酶工程緒論學(xué)習(xí)課件

第一章緒論主要內(nèi)容第一節(jié)酶的基本概念與發(fā)展歷史第二節(jié)酶催化作用的特點(diǎn)第三節(jié)影響酶催化作用的因素第四節(jié)酶的分類與命名第五節(jié)酶的活力測(cè)定第六節(jié)酶的生產(chǎn)方法第七節(jié)酶工程發(fā)展概況生物技術(shù)的四大支柱基因工程：用“剪刀+糨糊”創(chuàng)造新物種的工程。細(xì)胞工程：微觀水平的嫁接技術(shù)。酶工程：讓工廠高效、安靜、美麗如畫的工程。發(fā)酵工程：把微生物或細(xì)胞造就成無數(shù)微型工廠，將神話變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)的橋梁。酶工程概述酶的概念：酶是具有生物催化功能的生物大分子。酶的分類：蛋白類酶（proteozyme,protein

enzyme,P酶）核酸類酶（robozyme,RNA

enzyme,R酶）酶工程：酶的生產(chǎn)、改性與應(yīng)用的技術(shù)過程。酶工程的主要任務(wù)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，通過人工操作獲得人們所需的酶，并通過各種方法使酶的特性得以改進(jìn)，充分發(fā)揮其催化功能。第一節(jié)酶的基本概念與發(fā)展歷史人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)起源于生產(chǎn)與生活實(shí)踐：夏禹時(shí)代，人們掌握了釀酒技術(shù)。公元前12世紀(jì)周朝，人們就會(huì)制作飴糖和醬。春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期已知用麴(曲)治療消化不良的疾病。酶者，酒母也第一節(jié)酶的基本概念與發(fā)展歷史酶的存在及作用的認(rèn)識(shí)：1833年：發(fā)現(xiàn)淀粉酶19世紀(jì)中葉：糖發(fā)酵產(chǎn)酒與活酵母有關(guān)1878年：給酶一個(gè)統(tǒng)一的名詞，叫Enzyme，這個(gè)字來自希臘文，其意思是“在酵母中”。1897年，德國(guó)巴克納Buchner兄弟發(fā)現(xiàn)不含細(xì)胞的酵母提取液也能使糖發(fā)酵，說明發(fā)酵與細(xì)胞的活動(dòng)無關(guān)，從而說明了發(fā)酵是酶作用的化學(xué)本質(zhì)，為此Buchner獲得了1907年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第一節(jié)酶的基本概念與發(fā)展歷史對(duì)酶的作用機(jī)理及酶的本質(zhì)的深入研究：1902年，提出酶催化過程的中間產(chǎn)物學(xué)說1913年，根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說推導(dǎo)出酶促反應(yīng)的的基本動(dòng)力學(xué)方程——米氏方程。1930年，證實(shí)酶是一種蛋白質(zhì)；80年代初發(fā)現(xiàn)了具有催化功能的RNA——核酶(ribozyme)，這一發(fā)現(xiàn)打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念，開辟了酶學(xué)研究的新領(lǐng)域1989年，因核酶的發(fā)現(xiàn)，切克和阿爾特曼共同獲得1989年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?，F(xiàn)已鑒定出4000多種酶，數(shù)百種酶已得到結(jié)晶，而且每年都有新酶被發(fā)現(xiàn)。第二節(jié)酶催化作用的特點(diǎn)一、酶催化作用的專一性強(qiáng)專一性：指在一定的條件下，一種酶只能催化一種或一類結(jié)構(gòu)相似的底物，進(jìn)行某種類型反應(yīng)的特性。專一性絕對(duì)專一性相對(duì)專一性基團(tuán)專一性鍵的專一性1、絕對(duì)專一性絕對(duì)專一性概念：一種酶只能催化一種底物進(jìn)行一種反應(yīng)。包括立體異構(gòu)專一性。如：蔗糖酶、麥芽糖酶。立體異構(gòu)專一性：當(dāng)作用的底物含有不對(duì)稱碳原子時(shí)，酶只能作用于異構(gòu)體的一種。