第二章基因工程制藥

第二章基因工程制藥

(二）第一頁(yè)，共六十二頁(yè)。1第二章基因工程制藥影響目的基因在大腸桿菌中

表達(dá)的因素

外源基因在宿主中的表達(dá)受許多因素影響的，所以在建立表達(dá)體系時(shí)要綜合考慮各種因素的作用，建立一個(gè)合適的表達(dá)體系，從而使外源基因得到最大的表達(dá)量，獲得最多的表達(dá)產(chǎn)物。第二頁(yè)，共六十二頁(yè)。2第二章基因工程制藥外源基因的拷貝數(shù)

外源基因是克隆到載體上的，所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因的表達(dá)相關(guān)，應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上，這對(duì)于提高外源基因的總體表達(dá)水平非常有利。第三頁(yè)，共六十二頁(yè)。3第二章基因工程制藥外源基因的表達(dá)效率啟動(dòng)子的強(qiáng)弱核糖體接合位點(diǎn)的有效性SD序列和起始密碼ATG的間距密碼子組成第四頁(yè)，共六十二頁(yè)。4第二章基因工程制藥表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

利用大腸桿菌的信號(hào)肽或某些真核多肽中自身的信號(hào)肽，把真核基因產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；采用位點(diǎn)特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞。

第五頁(yè)，共六十二頁(yè)。5第二章基因工程制藥細(xì)胞的代謝負(fù)荷

外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對(duì)宿主細(xì)胞有毒性。調(diào)節(jié)表達(dá)物質(zhì)的積累與細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝之間的平衡有利于外源基因的高效表達(dá)。另外通過(guò)將細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，或?qū)⑺拗骷?xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開(kāi)兩種手段也可以減輕細(xì)胞代謝的負(fù)荷。形成不溶性的包含體可以降低表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用。第六頁(yè)，共六十二頁(yè)。6第二章基因工程制藥工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達(dá)外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達(dá)。第七頁(yè)，共六十二頁(yè)。7第二章基因工程制藥真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式

三種表達(dá)形式：融合蛋白非融合蛋白分泌型。第八頁(yè)，共六十二頁(yè)。8第二章基因工程制藥融合蛋白形式表達(dá)藥物基因融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，這樣的蛋白質(zhì)是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。缺點(diǎn)：只能作抗原用。原核多肽序列可能會(huì)影響真核蛋白的免疫原性。可再切割成兩個(gè)多肽鏈。第九頁(yè)，共六十二頁(yè)。9第二章基因工程制藥非融合蛋白形式表達(dá)藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性。缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞。第十頁(yè)，共六十二頁(yè)。10第二章基因工程制藥分泌型表達(dá)藥物基因?qū)⑼庠椿蚪拥叫盘?hào)肽之后，使之在胞質(zhì)內(nèi)有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，當(dāng)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜之間的周質(zhì)后時(shí)，被信號(hào)肽酶識(shí)別切割，從而釋放出有生物活性的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基。缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高，信號(hào)肽不被切割。第十一頁(yè)，共六十二頁(yè)。11第二章基因工程制藥酵母中的基因表達(dá)載體：酵母載體是可以攜帶外源基因在在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA或RNA單位。從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最后階段在轉(zhuǎn)入酵母中。第十二頁(yè)，共六十二頁(yè)。12第二章基因工程制藥載體的復(fù)制系列

分四類(lèi)：Yep類(lèi)（yeastepisomalplasmid，酵母附加體質(zhì)粒）YRp類(lèi)（yeastreplicationplasmid，酵母復(fù)制型質(zhì)粒）YCp類(lèi)（yeastcentromericplasmid，酵母著絲粒質(zhì)粒）YIp類(lèi)（yeastintegrativeplasmid，酵母整合型質(zhì)粒）第十三頁(yè)，共六十二頁(yè)。13第二章基因工程制藥表達(dá)載體普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對(duì)其氮末端氨基酸是否有增減并無(wú)嚴(yán)格要求。精確表達(dá)載體：要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無(wú)多余的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸。第十四頁(yè)，共六十二頁(yè)。14第二章基因工程制藥影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)外源基因的表達(dá)效率外源蛋白的糖基化宿主菌株的影響

