的變化

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5.4生物催化劑的固定化

5.4.4固定化酶（細胞）的指標

相對酶活力

酶的活力回收率

固定化酶的半衰期

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5.4生物催化劑的固定化

5.5酶反應(yīng)器

酶反應(yīng)器的定義

以酶為催化劑進行反應(yīng)所需要的設(shè)備稱為酶反應(yīng)器。

酶工程

5酶工程

酶反應(yīng)器的分類

按酶的狀態(tài)來分，酶反應(yīng)器有兩種類型：一類是直接應(yīng)用游離酶進行反應(yīng)的均相酶反應(yīng)器；另一類是應(yīng)用固定化酶進行反應(yīng)的非均相酶反應(yīng)器。若按其結(jié)構(gòu)和功能來分，則有許多類型。

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5.5酶反應(yīng)器

酶反應(yīng)器的類型

(引自戚以政等，1996)（1）間歇式攪拌罐；（2）連續(xù)式攪拌罐；（3）多級連續(xù)攪拌罐；（4）填充床（固定床）；（5）帶循環(huán)的固定床；（6）列管式固定床；（7）流化床；（8）攪拌罐-超濾器聯(lián)合裝置；（9）多釜串聯(lián)半連續(xù)操作；（10）環(huán)流反應(yīng)器；（11）螺旋卷式生物膜反應(yīng)器

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5.5酶反應(yīng)器

選擇反應(yīng)器型式必須綜合考慮各種因素

催化劑的形狀和大小催化劑的機械強度和比重反應(yīng)操作的要求（如pH值是否可控制）對付雜菌污染的措施反應(yīng)動力學(xué)方程的類型底物（溶液）的性質(zhì)催化劑的再生、更換的難易反應(yīng)器內(nèi)液體的塔存量與催化劑表面積之比傳質(zhì)特性反應(yīng)器制造成本和運行成本

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5.5酶反應(yīng)器5.5.1酶反應(yīng)器的基本類型

5.5.1.1攪拌罐型反應(yīng)器

帶有機械攪拌裝置的反應(yīng)罐稱攪拌罐型反應(yīng)器

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5.5酶反應(yīng)器間歇式攪拌罐連續(xù)式攪拌罐多級連續(xù)攪拌罐5.5.1.2固定床型反應(yīng)器

把催化劑填充在固定床（填充床）中的反應(yīng)器叫做固定床型反應(yīng)器。填充床（固定床）帶循環(huán)的固定床列管式固定床

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5.5.1酶反應(yīng)器的基本類型5.5.1.3流化床型反應(yīng)器

流化床型反應(yīng)器是一種裝有較小顆粒的垂直塔式反應(yīng)器。底物以一定的流速從下向上流過，使固定化酶顆粒在流體中維持懸浮狀態(tài)并進行反應(yīng)，這時的固定化顆粒和流體可以被看作是均勻混合的流體。

流化床型反應(yīng)器

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5.5.1酶反應(yīng)器的基本類型5.5.1.4膜式反應(yīng)器

膜反應(yīng)器是利用膜的分離功能，同時完成反應(yīng)和分離過程的反應(yīng)器，包括用固定化酶膜組裝的平板狀或螺旋卷型反器、轉(zhuǎn)盤反應(yīng)器和空心酶管、中空纖維膜反應(yīng)器等。螺旋卷式生物膜反應(yīng)器攪拌罐-超濾器聯(lián)合裝置

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5.5.1酶反應(yīng)器的基本類型

第二代酶反應(yīng)器的主要類型含輔因子的酶反應(yīng)器兩相或多相酶反應(yīng)器固定化多酶反應(yīng)器

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5.5.1酶反應(yīng)器的基本類型酶反應(yīng)器5.5.2酶反應(yīng)器的設(shè)計原則底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)以及溫度、壓力、pH值等操作參數(shù)對此特性的影響；反應(yīng)器的類型和反應(yīng)器內(nèi)流體的流動狀態(tài)及傳熱特性；需要的生產(chǎn)量和生產(chǎn)工藝流程。

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5.5酶反應(yīng)器

5.5.3酶反應(yīng)器的性能評價

空時：空時是指底物在反應(yīng)器中的停留時間。

轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率是指每克底物中有多少被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。

酶反應(yīng)器的生產(chǎn)強度：酶反應(yīng)器的生產(chǎn)強度是指每小時每升反應(yīng)器體積所生產(chǎn)的產(chǎn)品克數(shù)。

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5.5酶反應(yīng)器5.5.4酶反應(yīng)器的操作5.5.4.1酶反應(yīng)器的微生物污染的預(yù)防用酶反應(yīng)器制造食品和生產(chǎn)藥品時，生產(chǎn)環(huán)境通常須保持無菌，并應(yīng)在必要的衛(wèi)生條件下進行操作，因為微生物的污染不僅會堵塞反應(yīng)柱，而且它們產(chǎn)生的酶和代謝物，還會進一步使產(chǎn)物降解或產(chǎn)生令人厭惡的副產(chǎn)物，甚至能使固定化酶活性載體降解。

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5.5酶反應(yīng)器5.5.4.2酶反應(yīng)器中流動方式的控制

攪拌速度的控制

柱壓降的控制壅(yong)塞的控制

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5.5.4酶反應(yīng)器的操作酶反應(yīng)器5.5.4.3酶反應(yīng)器恒定生產(chǎn)能力的控制控制反應(yīng)器的流速提高溫度柱反應(yīng)器串聯(lián)

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5.5.4酶反應(yīng)器的操作生物反應(yīng)器生物傳感器的簡圖5.6.1生物傳感器的原理

酶工程

5酶工程

5.6生物傳感器

生物傳感器的分子識別元件

分子識別元件生物活性材料酶膜各種酶類

全細胞膜細菌、真菌、動植物細胞

組織膜動植物組織切片

細胞器膜線粒體、葉綠體等細胞器

（引自張先恩，1991）

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5.6生物傳感器

生物學(xué)反應(yīng)信息和換能器的選擇生物學(xué)信息換能器的選擇離子變化電流型或電位型的離子選擇電極、阻抗計質(zhì)子變化離子選擇電極、場效應(yīng)晶體管氣體分壓變化氣敏電極、場效應(yīng)晶體管熱效應(yīng)熱敏元件光效應(yīng)光纖、光敏管、熒光計色效應(yīng)光纖、光敏管質(zhì)量變化壓電效應(yīng)電荷密度變化阻抗計、導(dǎo)納、場效應(yīng)晶體管溶液密度變化表面等離子共振

（引自張先恩，1991）

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5.6生物傳感器

5.6.2生物傳感器的分類

5.6.2.1酶傳感器利用酶的催化作用，在常溫常壓下將糖類、醇類、有機酸、氨基酸等生物分子氧化或分解，然后通過換能器將反應(yīng)過程中化學(xué)物質(zhì)的變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栍涗浵聛?，進而推導(dǎo)出相應(yīng)的生物分子的濃度。