如：乳酸脫氫酶。核酸類酶也具有絕對(duì)專一性。1、絕對(duì)專一性2、相對(duì)專一性相對(duì)專一性概念：一種酶能夠催化一類結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)進(jìn)行某種相同類型的反應(yīng)。（1）基團(tuán)專一性要求底物含有某一相同的基團(tuán)。如：胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶，能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。（2）鍵專一性要求底物具有相同化學(xué)鍵。如：酯酶，可催化含酯鍵的酯類物質(zhì)水解生成醇和酸。思考：酶為什么具有催化專一性？二、酶催化作用的效率高與非酶促反應(yīng)相比：是其107~1013倍。非酶促：100℃，3×10－10/s在脲酶作用下：20.8℃，3×104/s與其它催化劑相比此反應(yīng)在過氧化氫酶的作用下，比在Fe2＋的作用下，反應(yīng)速度常數(shù)將近快9個(gè)數(shù)量級(jí)。思考：酶的催化為什么具有高效性？三、酶催化作用的條件溫和酶催化反應(yīng)的一般條件：常溫，常壓，近中性的pH值環(huán)境。一般非酶催化反應(yīng)條件：高溫、高壓和pH極端原因：酶促反應(yīng)所需活化能低酶是具有生物催化功能的生物大分子。第三節(jié)影響酶催化作用的因素一、底物濃度的影響底物濃度與酶催化反應(yīng)速度之間的關(guān)系：第三節(jié)影響酶催化作用的因素二、酶濃度的影響酶催化反應(yīng)速度與酶濃度成正比。三、溫度的影響在某一特定的溫度條件下，酶催化速度達(dá)到最大，超過最適溫度，反應(yīng)速度逐步降低。四、pH的影響每一種酶都有其各自最適pH范圍和最適pH。五、抑制劑的影響第三節(jié)影響酶催化作用的因素五、抑制劑的影響可逆抑制劑不可逆抑制劑競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑六、激活劑的影響激活劑：金屬離子、無機(jī)負(fù)離子、蛋白酶等。第四節(jié)酶的分類與命名按照分子中起催化作用的主要組分的不同，酶可以分為蛋白類酶（P酶）和核酸類酶（R酶）。命名總原則：根據(jù)酶作用的底物和催化反應(yīng)的類型進(jìn)行分類和命名。兩類酶的命名差別：蛋白類酶只能催化其他分子進(jìn)行反應(yīng)，而核酸類酶既可以催化酶分子本身也可以催化其他分子進(jìn)行反應(yīng)。第四節(jié)酶的分類與命名蛋白類酶的種類：氧化還原酶類 Oxidoreductases轉(zhuǎn)移酶類 Transgerases水解酶類 Hydrolases裂合酶類 Lyases異構(gòu)酶類 Isomerases合成酶類 Synthetases

或連接酶ligases注意：順序不要搞錯(cuò)！第四節(jié)酶的分類與命名核酸類酶的種類：分子內(nèi)催化R酶：自我剪切酶自我剪接酶分子間催化R酶：RNA剪切酶DNA剪切酶多肽剪切酶多糖剪接酶氨基酸酯剪切酶多功能酶一、蛋白類酶（P酶）的分類與命名酶的命名有兩種方法：系統(tǒng)名、推薦名（慣用名）。推薦名推薦名通式：底物的名稱＋催化反應(yīng)的類型＋“酶”字說明：1、對(duì)于水解酶類，在命名時(shí)可省去說明反應(yīng)類型的“水解”字樣。如：淀粉酶（省略“水解”二字）。2、底物只取一個(gè)較重要的底物名稱。如：葡萄糖氧化酶（省略底物“氧”）。一、蛋白類酶（P酶）的分類與命名系統(tǒng)名通式：酶作用底物＋酶作用基團(tuán)＋催化反應(yīng)類型＋“酶”字舉例β－D－葡萄糖:氧1－氧化還原酶酶的命名有兩種方法：系統(tǒng)名、慣用名。系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱和反應(yīng)類型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化還原酶慣用名：只取一個(gè)較重要的底物名稱和反應(yīng)類型。乳酸：NAD+氧化還原酶乳酸脫氫酶對(duì)于催化水解反應(yīng)的酶一般在酶的名稱上省去反應(yīng)類型。一、蛋白類酶（P酶）的分類與命名蛋白類酶（P酶）的分類原則如下：（1）按照酶催化作用的類型，將蛋白類酶分為六大類。