第十五頁(yè)，共六十二頁(yè)。15第二章基因工程制藥外源基因的拷貝數(shù)

拷貝數(shù)要適當(dāng)，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達(dá)，但會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)量的降低，單拷貝的質(zhì)粒載體對(duì)細(xì)胞的最大生長(zhǎng)沒(méi)有影響，能達(dá)到較高效的表達(dá)。第十六頁(yè)，共六十二頁(yè)。16第二章基因工程制藥外源基因的表達(dá)效率

要使外源基因在酵母中表達(dá)必須將外源基因克隆到酵母軍表達(dá)載體的啟動(dòng)子和終止子之間，構(gòu)成表達(dá)框架。分泌信號(hào)包括信號(hào)肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切斷表達(dá)產(chǎn)物與前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn)生正確的表達(dá)產(chǎn)物。終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止和加上多聚腺苷酸尾巴，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。第十七頁(yè)，共六十二頁(yè)。17第二章基因工程制藥外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母細(xì)胞中可發(fā)生N-糖苷鍵和O-糖苷鍵連接的兩種不同的糖基化。外源蛋白經(jīng)糖基化后可以以有效的活性型分泌到培養(yǎng)基中。某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定，便于分離精制。第十八頁(yè)，共六十二頁(yè)。18第二章基因工程制藥宿主菌株的影響

菌體生長(zhǎng)力強(qiáng)菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱菌體性能穩(wěn)定分泌能力強(qiáng)第十九頁(yè)，共六十二頁(yè)。19第二章基因工程制藥動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)

優(yōu)點(diǎn)：哺乳動(dòng)物細(xì)胞外源基因表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，使產(chǎn)物易純化?；虍a(chǎn)物糖基化接近天然產(chǎn)物。第二十頁(yè)，共六十二頁(yè)。20第二章基因工程制藥動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)缺點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)慢，生產(chǎn)率低條件刻苛，費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小表達(dá)的外源細(xì)胞均為傳代細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物是否致癌尚有疑問(wèn)第二十一頁(yè)，共六十二頁(yè)。21第二章基因工程制藥

主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危險(xiǎn)性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對(duì)原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對(duì)真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復(fù)雜天然產(chǎn)物哺乳動(dòng)物完整外分泌較難成本高簡(jiǎn)單可達(dá)天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌第二十二頁(yè)，共六十二頁(yè)。22第二章基因工程制藥五、基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過(guò)程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。分裂不穩(wěn)定：是指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象；結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。第二十三頁(yè)，共六十二頁(yè)。23第二章基因工程制藥質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因

常見(jiàn)的是分裂不穩(wěn)定，與兩個(gè)因素有關(guān)：含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；這兩種菌的比生長(zhǎng)速率差異的大小。第二十四頁(yè)，共六十二頁(yè)。24第二章基因工程制藥質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因

對(duì)同一工程菌控制不同的比生長(zhǎng)數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高如增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性；高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低但對(duì)穩(wěn)定性不利。

第二十五頁(yè)，共六十二頁(yè)。25第二章基因工程制藥質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法

樣品不含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)10～12h隨機(jī)挑選100個(gè)菌落含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基接種統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的菌落數(shù)培養(yǎng)10～12h計(jì)算比值重復(fù)三次第二十六頁(yè)，共六十二頁(yè)。26第二章基因工程制藥提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法

