多糖的分離純化

關(guān)于多糖的分離純化第1頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月第2頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月研究背景實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果總結(jié)與展望目錄第3頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月研究背景1第4頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月莼菜睡蓮科，多年生水生草本植物，又名馬蹄草，有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、降血脂等功效，含酸性多糖、多酚、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、組胺及微量元素，多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于葉底部、莖周圍的黏液質(zhì)中，是莼菜發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。第5頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月方法流程采用堿提醇沉工藝，經(jīng)除蛋白、除色素得到莼菜多糖(BSP)再經(jīng)DEAE纖維素DE-52柱SepharoseCL-6B瓊脂糖凝膠柱對(duì)BSP進(jìn)行分級(jí)精制采用高效凝膠過濾色譜(HPGFC)測(cè)定BSP各組分的分子量第6頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月儀器與材料Agilent1200HPLC色譜儀AE240分析天平UV-2102PC紫外可見分光光度計(jì)FD-1C-55凍干機(jī)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀超濾儀DZG-6020減壓干燥箱莼菜嫩葉；無水乙醇；NaOH；鹽酸；木瓜蛋白酶；聚酰胺樹脂；DEAE纖維素DE-52；瓊脂糖凝膠SepharoseCL-6B；透析袋；蒽酮、硫酸；純化水第7頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月粗多糖的提取莼菜粗多糖

加40倍0.3mol/LNaOH溶液，70℃加熱攪拌提取2h，加鹽酸中和，過濾，濾液濃縮，加入無水乙醇至67%，4℃靜置過夜，4500r/min離心20min，80%乙醇洗滌3次，沉淀減壓干燥，得83g莼菜粗多糖。除去脂溶性成分

取250g莼菜噴干粉，加無水乙醇2.5L，60℃旋轉(zhuǎn)回流提取2h，過濾，重復(fù)操作1次，除去脂溶性成分，濾渣烘干。莼菜噴干粉

新鮮莼菜嫩葉，經(jīng)清水淋洗、均漿機(jī)剪切、噴霧干燥得莼菜噴干粉。第8頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月粗多糖純化01020304酶解滅活脫蛋白粗多糖用2.5L純化水復(fù)溶，加入木瓜蛋白酶，63℃酶解6h，滅活過濾除去不溶物，濾液進(jìn)行第2次酶解滅活脫蛋白。聚酰胺層析濾液流經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺層析柱脫色，濾液與聚酰胺濕填料的體積之比為1∶1，純化水洗脫，共收集洗脫液8L。濾膜過濾濃縮再用微孔濾膜過濾，濾液用超濾膜超濾濃縮至800mL后加入無水乙醇至67%，4℃靜置過夜后離心，80%乙醇洗滌3次，減壓干燥。得到BSP

獲得灰白色膠狀莼菜多糖(BSP)22g，收率為8.8%。第9頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月BSP含有量測(cè)定010203葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作BSP純度測(cè)定精密稱取干燥至恒重的BSP24.72mg至500mL量瓶，純化水溶解并定容，搖勻，測(cè)定樣品吸光度為0.521，計(jì)算可知BSP的純度為61.89%。

紫外檢測(cè)粗多糖經(jīng)木瓜蛋白酶脫蛋白、聚酰胺脫色素等處理后，紫外全波長掃描顯示在260、280nm處其吸光度接近于零，表明已除去蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)。利用蒽酮硫酸法：以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)得曲線方程A=17.294X－0.0076(Ｒ2=0.9994)。第10頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月BSP精制取10gBSP，200mL純化水充分溶解后過DEDA纖維素DE-52離子交換柱(60mm×950mm)，依次用0～1.0mol/LNaCl溶液梯度洗脫，分管收集洗脫液，采用“2.2”項(xiàng)下方法，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，多糖濃度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。BSP經(jīng)DEAE纖維素DE-52分離后，可得3個(gè)峰(圖1)，透析(截留分子量8000～14000)、濃縮、凍干各峰組分，得到BSP-1、BSP-2、BSP-3。第11頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月BSP精制對(duì)2個(gè)主要組分BSP-1、BSP-3用瓊脂糖凝膠柱SepharoseCL-6B進(jìn)一步的分離純化，用純化水洗脫，蒽酮-硫酸顯色法測(cè)定多糖含有量。洗脫曲線(圖2)表明，莼菜精制多糖BSP-1、BSP-3組分均一，分別濃縮、凍干。第12頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月分子量測(cè)定

色譜條件:色譜柱TSKgelG5000PWxl(10)、G4000PWxl(10)、G3000PWxl(7)(7.8mm×300mm)串聯(lián);保護(hù)柱TSKPWxlGuardcolumn;Agilent1260示差折光檢測(cè)器;流動(dòng)相為純化水;體積流量0.4mL/min;進(jìn)樣量30μL;柱溫30℃;檢測(cè)器溫度35℃;環(huán)境溫度25℃。

稱取葡聚糖對(duì)照品、莼菜多糖各組分樣品（BSP1、BSP2、BSP3），分別用純水溶解并配制成2mg/mL的溶液，過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，將圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入GPC軟件，建立分子量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到分子量對(duì)數(shù)logMW與洗脫體積VR的線性回歸方程logMW=10.513－0.2377VＲ(r=0.9962)，

第13頁，課件共15頁，創(chuàng)作于2023年2月將莼菜多糖各組分導(dǎo)入GPC軟件，調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出莼菜多糖各組分的Mw、Mn和D等，結(jié)果見表1，莼菜多糖的分子量分布為(1.0507～1.