（2）每個(gè)大類中，按照酶作用的底物、化學(xué)鍵或基團(tuán)的不同，分為若干亞類。（3）每一亞類再分為若干小類。（4）每一個(gè)小類中包括若干個(gè)具體的酶。一、蛋白類酶（P酶）的分類與命名系統(tǒng)編號(hào)：四碼編號(hào)方法，根據(jù)分類原則進(jìn)行，格式：E.C.X.X.X.X如：乳酸脫氫酶EC1.1.1.27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞類中的流水編號(hào)氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。(1)氧化還原酶Oxidoreductase轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。

例如，谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。(2)轉(zhuǎn)移酶Transferase水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：(3)水解酶hydrolase裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。(4)裂合酶Lyase異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。

例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。(5)異構(gòu)酶Isomerase合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。丙酮酸+CO2草酰乙酸(6)合成酶LigaseorSynthetase核酸類酶（R酶）的分類自1982年以來，被發(fā)現(xiàn)的核酸類酶越來越多，對(duì)它的研究越來越廣泛和深入。但是對(duì)于分類和命名還沒有統(tǒng)一的原則和規(guī)定。根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型，可以將R酶分為剪切酶，剪接酶，和多功能酶等三類。根據(jù)R酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，可分為錘頭型R酶，發(fā)夾型R酶，含I型IVS的R酶，含II型IVS的R酶等。根據(jù)酶催化的底物是其本身RNA分子還是其它分子，可以將R酶分為分子內(nèi)催化（incis，也稱為自我催化）和分子間催化（intrans）兩類。第五節(jié)酶的活力測(cè)定測(cè)定酶的活力，往往是為了確定酶量的多少及其變化情況。酶活力：是指在一定條件下，酶所催化的反應(yīng)速度。酶催化反應(yīng)速度通常用單位時(shí)間（t）內(nèi)底物（S）的減少量或產(chǎn)物（P）的增加量表示。即：

dSdPu=-----=-----

dtdt一、酶活力測(cè)定方法一、酶活力測(cè)定的兩個(gè)階段①在一定條件下，酶與某作用底物反應(yīng)一段時(shí)間；②用各種方法檢測(cè)反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物的變化量。酶活力測(cè)定的一般步驟A：根據(jù)酶的專一性，選擇適宜的底物，并配成一定濃度的底物溶液。B：確定反應(yīng)的溫度、pH值等條件。C：在一定條件下，將酶液與底物混勻，選擇適宜的反應(yīng)時(shí)間，使底物轉(zhuǎn)化率≥10％，保證為初速度反應(yīng)。D：終止反應(yīng)E：采用光學(xué)檢測(cè)法、化學(xué)檢測(cè)法等生化監(jiān)測(cè)技術(shù)，測(cè)定反應(yīng)液中物質(zhì)的變化量。終止酶反應(yīng)的常用方法沸水浴加入酶變性劑：如三氯乙酸等加入酸或堿溶液迅速降溫測(cè)定反應(yīng)液中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量的方法技術(shù)化學(xué)檢測(cè)法：如用化學(xué)滴定法測(cè)定糖化酶水解淀粉生成的葡萄糖的量。分光光度法：如用分光光度計(jì)測(cè)定堿性磷酸酶水解硝基酚磷酸生成的對(duì)硝基酚的量。氣體檢測(cè)法：如用華勃士呼吸儀測(cè)定二氧化碳的生成量等。