為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法：先使菌體生長(zhǎng)至一定密度再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)第二十七頁(yè)，共六十二頁(yè)。27第二章基因工程制藥提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。在培養(yǎng)基中加入抗菌素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度。第二十八頁(yè)，共六十二頁(yè)。28第二章基因工程制藥提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法有些含質(zhì)粒菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長(zhǎng)速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過(guò)間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。第二十九頁(yè)，共六十二頁(yè)。29第二章基因工程制藥六、基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)菌體的生長(zhǎng)通常用比生長(zhǎng)速率來(lái)表示。工程菌培養(yǎng)可通過(guò)選用不同的碳源控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)?？刂凭w的生長(zhǎng)對(duì)提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。

第三十頁(yè)，共六十二頁(yè)。30第二章基因工程制藥基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長(zhǎng)速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變，都會(huì)改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的和成和菌體的生長(zhǎng)。第三十一頁(yè)，共六十二頁(yè)。31第二章基因工程制藥菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長(zhǎng)所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長(zhǎng)。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用。第三十二頁(yè)，共六十二頁(yè)。32第二章基因工程制藥菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長(zhǎng)，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。第三十三頁(yè)，共六十二頁(yè)。33第二章基因工程制藥菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長(zhǎng)速率。采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷?xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。

第三十四頁(yè)，共六十二頁(yè)。34第二章基因工程制藥菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸能使菌體比生長(zhǎng)速率提高，使蛋白質(zhì)合成增加。由于菌體中小分子前體量和催化結(jié)構(gòu)是有限的，因而生物大分子的合成處于亞飽和狀態(tài)，基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，限制了菌體的比生長(zhǎng)速率第三十五頁(yè)，共六十二頁(yè)。35第二章基因工程制藥質(zhì)粒存在對(duì)菌體代謝的影響同樣培養(yǎng)基當(dāng)中，工程菌的比生長(zhǎng)速率低于其宿主細(xì)胞。中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長(zhǎng)速率和菌體總蛋白合成均減少。

第三十六頁(yè)，共六十二頁(yè)。36第二章基因工程制藥七、基因工程菌發(fā)酵

基因工程菌的培養(yǎng)過(guò)程包括:通過(guò)搖瓶操作基因工程菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氧比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對(duì)受體細(xì)胞的影響;通過(guò)培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。第三十七頁(yè)，共六十二頁(yè)。37第二章基因工程制藥微生物工業(yè)發(fā)酵過(guò)程圖解

菌種原種一級(jí)種子搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基配制二級(jí)種子罐培養(yǎng)滅菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物分離第三十八頁(yè)，共六十二頁(yè)。38第二章基因工程制藥基因工程菌的培養(yǎng)方式

補(bǔ)料分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)透析培養(yǎng)固定化培養(yǎng)

第三十九頁(yè)，共六十二頁(yè)。39第二章基因工程制藥補(bǔ)料分批培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器中后，培養(yǎng)一段時(shí)間，然后間歇或連續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)。為保持基因工程菌生長(zhǎng)所需的良好環(huán)境，延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和補(bǔ)料措施結(jié)合起來(lái)，根據(jù)生長(zhǎng)規(guī)律來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率。第四十頁(yè)，共六十二頁(yè)。40第二章基因工程制藥連續(xù)培養(yǎng)

將種子接入反應(yīng)器后，培養(yǎng)一段時(shí)間，到一定菌濃，開(kāi)動(dòng)蠕動(dòng)泵，同時(shí)進(jìn)料和出料，控制一定稀釋速率。由于基因工程菌不穩(wěn)定，可將生長(zhǎng)階段和基因表達(dá)階段分開(kāi)，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率、細(xì)胞比生長(zhǎng)速率。第四十一頁(yè)，共六十二頁(yè)。41第二章基因工程制藥透析培養(yǎng)

利用膜的半透性使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離。通過(guò)去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來(lái)解除其對(duì)生產(chǎn)菌的不利影響第四十二頁(yè)，共六十二頁(yè)。42第二章基因工程制藥固定化培養(yǎng)

基因工程菌固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高。便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對(duì)于分泌型菌更為有利。