一種酶可以有多種測(cè)定方法，要根據(jù)實(shí)際情況選用。二、酶活力單位酶活力的高低，是以酶活力的單位數(shù)來表示的。1961年國(guó)際生化學(xué)會(huì)（IUB）酶學(xué)委員會(huì)建議使用統(tǒng)一的國(guó)際單位。酶活力的國(guó)際單位定義：在實(shí)驗(yàn)室規(guī)定的條件下，每1min催化lumol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)酶活力國(guó)際單位(用“IU”表示，簡(jiǎn)寫為U)。1.從習(xí)慣單位換算成國(guó)際單位比較麻煩。2.很多底物分子量不明（如淀粉酶），難以執(zhí)行。3.各國(guó)的測(cè)定溫度不同，結(jié)果也不盡相同。因此，目前國(guó)內(nèi)外仍多用習(xí)慣單位。二、酶活力單位國(guó)際上另一個(gè)常用的酶活力單位是卡特（kat）。在特定條件下，每秒催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1卡特（kat）。兩種酶活力單位之間可以互相換算，即：1cat=1mol/s=60mol/min=60×106μmol/min=6×107IU二、酶活力單位為了比較酶制劑的純度和活力的高低，常使用比活力這個(gè)概念。酶的比活力：是酶純度的一個(gè)指標(biāo)，是指在特定的條件下，單位質(zhì)量（mg）蛋白質(zhì)或RNA所具有的酶活力單位數(shù)。酶比活力=酶活力（單位）/mg（蛋白質(zhì)或RNA）三、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)與催化周期酶的轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat，又稱摩爾催化活性，是指每個(gè)酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的分子數(shù)。即每摩爾酶每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的摩爾數(shù)，是酶催化效率的一個(gè)指標(biāo)。轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)稱為酶的催化周期。催化周期是指酶進(jìn)行一次催化所需的時(shí)間。四、固定化酶的活力測(cè)定固定化酶：與水不溶性載體結(jié)合、在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用的酶稱為固定化酶。四、固定化酶的活力測(cè)定1、振蕩測(cè)定法在特定條件下，一邊振蕩或攪拌，一邊進(jìn)行催化反應(yīng)。注意：振蕩或攪拌的方式和速度對(duì)反應(yīng)速度有影響。底物濃度、pH、反應(yīng)溫度、激活劑濃度、抑制劑濃度、反應(yīng)時(shí)間等測(cè)定條件最好在固定化酶應(yīng)用的工藝條件下進(jìn)行活力測(cè)定。四、固定化酶的活力測(cè)定2、酶柱測(cè)定法將一定量的固定化酶裝進(jìn)具有恒溫裝置的反應(yīng)柱中，讓條件適宜的底物溶液，以一定的速率流過酶柱，收集流出的反應(yīng)液。注意：反應(yīng)液經(jīng)酶柱的流速對(duì)反應(yīng)速度有很大影響；此外，酶柱的形狀、徑高比對(duì)反應(yīng)速度也有明顯影響。底物濃度、pH、反應(yīng)溫度、激活劑濃度、抑制劑濃度、反應(yīng)時(shí)間等測(cè)定條件最好在固定化酶應(yīng)用的工藝條件下進(jìn)行活力測(cè)定。四、固定化酶的活力測(cè)定3、連續(xù)測(cè)定法測(cè)定時(shí)，將振蕩反應(yīng)器中的反應(yīng)液用泵連續(xù)引到連續(xù)測(cè)定儀的流動(dòng)比色杯中進(jìn)行連續(xù)分光測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確了解某一時(shí)刻的酶活力變化情況。對(duì)利用固定化酶進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)和自動(dòng)控制有重大意義。四、固定化酶的活力測(cè)定4、固定化酶的比活力測(cè)定每克（g）干固定化酶所具有的酶活力單位數(shù)。方法1：稱取干固定化酶，充分溶脹后→測(cè)比活力。方法2：對(duì)濕固定化酶測(cè)出酶活力之后→干燥→稱重→測(cè)比活力酶膜、酶管、酶板等：用單位面積的酶活力單位表示，即：比活力=酶活力單位/cm2四、固定化酶的活力測(cè)定5、酶結(jié)合效率與酶活力回收率的測(cè)定酶結(jié)合效率（固定化率）：一般由加入的總酶活力減去未結(jié)合的酶活力的產(chǎn)值與加入的總酶活力的百分比來表示。酶活力回收率：指固定化酶的總活力與用于固定化的酶總活力的百分比。酶結(jié)合效率＝加入的總酶活力－未結(jié)合酶活力加入的總酶活力×100％酶回收率＝固定化酶的總活力用于固定化的酶總活力×100％四、固定化酶的活力測(cè)定6、相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白（或酶RNA）量的固定化酶活力和游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力。相對(duì)酶活力與載體結(jié)構(gòu)、固定化酶顆粒大小、底物相對(duì)分子質(zhì)量的大小以及酶結(jié)合效率等有密切關(guān)系。相對(duì)酶活力的高低，表明了固定化酶應(yīng)用價(jià)值的大小。第六節(jié)酶的生產(chǎn)方法酶的生產(chǎn)：是指通過人工操作而獲得所需酶的技術(shù)過程。酶的生產(chǎn)方法可以分為：提取分離法生物合成法化學(xué)合成法一、提取分離法提取分離法：是采用各種提取、分離、純化技術(shù)從動(dòng)物、植物的組織、器官、細(xì)胞或微生物細(xì)胞中將酶分離提取出來，再進(jìn)行分離純化的技術(shù)過程。酶的提?。菏侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程。主要的提取方法有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機(jī)溶劑提取等。酶的分離純化：采用各種生化分離技術(shù)，使酶與各種雜質(zhì)分離，達(dá)到所需的純度，以滿足使用的要求。一、提取分離法優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備較簡(jiǎn)單，操作較方便。不足：生物資源獲取較難是酶學(xué)研究必不可缺的重要手段。二、生物合成法生物合成法：利用微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞的生命活動(dòng)而獲得人們所需酶的技術(shù)過程。包括：微生物發(fā)酵產(chǎn)酶——即發(fā)酵法植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶二、生物合成法優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)周期較短，酶的產(chǎn)率較高，不受生物資源、地理環(huán)境和氣候條件等的影響的顯著特點(diǎn)。不足：對(duì)發(fā)酵設(shè)備和工藝條件的要求較高，在生產(chǎn)過程中必須進(jìn)行嚴(yán)格的控制。三、化學(xué)合成法1965年，我國(guó)人工合成胰島素，開辟了蛋白質(zhì)化學(xué)合成的新紀(jì)元。1969年。美國(guó)首次用化學(xué)合成法得到含124個(gè)氨基酸的核糖核酸酶。目前，可用肽合成儀進(jìn)行酶的化學(xué)合成。第七節(jié)酶工程發(fā)展概況酶工程的概念：酶的生產(chǎn)、改性與應(yīng)用的技術(shù)過程稱為酶工程。酶的生產(chǎn)：微生物發(fā)酵產(chǎn)酶、動(dòng)植物培養(yǎng)產(chǎn)酶、酶的提取和分離純化酶的改性：酶分子修飾、酶固定化、酶非水相催化和酶的定向進(jìn)化酶的應(yīng)用：通過酶的催化作用獲得人們所需的酶，并通過各種方法使酶的催化特性得以改進(jìn)，充分發(fā)揮其催化功能。酶工程的內(nèi)容微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶，動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶，酶的提取與分離純化，酶分子的修飾，酶、細(xì)胞