第四十三頁(yè)，共六十二頁(yè)。43第二章基因工程制藥基因工程菌的發(fā)酵工藝

基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同,基因工程菌帶外源基因,發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達(dá)。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化第四十四頁(yè)，共六十二頁(yè)。44第二章基因工程制藥對(duì)發(fā)酵影響較大的幾個(gè)因素培養(yǎng)基接種量溫度溶解氧誘導(dǎo)時(shí)機(jī)pH第四十五頁(yè)，共六十二頁(yè)。45第二章基因工程制藥培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長(zhǎng)速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、硫酸銨、氯化銨等。還有無(wú)機(jī)鹽、維生素等。第四十六頁(yè)，共六十二頁(yè)。46第二章基因工程制藥培養(yǎng)基的影響不同的碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)和外源基因表達(dá)有較大的影響。使用葡萄糖和甘油對(duì)菌體比生長(zhǎng)速率及呼吸強(qiáng)度相差不大。但使用甘油菌體得率較大，而使用葡萄糖菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)品較多。葡萄糖對(duì)lac啟動(dòng)子有阻遏作用。乳糖對(duì)lac啟動(dòng)子有利。第四十七頁(yè)，共六十二頁(yè)。47第二章基因工程制藥培養(yǎng)基的影響在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨酸對(duì)trp啟動(dòng)子控制的基因有影響。無(wú)機(jī)磷在許多代謝反應(yīng)中是一個(gè)效應(yīng)因子，磷濃度不同，影響菌體生長(zhǎng)。第四十八頁(yè)，共六十二頁(yè)。48第二章基因工程制藥接種量的影響接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。量小，延長(zhǎng)菌體延遲期，不利于外源基因的表達(dá)。量大，有利于對(duì)基質(zhì)的利用，可以縮短生長(zhǎng)延遲期，并使產(chǎn)生菌能迅速占領(lǐng)整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，減少污染機(jī)會(huì)但會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)快，代謝產(chǎn)物累積過(guò)多，反而會(huì)抑制后期菌體的生長(zhǎng)。第四十九頁(yè)，共六十二頁(yè)。49第二章基因工程制藥溫度的影響

溫毒對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成等水平上。溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響是多方面的。影響各種酶的反應(yīng)速度。改變菌體代謝產(chǎn)物的反應(yīng)方向。影響代謝調(diào)控機(jī)制。第五十頁(yè)，共六十二頁(yè)。50第二章基因工程制藥溫度的影響適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長(zhǎng)，又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。高溫或低溫都會(huì)使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導(dǎo)致減產(chǎn)。溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。

第五十一頁(yè)，共六十二頁(yè)。51第二章基因工程制藥溶解氧的影響對(duì)于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參數(shù)。好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進(jìn)行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)酵產(chǎn)率。第五十二頁(yè)，共六十二頁(yè)。52第二章基因工程制藥溶解氧的影響菌體在大量擴(kuò)增過(guò)程中，進(jìn)行耗氧的氧化分解代謝。外源基因的高效表達(dá)需要大量的能量，促進(jìn)細(xì)胞的呼吸作用，提高對(duì)氧的需求。采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法可以改善培養(yǎng)過(guò)程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。第五十三頁(yè)，共六十二頁(yè)。53第二章基因工程制藥誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)期后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞快速繁殖，直到細(xì)胞密度達(dá)到109個(gè)每毫升為止。這時(shí)菌群數(shù)目倍增，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧的需求量急增，營(yíng)養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。第五十四頁(yè)，共六十二頁(yè)。54第二章基因工程制藥pH的影響pH對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響。應(yīng)根據(jù)工程菌的生長(zhǎng)和代謝情況，對(duì)pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。第五十五頁(yè)，共六十二頁(yè)。55第二章基因工程制藥pH的影響如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長(zhǎng)條件，其最佳pH在6.8～7.4左右;培養(yǎng)后期重點(diǎn)是優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件,其最佳pH為6.0～6.5。第五十六頁(yè)，共六十